史媛慧，吳章麗，彭娜娜，肖 杰，徐晶晶，竇 璠，曹玉涵

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 a.研究生學(xué)院；b.麻醉學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 腎臟內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

IgA腎病(immunoglobulin A nephropathy，IgAN)是全球范圍內(nèi)最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，約占中國(guó)人群原發(fā)性腎小球疾病的45%[1]。約20%～40%IgAN患者會(huì)出現(xiàn)腎功能減退，并在20～30年內(nèi)發(fā)展為終末期腎臟病[2]。腎臟纖維化幾乎是所有慢性腎臟病進(jìn)展至終末期腎病的主要病理改變。目前，腎臟纖維化的診斷主要基于腎穿刺活檢病理[3]。然而，腎穿刺活檢是一種創(chuàng)傷性操作，可能出現(xiàn)出血、感染等嚴(yán)重并發(fā)癥，更無法實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)了解腎臟纖維化進(jìn)程。研究證實(shí)尿液外泌體攜帶著腎臟固有細(xì)胞來源的生物學(xué)信息，如蛋白質(zhì)、核酸等多種信號(hào)分子[4]。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA(circular RNAs，circRNAs)在外泌體中富集且穩(wěn)定，尿液中circRNAs可能作為腎臟纖維化的潛在生物標(biāo)志物[5]。

本研究通過檢測(cè)IgAN患者尿液外泌體hsa_circ_0008925表達(dá)量與健康對(duì)照的表達(dá)差異，并進(jìn)一步分析尿液外泌體hsa_circ_0008925與腎臟纖維化的相關(guān)性，探討尿液外泌體hsa_circ_0008925表達(dá)量對(duì)IgAN腎臟纖維化的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018～2019年于弋磯山醫(yī)院腎內(nèi)科腎穿刺活檢確診的IgAN患者30例和34例健康對(duì)照者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<18歲或年齡>80歲；②合并繼發(fā)性腎臟疾病，如狼瘡性腎炎、乙肝相關(guān)性腎炎等；③泌尿系統(tǒng)急、慢性感染；④存在嚴(yán)重的心血管疾病、惡性腫瘤、肝功能異常等；⑤臨床病例資料不全的患者。本研究經(jīng)弋磯山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選患者均簽署知情同意書。

1.2 尿標(biāo)本收集及其外泌體提取 腎穿刺活檢前一天收集晨尿約100 mL。晨尿樣本經(jīng)4℃、3 000 g離心30 min后，收集上清液，經(jīng)4℃、13 500 g離心30 min，再次收集上清液，經(jīng)4℃、100 000 g超速離心70 min，棄上清，收集沉淀即為尿液外泌體，重懸于100 μL PBS緩沖液。

1.3 尿液外泌體RNA提取 使用Trizol-LS試劑(Ambion)，按照生產(chǎn)商提供的使用說明書提取尿液外泌體總RNA。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit，TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Real Time PCR試劑盒(TB Green Premix Ex Taq，TaKaRa)進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，檢測(cè)hsa_circ_0008925的表達(dá)情況，U6作為內(nèi)參。設(shè)計(jì)引物如下，hsa_circ_0008925正向引物：5′-TTATGGCTGTCCTTGGGAGTTT-3′；反向引物：5′-GGTATTCTCGGTCTGTTTTGGA-3′。U6正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。RT-qPCR反應(yīng)程序：反轉(zhuǎn)錄(37℃，15 min；85℃，5 s)，熱啟動(dòng)(95℃，10 min)，40個(gè)PCR循環(huán)(95℃，10 s；60℃，1 min)。

1.5 腎臟纖維化檢測(cè) 腎穿刺活檢樣本固定于10%中性福爾馬林24 h，常規(guī)脫水、包埋、切片(厚度3 μm)、脫蠟、染色、脫水、封片、鏡檢。Masson染色評(píng)估腎小管間質(zhì)纖維化。纖維化分級(jí)：①0級(jí)，無纖維化；②1級(jí)，輕度纖維化，纖維化面積0～25%；③2級(jí)，中度纖維化，纖維化面積26%～50%；④3級(jí)，重度纖維化，纖維化面積>50%。

2 結(jié)果

2.1 IgAN患者與健康對(duì)照者的基線臨床和病理資料分析 IgAN組和對(duì)照組在年齡、性別和收縮壓上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IgAN組中舒張壓、血肌酐、血尿素氮、胱抑素C均高于對(duì)照組(P<0.001)，而腎小球?yàn)V過率(eGFR)低于對(duì)照組(P<0.001)。與對(duì)照組相比，尿液外泌體hsa_circ_0008925相對(duì)表達(dá)量在IgAN組中上調(diào)(P<0.001)，詳見表1。

2.2 不同纖維化程度IgAN患者基線臨床和病理資料分析 根據(jù)腎臟纖維化程度將IgAN患者分為2組：無-輕度纖維化組(纖維化面積≤25%)(n=8)；中-重度纖維化組(纖維化面積>25%)(n=22)。兩組間年齡、性別、收縮壓、舒張壓、血肌酐、血尿素氮、胱抑素C、eGFR、24 h尿蛋白差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與無-輕度纖維化組相比，尿液外泌體hsa_circ_0008925相對(duì)表達(dá)量在中-重度纖維化IgAN組上調(diào),詳見2。

2.3 尿液外泌體hsa_circ_0008925表達(dá)量與臨床病理指標(biāo)相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析提示，尿液外泌體hsa_circ_0008925表達(dá)水平與血肌酐(rs=0.376，P=0.002)、胱抑素C(rs=0.491，P<0.001)均呈正相關(guān)；與eGFR(rs=-0.334，P=0.007)呈負(fù)相關(guān)。其他詳見表3。

表1 IgAN患者與健康者的基線臨床和病理資料對(duì)比

表2 不同纖維化程度IgAN患者基線臨床和病理資料對(duì)比

表3 尿液外泌體hsa_circ_0008925與血肌酐、血尿素氮、胱抑素C、eGFR、24 h尿蛋白相關(guān)性分析

2.4 尿液外泌體hsa_circ_0008925對(duì)IgAN腎臟纖維化的診斷價(jià)值 ROC曲線分析提示尿液外泌體hsa_circ_0008925可以區(qū)分中-重度纖維化和無-輕度纖維化的IgAN患者(AUC=0.778，95%CI：0.610～0.947，P=0.022)，當(dāng)尿液外泌體hsa_circ_0008925相對(duì)表達(dá)量為0.089時(shí)可區(qū)分無-輕度纖維化和中-重度纖維化的IgAN患者，靈敏度為72.7%，特異度為87.5%(圖1)。而eGFR(AUC=0.372，95%CI：0.174～0.570，P=0.291)、血肌酐(AUC=0.588，95%CI：0.380～0.797，P=0.467)、胱抑素C(AUC=0.685，95%CI：0.492～0.877，P=0.127)對(duì)中-重度纖維化和無-輕度纖維化的IgAN患者無診斷價(jià)值。

圖1 ROC曲線分析尿液外泌體hsa_circ_000892、eGFR、血肌酐及胱抑素C對(duì)不同纖維化程度IgAN患者的診斷價(jià)值

3 討論

早期、無創(chuàng)性診斷腎臟纖維化，是臨床上亟待解決的科學(xué)問題。迄今尚無可靠的可診斷腎臟纖維化的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物[6]。尿液中蘊(yùn)含豐富的生物學(xué)信息，尿液中有來自腎臟的脫落細(xì)胞。尿液離心后獲得的尿沉渣細(xì)胞可作為反映腎臟病理生理改變的信息來源[7]。近年來，以實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(real time polymerase chain reaction，RT-PCR)為基礎(chǔ)的尿液非編碼RNA生物標(biāo)志物檢測(cè)成為研究熱點(diǎn)。Li等[8]首次用RT-PCR方法檢測(cè)尿沉渣細(xì)胞中穿孔素及顆粒酶B的mRNA，可作為診斷異體腎移植急性排斥反應(yīng)的生物標(biāo)志物。外泌體是細(xì)胞來源的納米級(jí)囊泡，可將攜帶的非編碼RNA傳遞至細(xì)胞外，作為細(xì)胞間信息交換的重要工具。Feng等[9]發(fā)現(xiàn)尿液外泌體攜帶的CCL2 mRNA可作為評(píng)估IgAN患者腎臟損害的潛在生物標(biāo)志物。

circRNAs是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，不受RNA外切酶影響，能夠在細(xì)胞及體液內(nèi)穩(wěn)定存在，不易降解。最新研究表明，circRNAs在外泌體中富集且穩(wěn)定，可以在尿液中檢測(cè)到[10]。Luan等[11]在IgAN患者的尿液外泌體中發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)的circRNAs，提示外泌體中circRNAs在IgAN的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可作為IgAN分子病因?qū)W和非侵入性生物標(biāo)志物。Luan等[12]通過對(duì)比IgAN患者和健康對(duì)照者circRNAs表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在IgAN患者中發(fā)現(xiàn)了476個(gè)表達(dá)差異circRNAs，但并未進(jìn)一步分析具有差異性的circRNAs是否可作為診斷IgAN的非侵入性生物標(biāo)志物。

本研究基于RT-PCR檢測(cè)方法來尋找IgAN患者尿液腎臟纖維化的生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)IgAN患者尿液外泌體hsa_circ_0008925表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組。進(jìn)一步比較IgAN患者不同纖維化程度尿液外泌體hsa_circ_0008925表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)尿液外泌體hsa_circ_0008925表達(dá)水平與腎臟纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。此外，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)尿液外泌體hsa_circ_0008925表達(dá)水平與血肌酐、胱抑素C呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)。ROC曲線提示尿液外泌體hsa_circ_0008925表達(dá)量可區(qū)分不同纖維化程度的IgAN患者，且AUC優(yōu)于eGFR、血肌酐以及胱抑素C等傳統(tǒng)臨床生化指標(biāo)。hsa_circ_0008925的染色體定位位于chr6:108222573-108246136，其基因名稱為SEC63。SEC63編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中一種常駐蛋白，SEC63失活后導(dǎo)致多囊蛋白1介導(dǎo)的多囊腎病的發(fā)生[13]。既往有研究報(bào)道，腎小管內(nèi)SEC63失活后導(dǎo)致蛋白穩(wěn)態(tài)失調(diào)，激活I(lǐng)re1-α/Xbp1通路，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)、肌成纖維細(xì)胞增多和細(xì)胞外膠原沉積，進(jìn)而發(fā)展為腎間質(zhì)纖維化[14]。

本研究通過對(duì)尿液外泌體中circRNAs檢測(cè)，初步發(fā)現(xiàn)尿液外泌體hsa_circ_0008925可作為診斷IgAN患者腎臟纖維化的可靠、無創(chuàng)性生物標(biāo)志物。本研究的局限性在于樣本量小，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證，并且hsa_circ_0008925在IgAN和腎臟纖維化中的分子生物學(xué)機(jī)制需進(jìn)一步研究。綜上所述，尿液外泌體來源的hsa_circ_0008925可能成為診斷IgAN腎臟纖維化的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物，為IgAN腎臟纖維化的診療提供新的思路。