種一然，李錦成，陶維

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.外科學(xué)；2.乳腺外科，遼寧 錦州 121000）

乳腺癌仍然是世界范圍內(nèi)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。在美國(guó)，2012-2016 年乳腺癌的年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為每10 萬(wàn)女性中有126.8 例；2013-2017 年乳腺癌年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率為每10 萬(wàn)女性中20.3 人［1］。與美國(guó)相比，中國(guó)乳腺癌的發(fā)病率相對(duì)較低，其年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率約為29/10 萬(wàn)名女性。2011 年，中國(guó)女性因乳腺癌導(dǎo)致的年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率為每10 萬(wàn)人6.6人［2］。雖然中國(guó)乳腺癌發(fā)病率較低，但預(yù)計(jì)2021年35～69 歲女性中乳腺癌年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率將提高至每10 萬(wàn)人85 人［3］。隨著乳腺癌發(fā)病率的增加，由乳腺癌引起的年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率也可能會(huì)出現(xiàn)相同的趨勢(shì)［4］。為了更有效地預(yù)防和治療乳腺癌，尋找新的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和治療代謝物是非常有必要的。鳥(niǎo)氨酸是一種非必需氨基酸；它參與許多代謝途徑［5］。體內(nèi)外數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，鳥(niǎo)氨酸及其相關(guān)代謝產(chǎn)物（即氨和聚乙烯甲胺）在癌細(xì)胞活動(dòng)和腫瘤發(fā)生中起作用［5-8］。然而，目前還不清楚鳥(niǎo)氨酸是否與人類乳腺癌的發(fā)生有關(guān)?？紤]到乳腺癌的嚴(yán)重后果，了解這種關(guān)系可能有助于改善目前的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估并制定新的治療策略。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了鳥(niǎo)氨酸水平與女性乳腺癌之間的關(guān)系。

1 資料與對(duì)象

1.1 研究設(shè)定和研究對(duì)象

本研究的所有參與者均來(lái)自于2017 至2018年間于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院患者，共計(jì)407 例。本研究給參與者根據(jù)以下條件分成了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的病例：①女性；②有效的血液鳥(niǎo)氨酸分析；③明確病理診斷為乳腺癌或非乳腺癌；④有完整真實(shí)有效的因變量數(shù)據(jù)（如年齡、體重、身高、月經(jīng)初潮年齡、高血壓病史、Ⅱ型糖尿病史、既往癌癥史、吸煙史、飲酒史、癌癥家族史和絕經(jīng)狀態(tài)）。該研究得到了錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。保證了本研究所有參與者的知情權(quán)，并取得了參與者的書(shū)面知情同意。

1.2 病例和控制的評(píng)估

本研究根據(jù)病理科提供的術(shù)后病理檢查確定所有女性患者為乳腺癌病例或者是乳腺良性腫瘤病例。乳腺癌診斷的分期是由美國(guó)腫瘤聯(lián)合委員會(huì)制定的腫瘤轉(zhuǎn)移（TNM）分期法［9］。乳腺癌腫瘤組織學(xué)分級(jí)根據(jù)中國(guó)最新乳腺癌指南進(jìn)行分級(jí)［10］。乳腺癌的分子分型包括：HER-2 擴(kuò)增型、Luminal A、Luminal B 及三陰型［10］。同時(shí)這些病例也通過(guò)既定公認(rèn)的方法進(jìn)行病理檢查、臨床檢查、病史詢問(wèn)和其他檢查（即血液常規(guī)及傳染病檢查）［11］。在確定病例組和對(duì)照組之后，分別按年齡將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行匹配（±1 年），比例為1∶1。

1.3 因變量的確定

這項(xiàng)研究的因變量包括人口統(tǒng)計(jì)學(xué)方面因素［身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）］、生活方式方面因素（吸煙和飲酒情況）、既往史（月經(jīng)初潮年齡、高血壓史、是否為絕經(jīng)狀態(tài)、Ⅱ型糖尿病史，自身既往腫瘤史和家族癌癥史）。BMI 中身高體重的測(cè)定方法：參與者穿著輕便的衣物光著腳站在電子秤上測(cè)量體重（精確到0.1 kg）。測(cè)量身高利用的是壁掛式視距儀（精確到0.1 cm）。BMI 的計(jì)算公式為：體重（kg）/高度的平方（m2）。按照最新指南公認(rèn)的高血壓定義為收縮壓≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）或舒張壓≥90 mmHg。根據(jù)公認(rèn)的方法評(píng)估Ⅱ型糖尿病的診斷，即美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)更新的糖尿病患者醫(yī)療標(biāo)準(zhǔn)［12］。從臨床病歷記錄中提取月經(jīng)初潮年齡、既往癌癥史、吸煙史、飲酒史、癌癥家族史和是否處于絕經(jīng)狀態(tài)。

1.4 血液收集及處理

在患者進(jìn)行任何臨床操作及治療前，用真空吸塵管收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的空腹血樣（空腹時(shí)間＞8 h）。利用干燥的血液濾紙，從收集的空腹血液樣本中提取干燥的血液斑點(diǎn)樣本。全部干燥的血斑樣本在-80℃保留，直到檢測(cè)完成。

1.5 鳥(niǎo)氨酸測(cè)定

鳥(niǎo)氨酸水平的測(cè)量是基于既定的方法［13］。在圓形濾紙片上用打孔器打出直徑為3 mm 的血片，之后將該濾紙片置于96 孔的過(guò)濾板中，每個(gè)孔中加入含內(nèi)標(biāo)的無(wú)水甲醇，再將孔板置于振蕩器內(nèi)，于室溫下振蕩20 min，用孔板離心機(jī)Rotor3以2 000 r/min×2 min 的程序進(jìn)行離心，上層樣品板中的提取液通過(guò)濾膜過(guò)濾并收集于下層樣品板中。離心后將基層樣品板于氮?dú)庵写蹈?。吹干后，每個(gè)孔中都加入衍生劑并密封，之后于65°C 的環(huán)境下孵育15 min 后進(jìn)行衍生化。衍生后的溶液，在氮?dú)庵写蹈?，流?dòng)相復(fù)溶。最后，采用液相色譜：LC20A（Shimadzu）和質(zhì)譜：SCIEX API 3200MD（AB）這二種儀器進(jìn)行檢測(cè)，該平臺(tái)能夠靈敏地檢測(cè)生物分子［14］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究采用SPSS24.0 和R 基礎(chǔ)統(tǒng)計(jì)軟件（版本3.5.3）分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較運(yùn)用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確概率法。對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位間距）［M（P25,P75）］表示，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。采用逐步法進(jìn)行二元Logistic 回歸。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究使用非條件Logistic 回歸分析來(lái)估計(jì)比值比（ORs）和相應(yīng)的95%置信區(qū)間（CIs），以確定鳥(niǎo)氨酸水平增加1 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）與乳腺癌之間的關(guān)系。鳥(niǎo)氨酸水平被轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)模式來(lái)近似正態(tài)分布。最后的模型根據(jù)個(gè)人腫瘤史進(jìn)行了調(diào)整。還考慮了納入最終模型的下列因變量：BMI、高血壓史、Ⅱ型糖尿病史、絕經(jīng)狀態(tài)、吸煙史、月經(jīng)初潮年齡、飲酒史與家族癌癥史。但是，在乳腺癌的雙變量分析中，均未達(dá)到P＜0.10 的標(biāo)準(zhǔn)，因此在最終的調(diào)整中被排除在外。本研究還使用了非條件Logistic 回歸分析模型來(lái)測(cè)試不同水平的鳥(niǎo)氨酸（四分位數(shù)）與乳腺癌之間的關(guān)系。根據(jù)鳥(niǎo)氨酸分布分為四分位數(shù)（百分比25、50 和75）。最后模型又根據(jù)自身腫瘤史進(jìn)行了調(diào)整。

在非條件Logistic 回歸分析模型中，按照腫瘤臨床分期和腫瘤組織學(xué)分級(jí)進(jìn)行亞組分析，以確定鳥(niǎo)氨酸（每增加1 個(gè)SD）和乳腺癌之間的關(guān)系是否隨臨床分期和腫瘤分級(jí)而改變。采用多元線性回歸模型檢驗(yàn)病例間臨床分期與腫瘤組織學(xué)分級(jí)的相關(guān)性趨勢(shì)，其中以鳥(niǎo)氨酸的連續(xù)測(cè)量為自變量，臨床分期與腫瘤組織學(xué)分級(jí)為因變量。為了確定乳腺癌的分子亞型是否影響這種關(guān)聯(lián)，進(jìn)行了非條件多變量Logistic 回歸分析，以估計(jì)鳥(niǎo)氨酸水平（每增加1 個(gè)SD）與乳腺癌分子亞型之間的關(guān)聯(lián)。用非條件Logistic 回歸分析模型中病例間的相互作用項(xiàng)［分子亞型*鳥(niǎo)氨酸水平（每增加1個(gè)SD）］來(lái)測(cè)試分子亞型與鳥(niǎo)氨酸水平之間的相互作用P。

2 結(jié)果

這項(xiàng)研究包括407 例乳腺癌病例和407 例乳腺良性腫瘤病例，共814 例病例進(jìn)行了對(duì)比。對(duì)照組大多數(shù)（95.0%）患者為良性乳腺腫塊，其余為乳腺炎患者（3.1%），副乳腺良性腫塊（0.7%），乳腺增生（0.5%），腋窩良性腫塊（0.3%），胸壁良性腫塊（0.3%）或乳腺脂肪瘤（0.1%）。

實(shí)驗(yàn)組平均年齡為（48.3±7.6）歲，對(duì)照組平均年齡為（48.4±7.7）歲。實(shí)驗(yàn)組個(gè)人腫瘤史的患者比例高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組年齡、BMI、高血壓史、Ⅱ型糖尿病史、絕經(jīng)狀態(tài)、吸煙史、月經(jīng)初潮年齡、飲酒史與家族癌癥史等與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。鳥(niǎo)氨酸四分位數(shù)與BMI 呈負(fù)相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)研究的其他特征（年齡、初潮年齡、高血壓史、Ⅱ型糖尿病史、癌癥病史、吸煙史、飲酒史、癌癥家族史和絕經(jīng)狀態(tài)）與鳥(niǎo)氨酸水平無(wú)相關(guān)性。

表1 乳腺癌病例和乳腺良性腫瘤病例對(duì)照的特點(diǎn)

鳥(niǎo)氨酸水平每增加一個(gè)SD，乳腺癌的發(fā)病率就降低一個(gè)比率（=0.76,95%CI：0.65～0.89）。見(jiàn)表2。在調(diào)整絕經(jīng)后狀態(tài)后，顯著的負(fù)相關(guān)仍然存在（=0.76,95%CI：0.65～0.89），隨著每SD鳥(niǎo)氨酸水平的增加，乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)降低27%。當(dāng)鳥(niǎo)氨酸水平被劃分為四分位數(shù)時(shí)，與鳥(niǎo)氨酸水平低四分位數(shù)的女性相比，高鳥(niǎo)氨酸水平四分位數(shù)的女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)也更低（調(diào)整后=0.76,95%CI：0.51～1.13）。鳥(niǎo)氨酸水平與乳腺癌之間的關(guān)系和腫瘤臨床分期及腫瘤組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表3、表4。乳腺癌分子亞型間無(wú)相互作用（P=0.93），見(jiàn)表5。

表2 鳥(niǎo)氨酸與乳腺癌相關(guān)性的多變量Logistic 回歸

表3 鳥(niǎo)氨酸水平與腫瘤臨床分期關(guān)系

表4 鳥(niǎo)氨酸水平與腫瘤組織學(xué)分級(jí)關(guān)系

表5 鳥(niǎo)氨酸水平與腫瘤分子分型關(guān)系

3 結(jié)論

鳥(niǎo)氨酸程度越高，女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)就越低。鳥(niǎo)氨酸含量高是乳腺癌的潛在保護(hù)因素。通過(guò)本研究可以發(fā)現(xiàn)，鳥(niǎo)氨酸水平與女性乳腺癌之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這可能會(huì)對(duì)乳腺癌評(píng)估和治療方法產(chǎn)生重大的公共衛(wèi)生影響。未來(lái)的研究將證實(shí)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

在這項(xiàng)年齡匹配的女性病例對(duì)照研究中，觀察到鳥(niǎo)氨酸水平與乳腺癌之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈顯著的負(fù)相關(guān)。這種關(guān)聯(lián)不隨臨床分期和腫瘤分級(jí)而改變，也不受分子亞型的影響?？紤]到這是第一次人類研究，表明鳥(niǎo)氨酸水平與乳腺癌之間的潛在保護(hù)關(guān)系，未來(lái)的流行病學(xué)研究將證實(shí)這個(gè)實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果。

鳥(niǎo)氨酸與乳腺癌之間關(guān)系的潛在機(jī)制仍有爭(zhēng)議。一方面，鳥(niǎo)氨酸水平升高可以通過(guò)尿素循環(huán)減少氨的生成及其相關(guān)的氧化應(yīng)激反應(yīng)［15-16］，從而起到保護(hù)作用。因?yàn)檩^低的氧化應(yīng)激水平與有較低的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)［17］。另一方面，鳥(niǎo)氨酸是促進(jìn)癌癥進(jìn)展的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶（ODC）生產(chǎn)多胺的底物［5，7，18-19］。雖然鳥(niǎo)氨酸參與腫瘤發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制是相互矛盾的，但根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)，前者可能是主要的作用機(jī)制。

本研究具有一定的臨床和公共衛(wèi)生意義。目前，左旋鳥(niǎo)氨酸及其與左旋天冬氨酸的混合物是降低急性肝功能衰竭和肝性腦病患者氨水平相對(duì)安全有效的藥物［15-16，20-21］。本研究表明鳥(niǎo)氨酸對(duì)乳腺癌患者的治療可能有額外的療效。此外，如果此發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)前瞻性研究得到重復(fù)，那么鳥(niǎo)氨酸水平可能成為未來(lái)預(yù)測(cè)乳腺癌事件的一個(gè)獨(dú)立因素。乳腺癌仍然是女性的一個(gè)主要公共衛(wèi)生問(wèn)題。然而，只有少數(shù)乳腺癌的危險(xiǎn)因素可以有效地預(yù)防和并以此治療乳腺癌。此研究結(jié)果對(duì)于乳腺癌的治療和預(yù)測(cè)提供了一個(gè)潛在的新目標(biāo)。

在解釋此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果之前，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到幾個(gè)局限性。首先，由于這是一項(xiàng)病例對(duì)照研究，無(wú)法對(duì)鳥(niǎo)氨酸水平與乳腺癌發(fā)病率之間的關(guān)系做出因果推斷。其次，一些乳腺癌的危險(xiǎn)因素，包括體育活動(dòng)，激素替代療法，己烯雌酚的使用，是不控制的。第三，本研究的大多數(shù)對(duì)照組（95%）為良性乳腺腫塊。使用健康的對(duì)照組是否會(huì)產(chǎn)生相似的結(jié)果還不清楚。最后，因?yàn)檫@項(xiàng)研究是基于醫(yī)院的數(shù)據(jù)進(jìn)行的，它應(yīng)該被謹(jǐn)慎的看待，因?yàn)榇藢?shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)可能不能推廣到一般人群。

總之，高水平的鳥(niǎo)氨酸是乳腺癌的一個(gè)潛在的保護(hù)因素。人們對(duì)鳥(niǎo)氨酸水平與女性乳腺癌之間關(guān)系的認(rèn)識(shí)得到了拓展。