劉芳芳 李琳榮 王 平 張 耀 師新宇 李 娟 張 贊 陶功定 郭曉峰 李俊蓮※

隨著人們生活方式的改變，肥胖成為了全球日益嚴重的問題。根據WHO統(tǒng)計2015 年全球成人已有23億達到超重，7億人口達到了肥胖標準[1]。中醫(yī)學認為肥胖形成的原因主要與過食肥甘厚味，內傷脾胃，濕從內生有關?！端貑枴て娌≌摗氛f：“必數食甘美而肥也”?！端貑枴ねㄔu虛實論》指出：“肥貴人，則膏粱之疾也”。飲食過量是導致肥胖的重要因素。這與現代醫(yī)學認識一致，能量攝入過多，大于消耗，必然造成脂肪在體內堆積過多，導致肥胖的發(fā)生。單純性肥胖病(Simple obesity)是指臨床上僅表現為肥胖，無明顯神經、內分泌系統(tǒng)疾病，是由于機體攝入的熱量超過了消耗的熱量，造成內臟和皮下脂肪蓄積而體質量超常，可伴有脂肪、糖代謝調節(jié)過程障礙。本研究通過比較正常及脾虛濕阻型大鼠脾組織蛋白質譜，篩選和鑒定與單純性肥胖脾虛濕阻證有關的疾病特異性蛋白，探尋單純性肥胖病的生物標志物，為其防治奠定生物學基礎。

1 實驗動物

1.1 種類 來源種類：雄性Spargue-Dawley(SD),成年健康大鼠40只,SPF級,體質量(200±20)g。來源：中國維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號SCXK(京)2016-0006。

1.2 試劑 耗材 儀器試劑：尿素 Urea (ACROSS)、蛋白酶抑制劑(Roche)、碳酸氫銨(SIGMA)、二硫蘇糖 醇 Dithiothreito(l PlusOne)、碘乙酰胺 Iodoacetamide(Sigma)、胰酶 Trypsin (Promega V5280)、 FA 甲酸(Sigma)、SDS-PAGE 相關試劑、胰蛋白酶(trypsin，測序級)為Promega 公司(美國) 產品，HLB脫鹽柱為Waters公司產品。其他試劑如乙腈(Acetonitrile，ACN)、二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)、碘代乙酰胺(Iodoacetamide，IAA)、碳酸氫銨(NH4HCO3 )等均購于Sigma公司(美國)等。

耗材：30KD FASP 管(Amicon UItra)、96 孔板(COSTAR)、Milli-Q water、Non-powder gloves、Face mask、Hat、10 μl and 200 μl tips(Eppendorf)、0.2 ml and 1.5 ml EP tube(Eppendorf)、 50 ml EP 、15 ml EP(Corning)、手術刀片、眼科手術剪。

儀器：超聲破碎儀(SCIENTZ)、酶標儀 MULTISKAN MK3(Thermo)、真空干燥儀、水浴鍋、2 μl、10 μl、100 μl、200 μl及1 ml移液器、廢液缸、制冰和裝冰設備、低溫高速離心機、掌上離心機、渦旋儀、高速離心機、掌上離心機、掃膠儀。

2 實驗方法

2.1 造模本實驗根據單純性肥胖模型制作文獻，造成脾虛濕阻型單純性肥胖模型大鼠[2]。適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組10只(普通飼料喂養(yǎng))與單純性肥胖模型組30只(高脂飼料喂養(yǎng))。對照組：本組為同期飼養(yǎng)，自由進食飲水。脾虛濕阻組：高脂飼料喂養(yǎng)8周后，大鼠體質量超過普通飼料喂養(yǎng)大鼠體質量20%作為實驗性營養(yǎng)肥胖大鼠，設為脾虛濕阻組大鼠組。

2.2 取材將各組大鼠第64天備毛，用75%酒精消毒皮膚，10%水合氯醛麻醉后，處死，暴露胸腔，摘除脾臟。

2.3 樣本蛋白提?、俚鞍滋崛。禾崛◇w系：600 μl； 提取試劑：8M UA+蛋白酶抑制劑； 提取方法：手術刀片切割綠豆粒大小組織塊，天平快速稱量后，加入提取試劑，采用手術剪剪碎組織塊后，采用冰上超聲再次破碎后，低溫離心后，取上清轉移；②濃度測定：將樣本上清，稀釋10倍后，取樣本于96孔板中，再加入Bradford染色液， 放置10 min后，采用酶標儀測定蛋白濃度。

2.4 樣本跑膠質控①配制 12%SDS-PAGE。②取 10 μg 樣本加入 SDS、β-巰基乙醇，混勻，放于 95 ℃反應 10 min。③反應結束后，放于離心機中，14 000 g離心5 min，上樣。④電泳設置為：S1：80 V，20 min；S2:120 V，120 min。

2.5 樣品FASP酶切處理：① 各個樣本各取300 μg添加至FASP管中，其加入200 μl 8M Urea，離心替換溶液；②加入終濃度 20 mM DTT，渦旋后，封口膜封口，37 ℃放置 1 h；③加入終濃度 50 mM IAA，渦旋后，避光放置 30 min；④加入 200 μl 8M Urea，離心 10 min 去除；⑤加入 200 μl 50 mM NH4HCO3 水溶液，替換2次；⑥更換新的收集管，加入 200 μl 50 mM NH4HCO3，8 μg胰蛋白酶。封口后，37 ℃過夜；⑦采用 50 mM NH4HCO3 回收肽段，熱干。

2.6 酶解處理①水洗膠塊2次，吸走液體。②膠塊脫色。加脫色液(溶于50 mM NH4HCO3/50%CAN)，100 μl左右(溶液的量視膠塊具體大小而定)室溫脫色至膠塊顏色完全褪去。③膠塊脫水。加100%CAN，讓膠塊變白完全脫水；再用離心濃縮儀揮干10 min。④還原烷基化(SDS一維電泳條帶)：加入50 μl 10 mM DTT溶液(溶于25 mM NH4HCO3)，56 ℃水浴60 min；離心，吸走液體； 加入50 μl 55 mM IAA溶液(溶于25 mM NH4HCO3)，避光反應40 min；吸走液體；加入100 μl水洗膠塊，將反應剩余液體吸走。⑤膠塊脫水，重復步驟3。⑥加入胰酶5～20 μl(具體視膠塊大小而定)，讓膠塊充分吸脹，變透明，冰上放置約20 min，再加3 μl覆蓋液。⑦37 ℃水浴過夜16 h；分析則需要萃取膠內的多肽，萃取2次，冷凍干燥后脫鹽再凍干待做LCMS。

2.7 液相色譜串聯質譜①納升液相為Thermo Scientific Easy-nLC 1000，流動相A為0.1%甲酸水溶液；溶液B為0.1%甲酸乙腈溶液。液相梯度設置為：4 min，8% B相；45 min，30%B相；55 min，90% B相；60 min，90% B相。②質譜儀為Orbitrap Fusion Lumos，碰撞能量為27% HCD，分辨率設置為一級70 000 m/z 200，二級17 500 m/z 200，母離子掃描范圍為300～1800 m/z，子離子掃描范圍起始為m/z 100，數據依賴模式MS/MS，隔離窗口為1.6 Da，動態(tài)排除為20 s；噴霧電壓為2.0 kV，毛細管溫度為275 ℃，S-lens：55%。

2.8 統(tǒng)計學方法質譜結果使用Proteome Discoverer 2.0 數據分析軟件對進行搜庫，酶解位點為精氨酸(R)，賴氨酸(K)，允許有2個漏切位點，允許一側非特異性酶解，固定修飾：半胱氨酸的Carbamidomethylation。可變修飾：Oxidation / +15.995 Da (M)。

3 結果

3.1 樣本電泳膠圖雙向凝膠電泳分析，樣本跑膠質控良好。見圖1。

圖1 樣本膠圖結果

3.2 質譜分析差異蛋白質經過對差異蛋白質進行質譜分析，得到比較滿意的質譜數據，并對這些蛋白質斑點進行數據庫檢索，最終鑒定得到3個蛋白質(見表1)。其中表達上調的有2個，經數據庫檢索，它們是蛋白質二硫化物異構酶A3前體(PDIA3)、60-kDa熱休克蛋白(HSP60，也稱為HSPD1)表達下調的有1個，經鑒定是巨噬細胞中穹窿主體蛋白(Major Vault Protein，MVP)。

表1 脾虛濕阻組與對照組對比差異蛋白的表達情況 (個)

4 討論

蛋白質組學技術現已廣泛應用到生命科學的各個領域[3]。因生物的蛋白質在不同環(huán)境下變化極為敏感，細胞內、外環(huán)境的改變及細胞內細胞器的活動都會影響氨基酸的序列、基因的表達以及蛋白質的翻譯后加工[4]，所以差異蛋白組學被用于疾病的早期診斷、疾病過程的監(jiān)測、藥物療效的評價以及環(huán)境因素等對疾病的影響等方面[5]。本研究中，得到與脾虛濕阻證密切相關的生物因子3個。

4.1 巨噬細胞中穹窿主體蛋白巨噬細胞中穹窿主體蛋白(Major Vault Protein，MVP)具有拮抗大鼠高脂飲食引起的肥胖、全身性代謝紊亂和動脈粥樣硬化的作用。其機制系通過MVP結合TRAF6，減少其泛素化，從而抑制IKK-NFkB信號通路介導的炎癥反應而實現[6]。其作用機制如圖2所示。

圖2 主要穹窿蛋白通過抑制IKK-NF-κB信號介導的炎癥反應抑制肥胖

由此可知，通過MVP結合TRAF6，從而抑制IKK-NFkB信號通路介導的炎癥反應，MVP是巨噬細胞炎癥反應的負性內控調節(jié)器，可選擇性抑制由TRAF6介導的代謝性炎癥反應，這為防治單純性肥胖及冠心病等提供了新的靶點和理論依據。

4.2 蛋白質二硫化物異構酶A3前體(PDIA3)蛋 白 質 二 硫 化 物 異 構 酶A3 (Protein Disulfide Isomerase A3，PDIA3)[7]又名ERP57、 ER60、 GRP58和 1，25D3-MARRS，廣泛存在于真核生物中，與鈣網蛋白(Calreticulin，CRT)、鈣連接蛋白共同構成內質網分子伴侶復合物，介導蛋白質的折疊與修飾[8]PDIA3與多種自身免疫性疾病密切相關[9]。

PDIA3水平上調出現于多種疾病中，在胎膜早破、腸易激綜合征、肝細胞性肝癌中均有報道。既往研究表明 PDIA3Ab在多種自身免疫性疾病中呈高表達[10-12]。但目前尚無PDIA3與單純性肥胖的相關文獻報道，本研究首次證實PDIA3Ab在單純性肥胖中呈現高表達。

4.3 60-kDa熱休克蛋白(HSP60，也稱為HSPD1)熱休克蛋白60(HSP60)是一種重要的伴侶蛋白，它調節(jié)線粒體蛋白質的穩(wěn)態(tài)，維持線粒體功能。線粒體糖酵解和hsp60kd抑制線粒體活性。HSP60沉默通過磷酸戊糖途徑影響核糖核苷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的合成，抑制細胞增殖。HSP60 KD抑制5'腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)，后者抑制關鍵酶6-磷酸果糖激酶/果糖2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)，通過抑制丙二酰輔酶A影響脂肪酸的代謝。研究數據表明，減少HSP60表達改變了單純性肥胖的代謝重編程，抑制腫瘤進展并減少線粒體依賴性生物合成，這表明HSP60是單純性肥胖治療的潛在治療靶點[13]。

本研究采用酶切、雙向凝膠電泳結合質譜分析對脾虛濕阻型單純性肥胖大鼠和正常對照組進行了差異蛋白組學研究。實驗結果顯示：2組中的蛋白質表達有差異。經鑒定3個與脾虛濕阻型單純性肥胖大鼠密切相關的蛋白質，可為探索單純性肥胖脾虛濕阻證的發(fā)病機制提供分子生物學依據，其中巨噬細胞中穹窿主體蛋白(Major Vault Protein，MVP)已在不同物種被多次證實為肥胖癥的防治靶點，亦有可能成為脾虛濕阻型單純性肥胖的分子診斷標志物。