孫晶瑩，李 研，黃曉燕，靳占奎，徐翠香，常 樂，王建華

(1.陜西省人民醫(yī)院感染與免疫疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710068;2.陜西省細(xì)胞免疫工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710068； 3.陜西省人民醫(yī)院骨科，陜西 西安 710068；4.陜西省人民醫(yī)院普外二科，陜西 西安 710068)

粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)是一種造血生長因子和免疫蛋白，能夠促進(jìn)多種血液細(xì)胞、尤其是樹突狀細(xì)胞與單核-巨噬細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)宿主體內(nèi)抗原呈遞效應(yīng)[1]。GM-CSF作為不同的細(xì)胞因子發(fā)揮不同的功能：GM-CSF作為造血生長因子，調(diào)節(jié)JAK-STAT、PI3K 等通路，促進(jìn)造血細(xì)胞增殖、分化[2]；作為免疫調(diào)節(jié)因子，GM-CSF不僅可促使中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹狀突細(xì)胞(Dendritic cell，DC)增殖，并且可上調(diào) DC 表面的B7蛋白和主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)分子表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CD4+Th1和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[3]。因此GM-CSF是腫瘤免疫治療和疫苗中常用的細(xì)胞因子[4]，而且GM-CSF因其療效良好、副作用小而被廣泛用于癌癥治療[5]。GM-CSF可促進(jìn)和調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)嗜酸性粒細(xì)胞和成熟中性粒細(xì)胞對腫瘤的抗藥功能[6-8]，Nebiker等[9]研究表明在結(jié)直腸癌中，GM-CSF高表達(dá)患者預(yù)后相對較好。此外，GM-CSF還可作為腫瘤疫苗的佐劑，有效增強(qiáng)腫瘤疫苗的免疫作用[10]。但由于GM-CSF在體內(nèi)適合小劑量使用，且注入體內(nèi)后會很快被分解代謝，所以腫瘤微環(huán)境中的局部有效濃度很難達(dá)到有效激活免疫的作用。而用基因修飾法將GM-CSF基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中制備瘤苗的修飾效率一般都較低，表達(dá)產(chǎn)物在局部通常不能達(dá)到有效的濃度且不能維持較長時(shí)間，抗腫瘤的臨床效果有限。因此需要制備一種免疫原性和抗原性較強(qiáng)，且能持久刺激機(jī)體免疫力的新型瘤苗才可能達(dá)到我們期望的臨床治療效果。

鏈霉親和合素(Streptavidin，SA)是一種從鏈霉菌中分離出來的可溶性同型四聚體蛋白，無糖基化，它能與生物素以極高的親和力結(jié)合[11]。因此在本研究中利用生物素與鏈親和素能夠穩(wěn)定結(jié)合且不可逆的特點(diǎn)，合成鏈親合素連接的人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(SA-hGM-CSF)融合蛋白克服GM-CSF在體內(nèi)會被快速降解的缺點(diǎn)。我們構(gòu)建了SA-hGM-CSF-Pet28重組表達(dá)載體，并在表達(dá)感受態(tài)中高效誘導(dǎo)表達(dá)獲得融合蛋白，經(jīng)His鎳柱純化、復(fù)性后，并利用TF-1細(xì)胞對表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性進(jìn)行了研究。該研究為hGM-CSF表面錨定修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為后續(xù)的臨床實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)貨號為：CD601；預(yù)染Marker貨號為：26616，購于Thermo fisher公司；His鎳柱貨號為：635657，購于大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒貨號為：DP214-02，購于北京天根生物科技有限公司；TF-1細(xì)胞貨號為：CL-0232，購于武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司;CCK-8試劑盒貨號為：C0038，購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;標(biāo)準(zhǔn)品重組人GM-CSF貨號為：MA0603，購于大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SA-hGM-CSF雙功能融合蛋白表達(dá)載體構(gòu)建：在NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢鏈霉親和核素SA和hGM-CSF序列，交由上海生工生物工程股份有限公司合成并插入Pet28表達(dá)載體中。SA和hGM-CSF序列信息如表1，合成鏈霉親和素時(shí)去掉終止密碼子TGA，合成后的基因用雙酶切進(jìn)行鑒定。

表1 鏈霉親和素-人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子序列信息

1.2.2 SA-hGM-CSF融合蛋白的表達(dá)：收到合成SA-hGM-CSF-Pet28菌液后進(jìn)行質(zhì)粒提取，Nanodrop2000檢測濃度和純度合格后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。從超低溫冰箱-80 ℃取50 μl感受態(tài)細(xì)胞，置于冰盒中融化，加入1 μl重組質(zhì)粒，輕輕混勻，冰上靜置30 min。42 ℃熱激45 s，迅速放于冰上置2 min，加入500 μl LB 200 r/min 37 ℃培養(yǎng) 1 h，1500 g離心1 min，棄掉300 μl上清，剩余培養(yǎng)基重懸菌體，涂含卡那霉素抗性的平板，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。

次日從平板中隨機(jī)挑取4個(gè)單克隆于3 ml含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min搖床過夜培養(yǎng)。按照1∶100的比例將過夜培養(yǎng)的菌液接種于新鮮的含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基里，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至菌液OD600約在0.6～0.8之間，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，選擇誘導(dǎo)后表達(dá)的陽性克隆再摸索最佳誘導(dǎo)濃度及時(shí)間，用12% SDS-PAGE鑒定表達(dá)情況。

1.2.3 SA-hGM-CSF融合蛋白的表達(dá)與鑒定:根據(jù)摸索的小搖誘導(dǎo)條件大量誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，表達(dá)完成后12000 r/min 2 min離心收集菌體。超聲破碎儀設(shè)置80 Hz頻率，利用超聲波裂解細(xì)菌，直至溶液變清亮，離心收集蛋白，His鎳柱純化。純化方法：5 ml去離子水清洗鎳柱，10 ml結(jié)合液平衡鎳柱；加入裂解的蛋白，與鎳柱4 ℃結(jié)合1 h；5倍鎳柱體積(5 ml)的清洗液洗脫雜蛋白；5倍體積(5 ml)的洗脫液洗脫目的蛋白；5倍體積(5 ml)的去離子水清洗掉洗脫緩沖液；鎳柱中加入20%的乙醇于4 ℃保存。尿素梯度透析進(jìn)行蛋白復(fù)性，尿素的濃度按照6、4、2、0 mol/L的濃度進(jìn)行透析，每個(gè)濃度于4 ℃透析復(fù)性4～6 h。最后在PBS中繼續(xù)透析復(fù)性12 h。上清經(jīng)過濾除菌，分裝后低溫保存。利用WB鑒定表達(dá)SA-hGM-CSF蛋白，12%SDS-PAGE完成電泳后濕轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉NC膜，一抗選擇His抗體(1∶1000)，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，化學(xué)發(fā)光檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 SA-hGM-CSF融合蛋白的活性測定：人血液白血病細(xì)胞(TF-1)用1640(含2 ng/ml hGM-CSF+10% FBS+1%雙抗)培養(yǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS清洗2遍，制備成細(xì)胞懸液鋪板。細(xì)胞計(jì)數(shù)2.5×104/ml，100 μl/孔鋪板96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，標(biāo)準(zhǔn)品hGM-CSF和表達(dá)蛋白SA-hGM-CSF分別稀釋至1、2、4、8 ng/ml，加入對應(yīng)孔中，培養(yǎng)72 h，每孔加入10 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h檢測OD值為450 nm。

2 結(jié) 果

2.1 SA-hGM-CSF-Pet28表達(dá)載體的構(gòu)建 合成后的基因用雙酶切(NcoI+XhoI)進(jìn)行酶切鑒定，酶切預(yù)期分子量為941 bp和5200 bp，大小均與預(yù)期相符。電泳結(jié)果見圖1。

圖1 質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.2 SA-HGM-CSF融合蛋白表達(dá) 利用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)37 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min， IPTG誘導(dǎo)濃度依次為：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L，在六個(gè)IPTG誘導(dǎo)濃度中，SA-hGM-CSF融合蛋白的誘導(dǎo)效果均明顯，且在濃度之間誘導(dǎo)量沒有顯著差異，IPTG 0.6 mmol/L時(shí)誘導(dǎo)濃度時(shí)蛋白表達(dá)量稍高，故選定0.6 mmol/L作為最佳誘導(dǎo)濃度，見圖2。設(shè)置誘導(dǎo)溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，誘導(dǎo)濃度0.6 mmol/L為條件不變。分別收集誘導(dǎo)時(shí)間為2～6 h的菌液進(jìn)行鑒定。在五個(gè)時(shí)間梯度中，6 h SA-hGM-CSF融合蛋白的誘導(dǎo)效果比較明顯，見圖3。

1:誘導(dǎo)前；2～7：IPTG誘導(dǎo)濃度依次為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L圖2 不同IPTG誘導(dǎo)濃度SA-hGM-CSF融合蛋白的表達(dá)

1:誘導(dǎo)前；2～6：誘導(dǎo)時(shí)間依次為2、3、4、5、6 h圖3 不同誘導(dǎo)時(shí)間SA-hGM-CSF融合蛋白的表達(dá)

2.3 SA-hGM-CSF融合蛋白純化與鑒定 根據(jù)優(yōu)化的誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，大量培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，誘導(dǎo)完成后收集菌體并超聲裂解，低溫高速離心后收集菌體并用His鎳柱純化并透析，SDS-PAGE電泳檢測，并用WB檢測表達(dá)蛋白與His抗體的反應(yīng)。結(jié)果表明，成功純化SA-hGM-CSF融合蛋白，并且WB檢測表達(dá)蛋白與His抗體能夠特異結(jié)合。見圖4。

A：1為誘導(dǎo)前，2為誘導(dǎo)后，3為超聲后菌體沉淀，4為超聲后菌體上清，5為純化透析后蛋白；B：表達(dá)融合蛋白與抗體的反應(yīng)結(jié)果圖4 SA-hGM-CSF融合蛋白的純化與鑒定

2.4 SA-hGM-CSF融合蛋白活性測定 培養(yǎng)TF-1細(xì)胞，用購買hGM-CSF標(biāo)準(zhǔn)品作為對照，表達(dá)的SA-hGM-CSF作為實(shí)驗(yàn)組，通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測表達(dá)SA-hGM-CSF是否具有生物學(xué)活性。結(jié)果表明，在1、2、4、8 ng/ml的濃度值，加入表達(dá)SA-hGM-CSF與標(biāo)準(zhǔn)品hGM-CSF后的TF-1細(xì)胞增殖速率基本一致，證明重組表達(dá)SA-hGM-CSF具有生物學(xué)活性。見圖5。

圖5 SA-hGM-CSF融合蛋白活性測定

3 討 論

21世紀(jì),癌癥將成為全球人類死亡原因之一，也是人們預(yù)期壽命增加最重要的障礙。根據(jù)2018年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)GLOBOCAN的數(shù)據(jù)顯示，胃癌是全球癌癥死亡的第三大主要原因，僅次于肺癌和大腸癌[12-13]。

近年來針對CTLA-4或PD-1通路的免疫檢查點(diǎn)抑制劑在治療實(shí)體瘤方面取得了令人矚目的成功。腫瘤細(xì)胞疫苗是利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力，達(dá)到清除或控制腫瘤的目的[14]。腫瘤細(xì)胞疫苗被認(rèn)為是聯(lián)合各種治療手段治療惡性腫瘤的最佳輔助方法[15-17]。但是對于胃癌患者，由于其腫瘤細(xì)胞表面腫瘤特異性抗原或(和)相關(guān)抗原表達(dá)低下，免疫原性較低，制備的普通胃癌瘤苗抗原性和免疫原性不強(qiáng)，很難刺激機(jī)體有效的免疫反應(yīng)以達(dá)到我們的理想效果[18-19]。因此必須制備一種免疫原性和抗原性較強(qiáng)，且能持久刺激機(jī)體免疫力的新型瘤苗聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑，才能達(dá)到期望的臨床治療效果。為此在本研究中我們致力于制備SA-hGM-CSF融合蛋白，并利用SA的作用原理將SA-hGM-CSF修飾到腫瘤細(xì)胞膜表面，通過增強(qiáng)腫瘤的免疫原性、直接激活免疫活性細(xì)胞和改善腫瘤局部的微環(huán)境等機(jī)制可誘發(fā)機(jī)體的主動抗腫瘤免疫反應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞疫苗治療胃癌患者提供一定的理論研究基礎(chǔ)。

本研究基于本實(shí)驗(yàn)室的原核表達(dá)技術(shù)平臺，利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了SA-hGM-CSF表達(dá)質(zhì)粒。選擇Pet-28表達(dá)載體克隆效率高，操作簡單，表達(dá)量高，通過設(shè)計(jì)6×His標(biāo)簽方便后期使用鎳柱親和層析方法純化，利用克隆的表達(dá)載體獲得高純度的雙功能融合蛋白。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用，本研究通過誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)探索重組蛋白在BL21(DE3)中的表達(dá)，通過IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的研究摸索，找到最適的表達(dá)條件，IPTG誘導(dǎo)濃度0.6 mmol/L和誘導(dǎo)時(shí)間6 h，通過超聲破碎裂解包涵體，在包涵體裂解的過程中，由于超聲時(shí)溫度的提高會影響重組蛋白，因此超聲需要冰浴進(jìn)行，超聲的次數(shù)應(yīng)在允許的范圍內(nèi)越多越好，保證超聲后的液體是透明狀，若超聲不徹底，會導(dǎo)致蛋白量減少，最終利用His鎳柱純化獲得純化的重組蛋白，利用尿素梯度透析進(jìn)行蛋白復(fù)性得到重組蛋白。在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了表達(dá)蛋白的活性，即利用TF-1細(xì)胞對融合蛋白的生物學(xué)活性進(jìn)行了鑒定[20-22]，結(jié)果表明成功表達(dá)了具有生物活性的雙功能融合蛋白，該研究結(jié)果為研制hGM-CSF表面修飾的新型腫瘤細(xì)胞疫苗提供基礎(chǔ)。