詹勝群，葛城，周鈞，周榮杰，劉金梅，顏復(fù)張*

澳優(yōu)乳業(yè)（中國）有限公司（長沙 410200）

嬰幼兒配方奶粉是非母乳喂養(yǎng)嬰幼兒營養(yǎng)的重要來源，銅、鋅元素是人體必需的14種微量元素中的2種[1]。銅參與人體的造血、血紅蛋白合成等過程，鋅參與機體免疫功能、影響維生素C的代謝等，二者與嬰幼兒的生長發(fā)育、第二性征發(fā)育及智力發(fā)育等相關(guān)[2-5]。銅、鋅還是構(gòu)成金屬酶的必需成分，如含鋅的碳酸酐酶、含銅的酪氨酸酶、含二者的超氧化物歧化酶等[6-9]。故準確測定嬰配奶粉中銅鋅含量與奶粉品質(zhì)和嬰幼兒健康至關(guān)重要。

對于奶粉中銅、鋅的檢測，GB 5009.13—2017《食品安全國家標準 食品中銅的測定》中第二法和GB 5009.14—2017《食品安全國家標準 食品中銅的測定》中第一法給出的FAAS法及GB 5009.268—2016中第一法給出的ICP-MS法是我國常用的強制標準方法[10-12]，由于FAAS法常與干法消解聯(lián)用，且具有儀器成本低、稱樣量較多、線性范圍廣等特點，故被國內(nèi)不少乳企、檢測機構(gòu)采用。而在ISO 21424—2018中，檢測方法是微波消解-ICP-MS法[13-14]，ISO方法是國際標準化組織指導(dǎo)和協(xié)調(diào)全球檢測推薦的標準方法[15-16]，除方法原理與FAAS法有本質(zhì)區(qū)別外，該方法要求奶粉樣品復(fù)溶，且消解過程添加甲醇、過氧化氫等，樣品處理方式差異大。對于有奶粉進出口業(yè)務(wù)的乳企而言，這種方法間的差異可能導(dǎo)致同一樣品的測定結(jié)果不一致，從而導(dǎo)致抽檢結(jié)果無法滿足雙邊監(jiān)管要求，故研究這2種方法的差異對雙邊檢測結(jié)果相互合規(guī)合法具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和標準品

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（Thermo Scientific? iCAP Q，賽默飛）；原子吸收光譜儀（配火焰原子化器，附銅、鋅的空心陰極燈，AA240FS，美國瓦里安）；超純水制備裝置（Milli-Q，美國密理博）；電子天平（ME204E，梅特勒托利多）；微波消解儀（ETHOS UP，北京萊伯泰科）；箱式電阻箱（MFLC16/12A，天津市泰斯特）；磁力攪拌器（90-2型，上海滬西儀器）。

甲醇（MS級，上海安譜）；硝酸（MS級，上海安譜）；30%過氧化氫（GR，天津市科密歐）；內(nèi)部質(zhì)控樣（S18，三段，牛奶粉），市售；外部質(zhì)控樣（QC-IP-701，中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心）；奶粉樣品（S1～S17，市售嬰幼兒配方奶粉）；多元素標準溶液（Cu 2.5 mg/L、Zn 10 mg/L，國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；鍺、碲、銅、鋅標準溶液（1 000 mg/L，國家有色金屬及電子材料分析測試中心）。

1.2 試驗方法

1.2.1 比對方案設(shè)計

方法比對分為4個部分，見表1。檢測過程中2名試驗操作者均為實驗室有經(jīng)驗的授權(quán)人員，每名試驗員在相互獨立的情況下分別采用GB標準和ISO標準進行樣品測試。外部質(zhì)控樣測試得到的數(shù)據(jù)組成成組資料，樣品測試得到的數(shù)據(jù)組成成對資料。

表1 比對方案

1.2.2 試驗樣品信息

序號1～17的樣品為市售的不同段數(shù)（1、2和3段）、不同產(chǎn)地（國產(chǎn)、進口）、不同基質(zhì)（牛奶、羊奶）的嬰幼兒配方奶粉；序號18～19為質(zhì)控樣。樣品信息見表2。

表2 樣品基本信息

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 消解條件

微波消解條件：室溫至120 ℃（1 800 W），升溫8 min，恒溫10 min；120 ℃至160 ℃（1 800 W），升溫8 min，恒溫10 min；160 ℃至180 ℃（1 800 W），升溫5 min，恒溫20 min。干灰化條件：固體試樣約2.5 g于坩堝中，1 000 W電爐加熱炭化至無煙，轉(zhuǎn)移至箱式電阻箱中，于550 ℃灰化5 h。

1.3.2 儀器分析條件

ICP-MS條件：等離子功率：1 550 W；冷卻氣流：14 L/min；輔助氣流量：0.8 L/min；霧化氣流量：1.074 L/min；采樣深度：5 mm；重復(fù)次數(shù)：3次；采集模式采用跳峰；霧化室溫度2.7 ℃；氦氣流量4.3 mL/min。FAAS條件：波長213.9 nm，狹縫0.2 nm，空氣13.50 L/min，乙炔2.00 L/min，測量時間5 s，重復(fù)次數(shù)3，測量模式采用積分。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

FAAS信號的采集及定性、定量分析采用Spectr AA（Version：5.1 PRO）軟件，ICP-MS信號的采集及定性、定量分析采用Qtegra（Version：2.7 SR1）軟件，試驗數(shù)據(jù)的圖形繪制和表格制作采用Excel 2019軟件和WPS Office 2021軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法文本比較

2個方法的原理及關(guān)鍵步驟差異見表3。ICP-MS法則采用大樣本復(fù)溶的方式提高取樣的均一性和代表性，理論上ISO方法檢測的結(jié)果應(yīng)具有更好的精密度。定量方式上，F(xiàn)AAS法采用外標法，而ICP-MS法采用內(nèi)標法，且內(nèi)標加標方式為前處理加標。檢出限和定量限上，ICP-MS限值設(shè)定得更低。整體上看，2種方法差異較大。

表3 方法文本比較

2.2 方法性能參數(shù)比較

重復(fù)性試驗是評價隨機誤差大小的方法，由表4可知，對于儀器精密度，F(xiàn)AAS法和ICP-MS法差異并不大，均＜1%，但對于方法精密度，F(xiàn)AAS法相對標準偏差（SRSD）2個指標均大于ICP-MS法，可見ICPMS法方法精密度更好，但2種方法的精密度均符合ISO標準要求（＜5%）和國標要求（＜7.5%），試驗的隨機誤差的控制都在要求范圍內(nèi)。FAAS法和ICPMS法回收率在90%～110%之間，回收率均符合GB/T 27417—2017《化學(xué)分析方法確認和驗證指南》要求。定量限結(jié)果均小于標準規(guī)定值。

表4 方法性能參數(shù)

2.3 質(zhì)控樣檢測比對

由表5可知，檢測結(jié)果均在標準物質(zhì)參考值不確定度范圍內(nèi)且均和特性值接近，表明2種方法正確性良好，無大的系統(tǒng)誤差影響試驗。由表6統(tǒng)計分析結(jié)果知兩組數(shù)據(jù)方差具有同質(zhì)性，可對樣本數(shù)據(jù)進行均數(shù)差數(shù)t檢驗和F檢驗（方差分析）。t檢驗表明2種方法間銅、鋅差異都極顯著，銅鋅ISO方法檢測結(jié)果高于GB方法檢測結(jié)果。銅平均數(shù)差數(shù)置信區(qū)間為4.24～35.89 μg/100 g，置信度為99%；鋅平均數(shù)差數(shù)置信區(qū)間為0.024 1～0.269 mg/100 g，置信度為99%。方差分析見表7，可知同樣具有差異極顯著的結(jié)論。

表5 外部質(zhì)控樣QC-IP-701結(jié)果比對

表6 內(nèi)部質(zhì)控樣檢測結(jié)果的統(tǒng)計分析

表7 內(nèi)部質(zhì)控樣測結(jié)果的方差分析

由于差異顯著性檢驗的性質(zhì)，其結(jié)論只表示所檢驗的兩處理樣本來自同一總體的可能性小于或大于統(tǒng)計上公認的概率水平α（0.05或0.01），并沒有提供兩處理間的差異有多大的信息，故要對差異進行定量分析還需要結(jié)合預(yù)先設(shè)定等效標準的雙向單側(cè)t檢驗（TOST）來完成方法間的等效性評價[17-20]。預(yù)先設(shè)定2個等效標準（Δ為5%和10%）檢驗方法的等效性，由表8可知，銅、鋅在等效標準5%內(nèi)方法均不等效，在10%內(nèi)方法均等效。

表8 不同等效標準下的TOST檢驗結(jié)果

2.4 樣品檢測比對

樣品的檢測結(jié)果及結(jié)果差值見表9。由圖1和圖2可看出：銅所有的點均在95%一致性界限以內(nèi)，界限內(nèi)差值的絕對值最大為36.49 μg/kg（圖中白色點）；鋅有94.1%（16/17）的點在95%一致性界限以內(nèi)，差值的絕對值最大為0.247 2 mg/kg（圖中白色點）。若銅、鋅分別以所有測定結(jié)果的算數(shù)均值的±10%（-39.77，+39.77）μg/kg、（-0.039 13，+0.039 13）μg/kg作為應(yīng)用可接受的界限，這種相差幅度在應(yīng)用上均可接受，因此可以認為2種方法測量的結(jié)果具有較好的一致性，并且可以互相代替使用[21-26]，且該界限與國標方法中關(guān)于銅、鋅精密度的規(guī)定“在重復(fù)性條件下獲得的2次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%”相符合。但銅、鋅分別以所有測定結(jié)果的均值的±5%為應(yīng)用可接受界限時，則2種方法相差幅度在應(yīng)用上均不可接受。配對t檢驗結(jié)果見表10，可知銅差異極顯著、鋅差異顯著，且銅、鋅ISO方法檢測結(jié)果均高于GB方法檢測結(jié)果。可見對于2種方法間系統(tǒng)誤差的判定，樣品與質(zhì)控樣的檢測比對結(jié)果基本一致。

圖1 銅Bland-Altman圖

圖2 鋅Bland-Altman圖

表9 樣品檢測結(jié)果

接表9

表10 配對t檢驗結(jié)果

以國標標準FAAS法為參考方法，以ISO標準ICPMS法為候選方法。銅、鋅測試結(jié)果的回歸分析分別見圖3和圖4。線1為以參考方法測定結(jié)果為X值、以候選方法為Y值所擬合的回歸曲線，線2代表候選方法值=參考方法值，方程為y=x；線3和線4代表回歸曲線95%的置信區(qū)間估計。對于銅，線1在線2上，線2未完全落在95%置信區(qū)間范圍內(nèi)，表明代表實際測試結(jié)果的回歸曲線在所分析濃度范圍內(nèi)與標志著2種方法結(jié)果一致的參考曲線Y=X在統(tǒng)計學(xué)上不一致，即隨著X值減小，線2與線1的偏差逐步增大，當X小于400時，線2已不能落在置信區(qū)間內(nèi)，提示隨著樣品中銅含量降低，2種方法的測定結(jié)果差異逐步增大。對于鋅，回歸曲線與參考曲線有同樣的趨勢，提示隨著樣品中鋅含量降低，2種方法的測定結(jié)果差異逐步增大，但鋅的線2在分析濃度范圍內(nèi)與線4基本貼合，差異幅度變化很小。數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表11。銅、鋅回歸系數(shù)與0都差異極顯著，這代表2種方法的測定結(jié)果的線性關(guān)系很密切。此外，銅、鋅回歸系數(shù)與1之間假設(shè)檢驗均不顯著、截距與0之間假設(shè)檢驗均不顯著，說明對方法間差異的判定受樣品濃度差異和基質(zhì)差異而帶來的干擾較小，即恒定系統(tǒng)誤差和比例系統(tǒng)誤差較小[27]，但這2種誤差嚴格意義上不能歸類于系統(tǒng)誤差，因為回歸方程的回歸系數(shù)和截距對系統(tǒng)誤差不敏感。

表11 回歸系數(shù)、截距的t檢驗

圖3 銅元素的線性回歸方程

圖4 鋅元素的線性回歸方程

2.5 討論

TOST的等效標準的設(shè)定與Bland-Altman法一致性分析的應(yīng)用依據(jù)需要方法使用者與業(yè)界各個相關(guān)方共同探討，同時結(jié)合考慮法規(guī)層面的需求[28-29]。顯著性檢驗在否定無效假設(shè)時受檢測方法精密度的影響而易犯一類錯誤，在接受無效假設(shè)時受樣本量不足、方差過大的影響而易犯二類錯誤，而TOST的無效假設(shè)和備擇假設(shè)與經(jīng)典顯著性假設(shè)的位置相反，顯著水平為一尾概率，能夠降低統(tǒng)計中犯一類錯誤的概率。故檢測結(jié)果的評價應(yīng)結(jié)合評價目的采用不同的統(tǒng)計手段進行處理。

“質(zhì)控樣檢測比對”是在特定的檢測條件下判斷兩檢測方法間是否存在差異并界定等效的邊界，但是未能對不同測試對象、不同檢測濃度等條件存在情形下的方法間差異進行分析判定，而“樣品檢測比對”能綜合考慮樣品基質(zhì)這種情況對分析結(jié)果的影響，能排除因配方奶粉類型的不同而帶來的誤差干擾，使分析結(jié)果更全面可靠。

3 結(jié)論

國標FAAS法與ISO標準ICP-MS法在分析原理、方法定量方式和樣品處理方式及其他細節(jié)參數(shù)上存在較大差異。根據(jù)方法比對結(jié)果，2種方法外部質(zhì)控樣檢測結(jié)果均和真值接近，方法準確性均良好，精密度上ICP-MS方法相對更好，在10%等效標準范圍和應(yīng)用依據(jù)上方法均具有等效性和較好的一致性，方法可互相替代使用，但在5%等效標準范圍和應(yīng)用依據(jù)上方法均不具有等效性和一致性。對于有奶粉進出口業(yè)務(wù)的乳企而言，常規(guī)情況下這種差異應(yīng)是可接受的，但當國內(nèi)外質(zhì)檢結(jié)果有一定差異又臨近標簽值限值的極端情況下時，這種差異也可能會導(dǎo)致雙邊檢測結(jié)果無法相互合規(guī)合法，故進出口乳企在面對這種差異時應(yīng)引起重視。此外，ISO標準在奶粉樣品的前處理上采用復(fù)溶方式進行樣品制備，保障樣品的均一性使檢測結(jié)果具有更好的代表性，這也值得參考和借鑒。