范靜芝，耿 彪，付相君，趙文英

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 1.腫瘤內(nèi)科；2.呼吸內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，肺癌每年新發(fā)病例約220萬(wàn)，死亡病例約180萬(wàn)，對(duì)人類的身體健康構(gòu)成了極大的威脅[1]。近年來(lái)，盡管肺癌診療水平不斷提高，但其5年生存率仍較低。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumour-associated macrophages,TAMs)是腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)中最豐富的免疫細(xì)胞，目前研究已證實(shí)TAMs與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在直接聯(lián)系，包括乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌等[2]。三結(jié)構(gòu)域蛋白59(tripartite motif-59,TRIM59)是TRIM蛋白超家族的重要成員之一，位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，參與調(diào)控細(xì)胞周期，具有細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞、凋亡、致癌等作用[3]。本課題組前期研究揭示TRIM59可以通過(guò)外泌體在腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境之間來(lái)回穿梭，傳遞信息，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[4]。但TRIM59蛋白在TAMs中的表達(dá)水平及其與臨床病理參數(shù)關(guān)系還未了解。本研究通過(guò)mIHC法檢測(cè)肺癌組織微陣列芯片TAMs中TRIM59蛋白表達(dá)水平，分析TRIM59的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)和患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 芯片 肺癌組織芯片(OD-CT-RsLug04-001)購(gòu)于上海芯超公司，芯片納入了92例肺癌組織及配對(duì)癌旁組織，患者的臨床病理資料和生存數(shù)據(jù)完整。

1.1.2 細(xì)胞系 人肺癌A549細(xì)胞株、人肺癌H1299細(xì)胞株和人急性單核白血病THP-1細(xì)胞株均來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 主要試劑 TRIM59多克隆抗體(PA5-38726)和CD68多克隆抗體(PA5-109344)購(gòu)于Invitrogen公司，Opal 4-color fluorescent IHC kit(NEL810001KT)購(gòu)于Akoya Biosciences公司，DAPI染色工作液、RIPA裂解液和BCA試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司，β-actin抗體(3700)購(gòu)于Cell Signaling Technology公司，佛波酯(16561-29-8)購(gòu)于Med Chem Express公司，人TRIM59過(guò)表達(dá)慢病毒顆粒(HG25849-ACGLN)購(gòu)于Sino Biological公司，TRIM59shRNA(靶標(biāo)序列:CTGAGGTTCAACCCGTTGAAA)購(gòu)于Sigma公司，Transwell 24孔板(孔徑為8 μm)購(gòu)于BD Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)(mIHC) 將載玻片用二甲苯和乙醇脫蠟，通過(guò)微波進(jìn)行抗原回收，3%H2O2(新鮮制備)孵育10 min后，室溫下用封閉緩沖液封閉10 min，然后4℃孵育一抗過(guò)夜，室溫下孵育二抗2 h，Opal工作溶液孵育10 min，用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，加抗熒光淬滅劑封片后，用共聚焦顯微鏡捕捉熒光信號(hào)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 THP-1細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，A549細(xì)胞及H1299細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)液由含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素和DMEM培養(yǎng)液構(gòu)成，置于含5% CO2、37℃孵育箱中培養(yǎng)。1～2 d換液1次，3～4 d傳代1次。以下實(shí)驗(yàn)均取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將傳代培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞密度稀釋成1×106個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)皿中，于含100ng/mL佛波酯、0.3%BSA的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h誘導(dǎo)分化。通過(guò)光鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，鑒定細(xì)胞是否分化為巨噬細(xì)胞。取已分化的THP-1源性巨噬細(xì)胞接種于6孔板中，并分為：TRIM59過(guò)表達(dá)組(TRIM59過(guò)表達(dá)慢病毒感染)、控制對(duì)照組(GFP過(guò)表達(dá)慢病毒感染)、空白對(duì)照組(未處理)；TRIM59敲低組(TRIM59shRNA轉(zhuǎn)染)、控制對(duì)照組(scrambledRNA轉(zhuǎn)染)、空白對(duì)照組(未處理)，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，置于孵育箱中培養(yǎng)過(guò)夜后，培養(yǎng)液更換為無(wú)抗含血清的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 蛋白印跡法檢測(cè) 使用RIPA裂解液裂解步驟1.2.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，加入一抗4℃封閉過(guò)夜，再加入對(duì)應(yīng)二抗室溫封閉1 h，滴反應(yīng)液曝光。以β-actin為內(nèi)參。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 消化收集1.2.3分組轉(zhuǎn)染后的THP-1細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1.6×105個(gè)/mL，取600 μL細(xì)胞懸液接種于24孔板Transwell下室。再收集A549細(xì)胞、H1299細(xì)胞，消化離心后，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞密度為4×105個(gè)/mL，取200 μL細(xì)胞懸液接種于24孔板Transwell上室與下室THP-1源性巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。放入孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)約48 h后，取出24孔板中的Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上層的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定20 min后，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS液沖洗干凈，倒扣小室自然風(fēng)干。在倒置顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，拍照并計(jì)算細(xì)胞的個(gè)數(shù)及平均值。

1.2.6 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 消化步驟1.2.3分組轉(zhuǎn)染后的THP-1細(xì)胞，將其離心后，用無(wú)FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞密度為3×103個(gè)/mL，取1 mL細(xì)胞懸液接種于6孔板中。同時(shí)消化收集A549細(xì)胞、H1299細(xì)胞，用無(wú)FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為3×103個(gè)/mL，每孔取1 mL細(xì)胞懸液接種于對(duì)應(yīng)6孔板中與THP-1源性巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。每天觀察，當(dāng)肉眼可觀察到克隆形成時(shí)，終止培養(yǎng)(2周左右)。棄上清，PBS洗滌細(xì)胞2次，用4%多聚甲醛固定20 min后，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，后用PBS液浸洗干凈，自然風(fēng)干。用數(shù)碼相機(jī)拍照儲(chǔ)存圖片，計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 肺癌TAMs中E3泛素連接酶TRIM59的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系及對(duì)患者預(yù)后的影響 mIHC法檢測(cè)結(jié)果顯示，與癌旁肺組織中的巨噬細(xì)胞相比，肺癌TAMs中E3泛素連接酶TRIM59的表達(dá)水平明顯上調(diào)(見(jiàn)圖1)。應(yīng)用Image J軟件定量分析肺癌微環(huán)境TAMs中TRIM59的表達(dá)水平，TAMs中TRIM59的平均熒光強(qiáng)度(MFIs)<100a.u.(arbitrary units,a.u.)時(shí)為低表達(dá)，而TRIM59的MFIs≥100a.u.時(shí)則為高表達(dá)。根據(jù)TAMs中TRIM59的MFIS評(píng)分，92例患者中有45例患者為高表達(dá)，47例患者為低表達(dá)。結(jié)果顯示，TAMs中E3泛素連接酶TRIM59的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

TRIM59表達(dá)(紅色熒光)，CD68標(biāo)記巨噬細(xì)胞(黃色熒光)，細(xì)胞核用DAPI標(biāo)記(藍(lán)色熒光)。

表1 TAMs中TRIM59蛋白表達(dá)水平與肺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析表明，與TAMs中TRIM59低表達(dá)的患者相比，TAMs中TRIM59的表達(dá)水平升高的患者總生存期較差(P<0.001)，見(jiàn)圖2。

圖2 肺癌TAMs中TRIM59的表達(dá)與患者總生存期的Kaplan-Meier生存曲線

2.2 巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)TRIM59促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)TRIM59可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞A549和H1299的侵襲能力(P<0.01)；相反通過(guò)TRIM59shRNA敲低THP-1源性巨噬細(xì)胞TRIM59蛋白后，則抑制巨噬細(xì)胞的促腫瘤侵襲作用(P<0.01)，見(jiàn)圖3C、D。

2.3 巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)TRIM59促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與控制對(duì)照組細(xì)胞相比，巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)TRIM59可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞A549和H1299的增殖能力(P<0.01)；相反通過(guò)TRIM59shRNA敲低THP-1源性巨噬細(xì)胞中TRIM59蛋白后，則抑制巨噬細(xì)胞的促腫瘤增殖作用(P<0.01)，見(jiàn)圖4B、C。

A.Transwell實(shí)驗(yàn)中THP-1源性巨噬細(xì)胞與肺癌細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)示意圖。B.WB法檢測(cè)THP-1源性巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)或敲低TRIM59蛋白水平。C～D.THP-1源性巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)或敲低TRIM59對(duì)A549、H1299細(xì)胞侵襲能力的影響(C：F=28.661和F=208.726，D：F=80.479和F=461.314，P<0.01)。**P<0.01。

3 討論

肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、復(fù)雜的過(guò)程，涉及到復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制[5]。TME是腫瘤細(xì)胞賴以生存的內(nèi)環(huán)境，主要包括血管、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等[6]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用是促成惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的必要條件[7]。腫瘤細(xì)胞可通過(guò)自分泌和旁分泌，改變和維持有利于自身生存和發(fā)展的局部微環(huán)境條件[8]；腫瘤微環(huán)境亦可通過(guò)代謝、分泌、免疫等功能的改變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。

有研究[10]表明，TRIM59在胃癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，且TRIM59表達(dá)水平與腫瘤分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度存在相關(guān)性，生存分析顯示，與TRIM59低表達(dá)患者相比，TRIM59高表達(dá)患者的總生存期明顯縮短。通過(guò)體外、體內(nèi)功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TRIM59通過(guò)促進(jìn)P53泛素化蛋白酶體降解，抑制P53活性從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、克隆形成和轉(zhuǎn)移。另有研究[11]同樣表明，在肺癌患者中，與癌旁組織相比，腫瘤組織中TRIM59的表達(dá)水平顯著上調(diào)，并且TRIM59的表達(dá)水平與患者的腫瘤負(fù)荷存在相關(guān)性，TRIM59可以作為患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，機(jī)制研究顯示，TRIM59主要通過(guò)調(diào)控CDK6的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其促腫瘤作用。本研究用mIHC法檢測(cè)肺癌組織微陣列芯片發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織中的巨噬細(xì)胞相比，TRIM59蛋白在肺癌TAMs中表達(dá)水平顯著升高，其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移有關(guān)。生存分析結(jié)果顯示，TAMs中高表達(dá)TRIM59的肺癌患者總生存期較差，這些臨床數(shù)據(jù)表明，TRIM59作為一個(gè)重要的癌蛋白，可能會(huì)作為肺癌的潛在預(yù)后和治療靶標(biāo)。

A.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)中THP-1源性巨噬細(xì)胞與肺癌細(xì)胞共培養(yǎng)示意圖。B～C.THP-1源性巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)或敲低TRIM59蛋白對(duì)A549、H1299細(xì)胞增殖能力的影響(B：F=126.539和F=154.600，C：F=364.628和F=273.067，P<0.01)。**P<0.01。

免疫環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，巨噬細(xì)胞是多種疾病發(fā)生的關(guān)鍵免疫細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行研究可以為腫瘤治療提供更多的可能[12]。TAMs具有很強(qiáng)的可塑性，容易被其所處的環(huán)境誘導(dǎo)而極化成不同的類型[13]。在腫瘤環(huán)境的應(yīng)激馴化下，TAMs大多表現(xiàn)為促癌作用，如刺激腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成[14]。TAMs可以迅速適應(yīng)腫瘤微環(huán)境的變化，在功能上接近但不完全等同M2型巨噬細(xì)胞表型，并促進(jìn)微環(huán)境免疫抑制與腫瘤進(jìn)展[13]。TAMs介導(dǎo)的免疫抑制主要與微環(huán)境中浸潤(rùn)的T細(xì)胞的種類、功能相關(guān)。為了模擬腫瘤微環(huán)境TAMs中TRIM59的表達(dá)水平，本研究利用TRIM59過(guò)表達(dá)慢病毒感染THP-1源性巨噬細(xì)胞、TRIM59shRNA轉(zhuǎn)染THP-1源性巨噬細(xì)胞，Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)TRIM59增強(qiáng)肺癌細(xì)胞侵襲和增殖能力，抑制TRIM59表達(dá)，則遏制了巨噬細(xì)胞的促腫瘤細(xì)胞侵襲和增殖作用，表明TAMs中TRIM59表達(dá)水平升高促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和增殖能力。

綜上所述，E3泛素連接酶TRIM59在肺癌TAMs中表達(dá)水平升高，其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移有關(guān)。肺癌TAMs中TRIM59的表達(dá)水平升高的患者總生存期較差。體外實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明上調(diào)巨噬細(xì)胞中TRIM59的表達(dá)水平促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力，下調(diào)TRIM59的表達(dá)則遏制了巨噬細(xì)胞的促腫瘤作用。這些結(jié)果的發(fā)現(xiàn)表明TAMs中E3泛素連接酶TRIM59蛋白表達(dá)水平升高對(duì)肺癌腫瘤進(jìn)展起到重要作用。