蔣 焜，杜 洋，許立哲，寧金卓

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院 泌尿外科,湖北 武漢 430060)

Dickkopf相關(guān)蛋白3(dickkopf 3,DKK3)是一種分泌性糖蛋白，屬DKK蛋白家族成員，其定位于染色體11p15.1上的長47.1kb的DKK3基因編碼，由350個(gè)氨基酸組成，分子量為38 000 ku，具有N端信號(hào)肽以及包含兩個(gè)被可變的接頭區(qū)分開保守的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，分別是Cys-1和Cys-2[1]。目前DKK3已經(jīng)被證實(shí)在人腎上腺皮質(zhì)中表達(dá)，此外在部分動(dòng)物腦(主要是嚙齒類)和成纖維細(xì)胞中亦有表達(dá)[2]。與此同時(shí)，DKK3被證實(shí)在人類多種腫瘤中差異化表達(dá)，大部分腫瘤為低表達(dá)，包括前列腺癌[3]、肝癌[4]、結(jié)腸癌[5]、胃癌[6]、宮頸癌[7]、肺癌[8]、腎細(xì)胞癌[9]等。另有研究也表明DKK3具有代謝及免疫相關(guān)功能，如免疫調(diào)節(jié)作用、代謝調(diào)節(jié)及心臟功能保護(hù)等[1]。上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)已在多種惡性腫瘤中被證實(shí)參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)現(xiàn)有的研究也證實(shí)了DKK3在部分惡性腫瘤中參與并調(diào)控EMT這一過程[10]。然而對于DKK3在前列腺癌細(xì)胞系中的功能研究較少，本研究通過上調(diào)DKK3在PC3中的表達(dá)以探討其對PC3細(xì)胞凋亡、侵襲以及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2019年6月～2020年6月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科確診并接受前列腺癌根治手術(shù)患者標(biāo)本24例為研究對象，所有患者在接受手術(shù)前均未接受化療及免疫治療；收集同期確診良性前列腺增生并接受前列腺電切術(shù)患者標(biāo)本24例為對照組。本研究經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 主要試劑與儀器 前列腺癌細(xì)胞系PC3及人正常前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)；用于細(xì)胞培養(yǎng)的DMEM培養(yǎng)基、EMT相關(guān)蛋白孵育抗體、10%的胎牛血清、細(xì)胞凋亡相關(guān)試劑盒和SYBR Green real time PCR試劑分別購自Gibco Life Technologies公司、Abcam公司、碧云天公司以及Takara公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 PC3細(xì)胞培養(yǎng)在適當(dāng)條件的培養(yǎng)箱環(huán)境(5%CO2，37℃)中進(jìn)行，并且每隔1～2 d更換新鮮的培養(yǎng)基，1周傳代2次。細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化之后，將其接種于6孔板中，當(dāng)鏡下觀察到細(xì)胞總體密度達(dá)到80%的時(shí)候，換成無血清培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染ov-DKK3,NC組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒(陰性對照)，Ctrl組為對照組。在轉(zhuǎn)染后6 h再將舊培養(yǎng)基換新鮮的完全培養(yǎng)基，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后再進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析。

1.4 免疫組化法檢測組織中DKK3表達(dá)情況 按免疫組化檢測試劑盒說明書對組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，隨后DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分色，在光學(xué)顯微鏡下觀察DKK3在組織中的表達(dá)情況。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 細(xì)胞中所有RNA的提取按照Trizol詳細(xì)步驟進(jìn)行操作,通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，用SYBR Green做熒光染料，檢測E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和DKK3的水平。內(nèi)參基因?yàn)閁6 RNA。在92℃下進(jìn)行反應(yīng)3 min預(yù)變性，接著在94℃下變性30 s，再于55℃退火30 s，72℃延長1 min，循環(huán)40次。根據(jù)待測標(biāo)本Ct值，通過2-△△Ct法算出相對表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 對轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，在胰酶作用后進(jìn)行離心(3 000 r/min，半徑80 nm，12 min)，用無菌PBS液對細(xì)胞進(jìn)行3次充分洗滌，70%預(yù)冷乙醇重懸。依照Annexin V-FITC試劑盒操作說明配制溶液，再用250 μL結(jié)合緩沖液將其重新懸浮。將10 μL 20 mg/L的碘化丙啶(PI)加至懸液內(nèi)并于37℃避光條件下孵育1 h，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測并進(jìn)行數(shù)據(jù)解析。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集對數(shù)生長期PC3細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液后調(diào)整細(xì)胞密度，按照每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)每孔中加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37℃孵育4 h，棄上清，每孔分別加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床孵育后檢測各孔在490 nm波長的吸光度(OD)值。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn) 前列腺癌PC3細(xì)胞系轉(zhuǎn)染ov-DKK3及空白對照24 h后，消化酶作用下收集細(xì)胞，以每孔5×104個(gè)接種到Transwell小室。小室上層加入100 μL無血清培養(yǎng)基，下層加入600 μL含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)時(shí)間到后即刻在熒光倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞侵襲和遷移情況。

1.9 Western blot 各組細(xì)胞進(jìn)行收集后接著將RIPA裂解溶液(PMSF)加至其中，在裂解30 min后采取超聲勻漿，再進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取。集其上清后以BCA法測定蛋白濃度。電泳后將凝膠放入電傳輸槽中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上再密封1.5 h，TBST液充分洗膜后加1∶1 000對抗E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白抗體進(jìn)行稀釋并于4℃冰箱孵育過夜。GAPDH為內(nèi)參對照。加入二抗后室溫孵育1 h后進(jìn)行曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 DKK3在前列腺癌組織中表達(dá)降低 免疫組化檢測顯示，DKK3在前列腺增生組織表達(dá)明顯高于前列腺癌組織(圖1)。

圖1 DKK3在前列腺癌組織中的表達(dá)

2.2 DKK3在PC3細(xì)胞中表達(dá)水平降低 qRT-PCR法檢測顯示，與正常前列腺上皮細(xì)胞(1.00±0.08)相比，前列腺癌PC3細(xì)胞中DKK3表達(dá)(0.53±0.06)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.14，P<0.01)。

2.3 過表達(dá)DKK3促進(jìn)PC3細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ctrl組、NC組以及ov-DKK3組凋亡率分別為(16.27±1.82)%、(15.80±1.78)%、(28.72±2.56)%。ov-DKK3組凋亡能力較ctrl組及NC組表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.07，P<0.01)，見圖2。

圖2 過表達(dá)DKK3促進(jìn)PC3細(xì)胞凋亡

2.4 過表達(dá)DKK3抑制PC3細(xì)胞增殖MTT增殖 PC3細(xì)胞中ctrl、NC及ov-DKK3組的24、48、72 h細(xì)胞增殖率分別為[(53.52±3.64)%、(52.18±3.52)%、(44.53±3.01)%]，[(73.25±4.02)%、(72.15±3.86)%、(60.28±4.18)%]，[(88.56±5.18)%、(84.43±4.92)%、(71.62±4.30)%]。ov-DKK3組增殖能力較ctrl組及NC組表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.10，P<0.05；F=9.59，P<0.05;F=10.10，P<0.05)。

2.5 過表達(dá)DKK3抑制PC3細(xì)胞遷移 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與ctrl組[(86.28±6.23)個(gè)]、NC組[(88.16±5.69)個(gè)]相比，ov-DKK3組[(48.52±4.37)個(gè)]細(xì)胞遷移能力減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.85，P<0.01)。見圖3。

2.6 過表達(dá)DKK3抑制PC3細(xì)胞侵襲 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與ctrl組[(36.28±2.86)個(gè)]、NC組[(35.19±2.98)個(gè)]相比，ov-DKK3組[(19.88±2.13)個(gè)]細(xì)胞侵襲能力減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.04，P<0.01)。見圖4。

圖3 過表達(dá)DKK3抑制PC3細(xì)胞遷移

圖4 過表達(dá)DKK3抑制PC3細(xì)胞侵襲

2.7 過表達(dá)DKK3對PC3細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ov-DKK3組中E-cadherin蛋白水平(0.71±0.05)比ctrl組(0.46±0.04)和NC組(0.40±0.04)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.68，P<0.01);與ctrl組(0.42±0.03、0.40±0.03)和NC組(0.32±0.03、0.41±0.03)相比，ov-DKK3組中Vimentin和N-cadherin蛋白(0.18±0.02、0.25±0.02)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59.45，P<0.01;F=32.86，P<0.01)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ov-DKK3組中E-cadherin mRNA水平(3.56±0.25)比ctrl組(1.00±0.18)和NC組(0.98±0.16)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=164.40，P<0.01);與ctrl組(1.00±0.07、1.00±0.07)和NC組(1.03±0.08、1.02±0.07)相比，ov-DKK3組中Vimentin和N-cadherin mRNA(0.56±0.06、0.45±0.05)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.82，P<0.01;F=76.56，P<0.01)。見圖5。

圖5 過表達(dá)DKK3對PC3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

前列腺癌是男性最常見腫瘤之一，全球范圍內(nèi)發(fā)病率約占成人惡性腫瘤的7.3%[11]。在我國前列腺癌確診患者大多數(shù)分期偏晚，尤其是進(jìn)展至轉(zhuǎn)移性去勢抵抗前列腺癌(mCRPC)后治療效果不佳，治療靶點(diǎn)少，預(yù)后極差。DKK3是一種分泌性糖蛋白，屬DKK蛋白家族成員，多篇文獻(xiàn)報(bào)道DKK3在多種惡性腫瘤組織中有異常表達(dá)[12]。研究表明EMT相關(guān)蛋白在前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，且這一作用與患者預(yù)后密切相關(guān)，其機(jī)制可能與前列腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化后獲得更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)[13]。已有文獻(xiàn)證實(shí)DKK3在部分腫瘤中與上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程相關(guān)[10]，但其在前列腺癌中與EMT的關(guān)系以及對細(xì)胞凋亡以及腫瘤生物學(xué)行為(如遷移和侵襲)的影響仍不明確。

為進(jìn)一步探究DKK3在前列腺癌中與上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系以及其對凋亡、遷移和侵襲的影響。本研究結(jié)果顯示前列腺癌組織和細(xì)胞中DKK3表達(dá)明顯減少，這一結(jié)果與DKK3在大部分腫瘤中的低表達(dá)相符。在此基礎(chǔ)上，本研究通過上調(diào)DKK3在PC3中的表達(dá)以探討其對PC3細(xì)胞凋亡、增殖、遷移和侵襲以及EMT相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)DKK3可以促進(jìn)PC3細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制PC3細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。與此同時(shí)，過表達(dá)DKK3后E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，而另外兩種EMT相關(guān)蛋白Vimentin和N-cadherin的表達(dá)水平下降，這也可以從分子水平揭示DKK3能夠通過調(diào)控EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平降低前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，DKK3可能作為一種抑癌基因在前列腺癌發(fā)生與發(fā)展的一系列過程中扮演了重要的角色，其通過靶向調(diào)控EMT相關(guān)蛋白從而影響前列腺癌的侵襲和遷移，并最終抑制前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。