劉萌萌，陶雪花，張士發(fā)，毛娟娟

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 兒科,安徽 蕪湖 241001)

人類免疫系統(tǒng)發(fā)育最早始于胎兒期。新生兒，尤其是早產(chǎn)兒，由于宮內(nèi)受暴露抗原的限制，出生時(shí)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)“無經(jīng)驗(yàn)”,存在免疫功能失衡[1]。出生后，具有豐富抗原的外部環(huán)境將可能誘導(dǎo)早產(chǎn)兒不適度的適應(yīng)性免疫應(yīng)答和/或耐受的發(fā)生，從而對(duì)健康成長(zhǎng)帶來不利影響[2-3]。適應(yīng)性免疫的核心在于T細(xì)胞的增殖和分化，大約50%的CD8+T細(xì)胞會(huì)表達(dá)CD28，CD28是主要的共刺激分子，識(shí)別APC細(xì)胞表面的天然配體CD80和CD86，相互結(jié)合后激活T細(xì)胞的增殖和分化并分泌細(xì)胞因子。PD-1是一種抑制性信號(hào)分子，對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞、T細(xì)胞的分化、T細(xì)胞耐受、T細(xì)胞耗竭和外周炎癥有重要作用，能有效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答[4-6]。益生菌本質(zhì)上是活的微生物，可能通過控制免疫反應(yīng)的“開/關(guān)”，促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟[7]。目前有較多新生兒使用益生菌調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的文獻(xiàn)，主要關(guān)注于CD4+T細(xì)胞，而CD8+T細(xì)胞在適應(yīng)性免疫中對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟具有重要作用，目前相關(guān)研究較少。本研究通過對(duì)早產(chǎn)小鼠使用常樂康進(jìn)行早期干預(yù)，觀察小鼠CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD28和PD-1的差異，以探討常樂康對(duì)早產(chǎn)小鼠免疫系統(tǒng)發(fā)育的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 常樂康(山東科興生物制品有限公司)；米福RU486(深圳市資福藥業(yè)有限公司)；FITC Hamster Anti-Mouse CD3、PE-CyTM5 Rat Anti-Mouse CD4、PE-CyTM7 Rat Anti-Mouse CD8、PE Hamster Rat Anti-Mouse CD28、PE Hamster Rat Anti-Mouse PD-1(美國(guó)BD Pharminge公司)；PBS緩沖液(HyClone)。

1.2 方法

1.2.1 新生小鼠模型 SPF級(jí)BALB/c健康成年小鼠(6～8周，體質(zhì)量18～22 g)，由江蘇省南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供。隨機(jī)選擇妊娠18 d的孕鼠腹腔注射RU486(劑量0.15 mg/kg)誘導(dǎo)早產(chǎn)，獲得胎齡<20 d的早產(chǎn)小鼠(最小胎齡18 d)；隨機(jī)選擇一部分孕鼠自然分娩，獲得胎齡>20 d的足月小鼠(最大胎齡22 d)。本研究經(jīng)過皖南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(LLSC-2020-070)。

1.2.2 分組及處理 將早產(chǎn)小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(A組)和對(duì)照組(B組)，足月小鼠為足月對(duì)照組(C組)，每組各20只。A組使用常樂康灌胃(活菌散劑量為每袋500 mg，將兩袋溶于1 mL生理鹽水中，灌胃容積為每只100 uL)，剩余兩組使用等量生理鹽水灌胃，1周。

1.2.3 組織取材與標(biāo)本制備 分別于第14、21天隨機(jī)在3組中各取10只小鼠，經(jīng)水合氯醛麻醉摘除眼球獲取外周血，使用肝素抗凝管抗凝，靜置備用。

1.2.4 CD28、PD-1檢測(cè) 取兩只流式管分別標(biāo)記為a、b，各加入外周血100 μL，依次在a管中加入5 μL CD3e、CD4、CD8a、CD28，b管中加入5 μL CD3e、CD4、CD8a、PD-1，混勻；將混合好抗體的外周血避光孵育30 min；分別于各管中加入500 μL紅細(xì)胞裂解液混勻后放置于37℃水浴箱，5 min；離心5 min，離心力400 g，棄上清，再重復(fù)1次；各管中加入2 mL PBS緩沖液進(jìn)行清洗，離心5 min，離心轉(zhuǎn)速1 500轉(zhuǎn)/min，棄上清；各管中加入700 μL PBS緩沖液后上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 外周血CD8+T細(xì)胞表面CD28和PD-1的表達(dá) 通過FlowJo X軟件分析小鼠外周血CD8+T細(xì)胞CD28和PD-1的表達(dá)。通過熒光信號(hào)或散射光信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度和相對(duì)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行圈門，從而分出T淋巴細(xì)胞，再根據(jù)表面熒光素的不同，區(qū)分CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，最后在CD8+T細(xì)胞中圈出CD28+和PD-1，并記錄其表達(dá)百分率。見圖1。

2.2 CD8+T細(xì)胞表面CD28百分率及其平均熒光強(qiáng)度 第14天時(shí)，A組CD28百分率高于C組(P<0.05),但低于B組(P<0.05)；第21天時(shí)，C組高于A、B組(P<0.05)。第14天時(shí)，A組CD28 MFI高于B、C組(P<0.05)；第21天時(shí)，A組高于B組(P<0.05)，但低于C組(P<0.05)。見表1。

2.3 CD8+T細(xì)胞表面PD-1百分率及其平均熒光強(qiáng)度 第14天時(shí)，A組PD-1百分率高于B、C組(P<0.05)；第21天時(shí)，B組高于A、C組(P<0.05)。第14天時(shí)，A組PD-1 MFI高于B、C組(P<0.05)；第21天時(shí)，A、C組高于B組(P<0.05)。見表2。

3 討論

益生菌是近年研究熱門的一種微生物制劑，在臨床上應(yīng)用廣泛。通過腸道消化吸收至全身進(jìn)而誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)生理應(yīng)激，對(duì)提高宿主的免疫功能有一定作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9-10]，早產(chǎn)兒使用益生菌可穩(wěn)定腸道微生物群，促進(jìn)免疫系統(tǒng)的發(fā)育，提高適應(yīng)性免疫。

T淋巴細(xì)胞一般會(huì)表達(dá)兩套共信號(hào)受體：共刺激受體和共抑制受體。共刺激受體對(duì)幼稚T細(xì)胞的充分激活至關(guān)重要(如CD28)；共抑制受體能降低T淋巴細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度(如PD-1)[11]。CD28表達(dá)對(duì)于T細(xì)胞活化十分重要，也是T細(xì)胞初始啟動(dòng)的關(guān)鍵。CD28提供獨(dú)特的信號(hào)，激發(fā)廣泛的轉(zhuǎn)錄和代謝以及表觀遺傳的變化，進(jìn)一步對(duì)T細(xì)胞的激活、擴(kuò)增和分化產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在第14天，A組CD28百分率處于兩對(duì)照組之間，但CD28 MFI顯著高于兩對(duì)照組；在第21天，A組CD28百分率和MFI均高于B組,但低于C組，提示常樂康能促進(jìn)早產(chǎn)小鼠CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD28，但在早期CD28的表達(dá)可能會(huì)暫時(shí)性地降低。CD28表達(dá)的缺失會(huì)導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞失去細(xì)胞毒功能，同時(shí)抑制T細(xì)胞的增殖[12]。然而，由于腫瘤抗原的慢性刺激，癌癥患者CD8+T細(xì)胞會(huì)失去CD28的表達(dá)，從而呈現(xiàn)對(duì)腫瘤抗原的無應(yīng)答狀態(tài)[13]。因此，CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD28對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟具有重要作用。本研究提示早期補(bǔ)充常樂康可能通過調(diào)控CD28的表達(dá)，對(duì)早產(chǎn)小鼠免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟具有促進(jìn)作用。

圖1 CD8+T細(xì)胞表面CD28/PD-1表達(dá)圖

表1 CD8+T細(xì)胞表面CD28百分率和MFI的比較

表2 CD8+T細(xì)胞表面PD-1百分率和MFI的比較

PD-1在T淋巴細(xì)胞激活后期被誘導(dǎo)，在T淋巴細(xì)胞活化時(shí)快速上調(diào)，激活后減弱TCR信號(hào)的傳導(dǎo)和降低T淋巴細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)凋亡，減輕機(jī)體過度免疫引起的免疫損傷[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在第14天，A組PD-1百分率和MFI均高于兩對(duì)照組；在第21天，A組PD-1百分率低于兩對(duì)照組，但PD-1 MFI高于B組，稍低于C組，提示常樂康可下調(diào)早產(chǎn)小鼠CD8+T細(xì)胞表面PD-1 MFI，但在早期可能會(huì)暫時(shí)性增加PD-1的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)[16]，高PD-1的表達(dá)是在癌癥和慢性感染中因持續(xù)抗原刺激而產(chǎn)生的耗盡T細(xì)胞的標(biāo)志，同時(shí)細(xì)胞因子的合成也受到限制，如PD-1在CD8+T細(xì)胞表面過表達(dá)是T淋巴細(xì)胞耗竭的一個(gè)重要提示。PD-1通過抑制TCR和CD28信號(hào)在效應(yīng)性T細(xì)胞中發(fā)揮免疫抑制作用，也對(duì)Treg細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響[17]。因此，CD8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟具有重要作用，本研究提示早期補(bǔ)充常樂康可能通過調(diào)控PD-1的表達(dá)，對(duì)早產(chǎn)小鼠免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟具有促進(jìn)作用。

此外，Hui等還提出了一些新的結(jié)論，PD-1可以特異性使CD28去磷酸化，即PD-1可以直接抑制CD28的信號(hào)阻斷T細(xì)胞的激活[17]。同時(shí)也有研究證明，CD28被認(rèn)為是有效的PD-1阻斷治療所必需的，CD28的缺失會(huì)削弱PD-1途徑阻斷的效果[18]。因此，CD28作為T細(xì)胞活化途徑中的關(guān)鍵一步，在控制T細(xì)胞耗竭過程中作用明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，A組在第14天時(shí)，CD8+T細(xì)胞PD-1百分率明顯高于CD28百分率，此時(shí)負(fù)性共刺激因子占主導(dǎo)地位，至第21天時(shí)，CD28百分率明顯高于PD-1百分率，此時(shí)正性共刺激因子占主導(dǎo)地位。相較于B組而言，A組正向共刺激因子恢復(fù)優(yōu)勢(shì)地位的速度更快，CD28的表達(dá)量也更高。提示早期補(bǔ)充常樂康可更早的恢復(fù)正向共刺激因子的主導(dǎo)地位，抑制負(fù)性共刺激因子，減少T細(xì)胞耗竭，有效促進(jìn)早產(chǎn)小鼠免疫功能的成熟。

綜上所述，使用常樂康進(jìn)行干預(yù)可能刺激早產(chǎn)小鼠外周血中CD8+T細(xì)胞的活化、增殖等，其生物學(xué)功能可能是通過平衡CD28和PD-1的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮適應(yīng)性免疫功能，從而促進(jìn)早產(chǎn)小鼠免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也存在不足之處，使用常樂康處理實(shí)驗(yàn)組的時(shí)間僅為7天，實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)水平仍不及足月組，在今后的實(shí)驗(yàn)可以適當(dāng)延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)組的處理時(shí)間，以獲得常樂康的最佳療效。為在臨床上積極、合理的使用益生菌制劑提供理論基礎(chǔ)，以減少早產(chǎn)兒并發(fā)癥的發(fā)生并改善預(yù)后。