楊許花，張競文，劉紅海，高丹丹*，丁功濤，宋禮，馬姝雯

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730124）（2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅蘭州730030）（3.甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，甘肅蘭州 730050）（4.甘南牦牛乳研究院，甘肅甘南 747000）

藏柳茶（Sibiraea laexigata(L.)Maxim），又名窄葉鮮卑花，隸屬薔薇科鮮卑花屬，常以其嫩葉、枝用作茶飲而成為藏族民間傳統(tǒng)珍貴藥材，主要分布于我國青海南部、四川西部、甘肅東南部和云南北部及西藏等高海拔地區(qū)[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藏柳茶主要有效成分包括三萜類化合物、黃酮以及多糖類，因柳茶特有的生理活性和天然來源的安全性使其在保健品和功能性食品中具有強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。多糖又稱多聚糖，是一種天然藥物成分，由許多相同或不同的單糖以α-或β-糖苷鍵構(gòu)成的化合物，是生物體維持生命活動的主要能源物質(zhì)[2]。柳茶多糖（Sibiraea angustataPolysaccharides，SAPs）作為藏柳茶主要的生物活性物質(zhì)，具有清熱助消化、調(diào)節(jié)脂代謝、抗氧化、抗腫瘤及增強(qiáng)機(jī)體免疫活性[3]等藥用價值。目前關(guān)于藏藥柳茶的研究主要以水提物為主，鮮有關(guān)于SAPs 提取工藝優(yōu)化及結(jié)構(gòu)表征和抗氧化活性的研究報(bào)道，本文首次采用聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）-超聲酶法輔助提取(Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction，UAEE)技術(shù)優(yōu)化萃取SAPs，該法較常用傳統(tǒng)水提醇沉[4]不僅引入超聲波輔助縮短提取時間，PEG 試劑提供-OH 基團(tuán)以加強(qiáng)多糖的相互作用和酶解雙重作用下提高多糖在PEG 溶液中的溶解度以大大提高多糖提取率。

本研究以采自甘肅太子山國家級自然保護(hù)區(qū)柳茶為研究材料，擬在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)篩選出PEG-UAEE 輔助提取SAPs 的最佳工藝參數(shù)，并對單糖組成、結(jié)構(gòu)和抗氧化活性進(jìn)行分析，以期為柳茶多糖工業(yè)化提取和產(chǎn)品的綜合開發(fā)利用提供理論技術(shù)支持依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏柳茶：采于甘肅省太子山國家級自然保護(hù)區(qū)（102 °43 'E，36 °36 'N）；果膠酶及纖維素酶，上海源葉生物科技有限公司；聚乙二醇，天津市大茂化學(xué)試劑廠；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），Sigma 公司；三氟乙酸及單糖標(biāo)品，美國Sigma 公司。其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 主要儀器設(shè)備

安捷倫1260 高效液相，美國Agilent 公司；650 紅外光譜儀，天津港東科技股份有限公司；ZEISS EVO18掃描電鏡，德國卡爾蔡司；Heraeus Multifuge X1R 高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；Fisher 酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；LGJ-100F 真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；ZWYR-2401 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；SB-500DTY超聲清洗器，寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 主要儀器設(shè)備

（1）提取工藝流程

新鮮原料→干燥→粉碎→過60 目篩→石油醚脫脂、φ=85%乙醇脫色→稱取3 g 柳茶葉干粉→聚乙二醇、超聲酶法輔助提取→離心（5 000 r/min，10 min）取上清液→蒸發(fā)濃縮至1/3→4 倍體積乙醇醇沉→4 ℃靜置12 h→離心（8 000 r/min，5 min）→冷凍干燥→柳茶粗多糖

（2）多糖除蛋白、脫色操作流程

柳茶粗多糖液（0.1 g/mL）→3 倍量Sevage 試劑（正丁醇:氯仿=1:5，V/V）除蛋白→0.06%（m/m）活性炭脫色（40 ℃水浴1 h）→振蕩混勻30 min→透析36 h（分子量3 500 u）→蒸發(fā)濃縮至1/3→4 倍量乙醇醇沉→離心（8 000 r/min，5 min）→淋洗（無水乙醚、丙酮、無水乙醇多次）→冷凍干燥→精制SAPs→苯酚-硫酸法測多糖含量。

1.3.2 SAPs 提取率及含量計(jì)算

多糖提取率計(jì)算如公式(1)所示：

式中：

A——多糖得率，%;

m——凍干柳茶多糖質(zhì)量，g；

M——柳茶干粉質(zhì)量，g。

采用苯酚-硫酸法[5]測定其多糖含量。以D-葡萄糖為對照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在質(zhì)量濃度0.1～0.6 mg/mL 范圍內(nèi)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程y=0.629 1x-0.005 9，R2=0.999 2，計(jì)算柳茶多糖含量。

1.3.3 PEG 分子量和濃度對SAPs 提取率的影響

考察不同PEG 分子量（200、400、600、800、1 000 u）和不同PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（15%、20%、25%、30%、35%）對多糖提取率的影響。

1.3.4 單因素條件優(yōu)化

以3.0 g 柳茶葉干粉，液料比15 mL/g，纖維素酶:果膠酶=1:2 酶配比為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)條件。酶添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，m/m）；pH 值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）；超聲功率（200、250、300、350、400 W）；超聲時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）；超聲溫度（40、50、60、70、80 ℃）對SAPs 提取率的影響，平行測定3 次。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以粗多糖得率（Y）為響應(yīng)值，酶添加量（A）、pH（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）為自變量，進(jìn)行四因素三水平Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)（BBD），因素及水平設(shè)計(jì)見表1。響應(yīng)面水平見下表3。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors of response surface test design

1.3.6 精制SAPs 的純化

參考宮春宇等[6]方法，配制精制0.1 g/mL SAPs 溶液過0.45 μm 微孔濾膜后，依次過100、30、10 ku 超濾膜進(jìn)行純化，以獲得相對分子質(zhì)量＜10 ku 的SAPs溶液，并醇沉凍干備用。

1.3.7 分子量分布測定

參考Wang 等[7]方法，配制1.0 mg/mL 純化SAPs，采用高效凝膠滲透色譜法（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）測定SAPs 分子量。選用UltrahydrogelTMLinear Column（300×7.8 mm，8 μm）色譜柱；調(diào)節(jié)柱溫40 ℃、流速0.8 mL/min 及進(jìn)樣體積為20 μL；流動相為0.1 mol/L NaNO2溶液。使用Dextran（Mw：1、5、10、21、40、84 ku）作為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為logMw=-0.649 3x+6.156 4（R2=0.998 7），以計(jì)算純化后SAPs 樣品的相對分子量。

1.3.8 單糖組成分析

1.3.8.1 薄層層析[8]

展開劑：正丁醇:異丙醇:乙酸乙酯:醋酸:吡啶:水=35:60:100:35:30:30（V/V）。

染色劑：0.9 mL 苯胺和1.66 g 鄰苯二甲酸混合溶解，加正丁醇至100 mL。

取木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖等7 種標(biāo)品和多糖水解產(chǎn)物點(diǎn)于薄層析紙以展開，取出吹干后均勻噴灑顯色劑于100 ℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.3.8.2 HPLC 色譜法分析單糖組成

參考Liang 等[9]試驗(yàn)方法，采用PMP 柱前衍生高效液相色譜（HPLC-PMP）分析SAPs 的單糖組成。

（1）多糖水解及衍生化：精確稱取10.00 mg 粗多糖樣品于螺口管中，加入2 mol/L 三氟乙酸（TFA）溶液5 mL，氮封后于110 ℃水浴水解5 h；冷卻后用3 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值為7.0，超純水定容至10 mL 后離心得多糖水解產(chǎn)物。各取0.2 mL 的0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）/甲醇溶液和0.3 mol/L NaOH加入到0.2 mL多糖水解液中，漩渦混勻后70 ℃水浴1 h，冷卻后加0.3 mol/L HCl溶液0.2 mL和1 mL氯仿混勻萃取，離心取上清液過0.22 μm 濾膜做單糖組成分析。

（2）色譜條件：采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：A為0.02 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH 值6.8），B 為乙腈；柱溫28 ℃，流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL，檢測波長：250 nm；洗脫梯度如表2 所示。

表2 流動相梯度Table 2 Mobile phase gradient

1.3.9 紅外光譜分析

取適量純化凍干SAPs 粉末，使用KBr 壓片法研磨均勻壓片后對樣品在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行傅立葉紅外光譜分析（FT-IR）并記錄[10]。

1.3.10 核磁共振氫譜分析

參考Wang 等[11]方法，取20 mg 純化凍干SAPs 完全溶于0.5 mL D2O以制備（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）樣品，經(jīng)Bruker AVANCE III HD 400 光譜儀在80 ℃下300 MHz 運(yùn)行1 h 得到1H NMR 光譜。

1.3.11 掃描電鏡分析

參考Nuerxiatia 等[12]試驗(yàn)方法，用導(dǎo)電膠將純化凍干SAPs 固定在樣品臺上，真空噴金處理后在20.00 kV下用德國蔡司鎢燈絲掃描電鏡（ZEISS EVO18）進(jìn)行掃描，觀察不同倍數(shù)下的外貌形態(tài)。

1.3.12 體外抗氧化活性分析

分別配制濃度為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的SAPs 待測溶液，以Vc 作為陽性對照，在517 nm 波長下測定SAPs 對DPPH·清除能力[13]；在510 nm 波長下測定SAPs 對·OH 清除能力[14]；在320 nm 波長下測定SAPs 對·清除能力[15]；每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定3 次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 軟件進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。此外，通過單因素方差分析分析組間差異，然后進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)。p＜0.05和p＜0.01被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG 分子量和質(zhì)量分?jǐn)?shù)對SAPs 提取率的影響

PEG 試劑可提供較充足的-OH 基團(tuán)以加強(qiáng)多糖的相互作用而形成氫鍵，從而提高多糖在PEG 溶液中的溶解度[16]。試驗(yàn)以30%（m/m）PEG 溶液（PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-800、PEG-1000）分別作SAPs 提取溶劑。由圖1a 可知，提取溶劑選擇PEG-400 水溶液時SAPs 達(dá)最佳得率9.85%，后隨著PEG 分子量的持續(xù)提高，多糖得率出現(xiàn)下降趨勢。PEG 分子量不同，對萃取溶劑的擴(kuò)散系數(shù)、粘度和極性產(chǎn)生的影響存在差異，本試驗(yàn)中PEG-400 較其他分子量更具有較大極性進(jìn)行傳質(zhì)。

圖1 PEG 分子量（a）、PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（b）對柳茶多糖得率的影響Fig.1 PEG molecular weight (a),PEG concentration (b) on the yield of SAPs

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG 萃取溶劑決定著溶液體系的粘度大小，進(jìn)而影響多糖得率的高低[17]。由圖1b 可知，PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在15%～30%時，柳茶多糖得率呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性增加，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到30%時，多糖得率達(dá)到最大值10.47%，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于30%時，多糖得率呈下降趨勢。Zhou 等[18]采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%PEG-400 水溶性溶劑提取石榴皮多糖，得到多糖產(chǎn)量最高達(dá)7.65%，可能是由于溶劑濃度的增加改變了體系的耗散因子，利于多糖的提取效率；當(dāng)PEG 濃度多高時導(dǎo)致粘度過高而多糖得率下降。因此，PEG-400 提取SAPs 的最佳濃度為30%。

2.2 超聲酶法提取

酶濃度的提高可以有效的增加酶與底物的結(jié)合面積，以使多糖提取率得到提高[19]。由圖2a 可知，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%～2%時，多糖提取率以劑量效應(yīng)不斷增加，當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至2%時，多糖提取率提高1.06%；當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過2%后，由于酶的飽和度和底物有限，多糖提取率趨于平穩(wěn)，這與Zhang 等[20]使用相同復(fù)合酶提取銀杏葉多糖中提取率的趨勢相似。在科學(xué)、經(jīng)濟(jì)性生產(chǎn)原則下選擇酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。

圖2 酶添加量（a）、提取液pH 值（b）、超聲功率（c）、超聲溫度（d）和超聲時間（e）對柳茶多糖得率的影響Fig.2 Amount of adding enzyme (a),extraction pH (b),Ultrasonic power (c),Ultrasonic temperature (d) and Ultrasound time (e) on the yield of SAPs

提取液pH 值主要通過影響酶活性或調(diào)節(jié)多糖酸堿性來提高多糖得率[21]。由圖2b 可知，提取液pH 值在3～7 范圍內(nèi)，多糖的提取率隨pH 值的不斷提高呈升后降的現(xiàn)象，當(dāng)提取液pH 值等于4 時，多糖的提取率達(dá)最佳10.52%，Zhai 等[22]研究果膠酶用量為0.7%時不同提取液pH 值對石榴皮多糖產(chǎn)量的影響發(fā)現(xiàn)，多糖產(chǎn)量先隨提取液pH 值的增加而增加，當(dāng)pH 值超過5 時，可能由于SAPs 的主要成分是酸性多糖且試驗(yàn)中果膠酶最佳酶活pH 值為3.5，pH 值持續(xù)升高使的酸性多糖不能繼續(xù)溶出且酶活降低。因此，選擇提取液pH 值為4 條件下多糖提取率最高。

超聲功率的不斷提高產(chǎn)生的空化作用會引起高溫高壓環(huán)境使細(xì)胞破碎，多糖被有效釋放溶解于萃取劑中，從而導(dǎo)致多糖得率提高[23]。如圖1c 可知，超聲功率為200～400 W 范圍內(nèi)，多糖提取率隨超聲功率的增大而不斷提高，當(dāng)超聲功率為400 W 時，多糖得率達(dá)到最大10.56%。但隨著超聲功率不斷提高會造成體系壓力過大而破壞多糖結(jié)構(gòu)，使多糖得率趨于平緩?？紤]到儀器自身功率限制和實(shí)際生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，試驗(yàn)超聲功率選擇為400 W。

超聲溫度的升高可使柳茶粉軟化以增加果膠酶和纖維素酶的酶解活性，加強(qiáng)酶對柳茶細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，使多糖分子運(yùn)動加快、接觸并溶解于PEG 萃取劑[24]。由圖1d 可知，多糖提取率在40～70 ℃范圍內(nèi)隨著超聲溫度升高而迅速提高，在70 ℃時達(dá)到最高值10.38%，超聲溫度升高引起整個反應(yīng)體系反應(yīng)速度加快，加快多糖溶出。溫度超過70 ℃后會加快萃取劑的損耗和多糖結(jié)構(gòu)的破壞，使得多糖發(fā)生水解而得率降低[25]。綜上，選擇70 ℃為最佳超聲溫度提取。

超聲時間的增加為超聲波能提供充足有效作用時間破壞柳茶粉細(xì)胞壁，提高PEG 萃取劑萃取多糖[26]。由圖1e 可知，超聲時間在1.0～2.0 h 范圍內(nèi)，SAPs 得率呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性增加，當(dāng)超聲時間達(dá)到2.0 h時，多糖得率達(dá)到最大值10.67%，當(dāng)時間超過2.0 h 后，多糖得率出現(xiàn)明顯下降情況。可能因?yàn)楦邷馗邏籂顟B(tài)持續(xù)時間過久或萃取液黏度增大，使超聲波引起部分多糖發(fā)生水解或受黏度影響溶出率降低。選擇超聲時間2.0 h 為最佳超聲時間提取。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立和方差分析

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇影響較顯著的單因素：A（酶添加量）、B（pH 值）、C（超聲時間）和D（超聲溫度）為相應(yīng)因子，Y（粗多糖得率）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6 軟件對表1、表3 中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到回歸方程：

表3 柳茶多糖工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Response surface test results and analysis of SAPs

Y=10.88+0.10A+0.033B-0.037C+0.30D+0.070AB+0.11AC-0.087AD+0.11BC+0.15BD+0.015CD-0.60A2-0.66B2-0.47C2-0.71D2

實(shí)驗(yàn)方差結(jié)果分析如表4 所示，顯著性檢驗(yàn)表明該回歸模型的擬合極顯著（p＜0.000 1），失擬項(xiàng)（p＞0.05）不顯著；模型與實(shí)際擬合較好（R2=0.983 1，R2adj=0.973 0），綜上結(jié)果均可說明模型擬合度可靠性強(qiáng)，觀察值和預(yù)測值之間的相關(guān)性良好，該模型可以用于預(yù)測和分析多糖最佳提取工藝[27]。該方差分析表明，線性系數(shù)D和二次系數(shù)（A2、B2、C2、D2）對柳茶多糖提取率影響極顯著（p＜0.000 1），線性系數(shù)A具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。

表4 回歸方程方差分析及結(jié)果Table 4 Analysis of variance and results of regression equation

續(xù)表4

2.3.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

影響SAPs 提取率的各因素交互作用3D 響應(yīng)面和等高線如圖3 所示。圖3a～3f 分別表示酶添加量與pH值、酶添加量與超聲時間、酶添加量與超聲溫度、pH值與超聲時間、pH 值與超聲溫度和超聲時間與超聲溫度的交互作用。因變量兩兩相互作用對SAPs 提取率的影響3D 響應(yīng)面圖均表現(xiàn)為光滑的彎曲面；四因素等高線圖均表現(xiàn)為橢圓形狀，表明相應(yīng)變量之間的相互作用非常重要[28]。

圖3 各因素交互作用對柳茶多糖提取率的影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response and contour diagram of the effects of interactions of various factors on the extraction rate of SAPs

總之，優(yōu)化的參數(shù)是酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，pH 值為4.0，超聲時間為2.0 h，超聲溫度為80 ℃。此時，SAPs提取率為10.95%，多糖含量為71.82%。較石磊[29]報(bào)道水提SAPs 的多糖含量為17%左右，說明PEG-UAEE提取存在較明顯的提高效果，表明該優(yōu)化提取條件是可供參考的。

2.4 相對分子質(zhì)量分析

采用HPGPC 法測定超濾純化后SAPs 的分子質(zhì)量分布如表5 所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線方程計(jì)算出SAPs分子量為1.5×103u，且信號峰呈現(xiàn)單一對稱；此外，Mw/Mn值接近1 并低于已發(fā)表其他多糖的相對分子量[30,31]，表明純化后SAPs 的分子量分布均勻且單一。

2.5 單糖組成分析

2.5.1 薄層層析

如圖4，樣品水解完全與1 木糖、2 葡萄糖、3 阿拉伯糖、4 果糖、5 甘露糖、6 半乳糖、7 鼠李糖均呈現(xiàn)均一斑點(diǎn)，進(jìn)一步可看出樣品與葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖的位置接近。為進(jìn)一步確定樣品的單糖組分進(jìn)行HPLC 分析。

圖4 多糖酸解后的薄層層析圖Fig.4 TLC of the polysaccharide after acid degradation

2.5.2 HPLC 法分析單糖組成

根據(jù)HPLC-PMP 分析，7 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品、SAPs 的色譜峰及出峰時間如圖5 所示，對比5 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間，得出SAPs 中較明顯的5 種單糖及占摩爾百分比分別為：半乳糖（13.34%）、葡萄糖（46.76%）、鼠李糖（8.78%）、果糖（2.89%）和阿拉伯糖（11.79%），純化后SAPs 單糖含量進(jìn)一步證明SAPs 是以半乳糖和葡萄糖為主的酸性雜多糖[32]。

圖5 混合對照品（a）及柳茶單糖組成（b）HPLC 圖Fig.5 HPLC chromatogram of monosaccharides of reference substances solution (a) and monosaccharides composition of SAPs (b)

2.6 紅外光譜分析

圖6 是SAPs 的紅外光譜圖，在3 366.11 cm-1處有很強(qiáng)的寬峰，為O-H 的伸縮振動吸收峰；2 879.75 cm-1附近為C-H 鍵伸縮振動引起的峰；這兩組吸收峰為糖類的特征吸收峰，證明該提取物為多糖[33]。1 732.76 cm-1是糖醛酸中羰基C=O 振動，這表明柳茶多糖含有糖醛酸；1 611.16 cm-1處吸收峰是由乙?；腃=O 振動引起的；1 436.25 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰表明多糖主鏈可能有糖醛酸的存在；1 101.45 cm-1是糖環(huán)中C-O-C 伸縮和變角振動引起的峰，也表明其含有吡喃糖環(huán)；947.92 cm-1附近有較強(qiáng)拉伸峰，表明該多糖存在β型糖苷鍵[34]。根據(jù)紅外光譜圖出現(xiàn)的峰值越強(qiáng)，表明多糖含量越高可推斷，SAPs 是β型吡喃多糖類化合物。

圖6 柳茶多糖的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of SAPs

2.7 NMR 光譜分析

多糖的1H NMR 譜圖中δ4.5～5.5 范圍主要為多糖的糖苷鍵區(qū)域，該區(qū)域出現(xiàn)的質(zhì)子信號表明了多糖的單糖種類數(shù)。其中，δ5.0 是區(qū)分吡喃糖構(gòu)型的質(zhì)子信號的臨界值，當(dāng)?shù)谝粋€碳的質(zhì)子位移大于δ5.0 時，表明多糖為α-糖苷鍵否則為β-糖苷鍵[32]。純化SAPs 的1H NMR 光譜如圖7 所示。從圖中可以看出，SAPs 在δ4.5～5.5 范圍內(nèi)有5 個質(zhì)子信號峰，這與HPLC-PMP 結(jié)果一致，且第一個碳的質(zhì)子位移出現(xiàn)在δ4.2～4.4，表明純化SAPs 中存在β-糖苷鍵，這與FT-IR 分析結(jié)果一致。

圖7 柳茶多糖的1H NMR 圖Fig.7 1H NMR spectra of SAPs

2.8 掃描電鏡分析

SAPs 的微觀掃描電鏡結(jié)構(gòu)如圖8 所示，經(jīng)觀察可發(fā)現(xiàn)多糖主要由不規(guī)則碎片結(jié)構(gòu)組成，伴有較多的細(xì)小不規(guī)則顆粒且表面較粗糙，結(jié)構(gòu)致密且貼合度較高。由此可證明SAPs 具有明顯的非晶態(tài)結(jié)構(gòu)并較完整的結(jié)構(gòu)形態(tài)。

圖8 柳茶多糖掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron microscopy of SAPs

2.9 抗氧化活性分析

DPPH 是一種穩(wěn)定的有機(jī)氮合成自由基，與抗氧化劑提供的氫原子或電子結(jié)合而形成穩(wěn)定的分子構(gòu)型[35]。由圖9a 可知，在0.0～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)，SAPs 和Vc的DPPH·清除能力表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，隨著質(zhì)量濃度的增大而逐漸增大。DPPH·清除能力在SAPs 和Vc 質(zhì)量濃度為0.0～0.2 mg/mL 時均呈明顯上升，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 時，清除能力達(dá)到最大值80.33%，半抑制濃度IC50為0.42 mg/mL；此時Vc 清除能力也達(dá)到最大值95.12%，半抑制濃度IC50為0.21 mg/mL。表明SAPs 可作為食品加工和保鮮過程中的天然抗氧化劑。據(jù)相關(guān)研究表明，多糖的抗氧化活性與物質(zhì)的分子量、硫酸化程度和糖苷鍵等存在關(guān)系，可通過超聲波處理以降低分子量從而提高多糖物質(zhì)的生物活性。

·OH 極易被氧化為各種有機(jī)物或無機(jī)物，在機(jī)體內(nèi)可快速造成組織脂質(zhì)過氧化、核酸斷裂和蛋白質(zhì)分解，從而造成導(dǎo)致組織損傷或細(xì)胞功能喪失[36]。由圖9b 所示，SAPs 和Vc 對·OH 清除能力均表現(xiàn)出濃度依賴性，在0.0～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度的增大而逐漸增大。質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg/mL 后，SAPs 對·OH自由基清除能力趨勢增長較平緩，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL 時，多糖對·OH 清除能力達(dá)到最大值38.40%，半抑制濃度IC50為2.08 mg/mL；此時，Vc 對·OH 清除能力也達(dá)到最高值70.54%，半抑制濃度IC50為0.51 mg/mL。Wu 等[37]研究紫菜多糖含有α型和β型糖苷鍵結(jié)構(gòu)，且清除·OH（22.84%，2 mg/mL）效率與低濃度SAPs 抑制·OH 接近。

·O2-是由機(jī)體內(nèi)黃嘌呤脫氫酶、纖維二糖氧化酶和醛氧化酶等少數(shù)酶作用引起產(chǎn)生的重要自由基[38]。如圖9c 所示，對·O2-清除能力在質(zhì)量濃度為0.0～1.0 mg/mL范圍內(nèi)以明顯的濃度依賴性方式增加。SAPs 質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL 時，對·O2-清除能力達(dá)到最大值85.20%，半抑制濃度IC50=0.28 mg/mL；相同質(zhì)量濃度下，Vc 清除·O2-能力高達(dá)102.31%，半抑制濃度IC50=0.20 mg/mL。Ma 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)天花粉蛋白多糖濃度達(dá)到1.28 mg/mL 時表現(xiàn)出最大·O2-清除活性為35.33%。研究表明，·O2-清除作用機(jī)制可能是由于醛類或酮類多糖中存在親電基團(tuán)。

圖9 柳茶多糖抗氧化活性Fig.9 Antioxidative activity of SAPs

綜上可見，在0.0～1.0 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，SAPs 和Vc 對·O2-清除能力均強(qiáng)于對DPPH·清除能力和·OH 清除能力，且清除活性較Vc 差距較小。

3 結(jié)論

以藏柳茶為原料，以多糖提取得率為評價指標(biāo)，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化PEG-UAEE 提取SAPs 最佳工藝為：PEG-400 濃度為30%，復(fù)合酶添加量2%，pH 值4.0，超聲功率80%，超聲時間2.0 h，超聲溫度80 ℃條件得出多糖提取率為10.95%，多糖含量為21.82%。由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、果糖和阿拉伯糖組成的酸性雜多糖，摩爾比為13.34:46.76:8.78:2.89:5.34:11.79；多糖具有完整明顯的非晶態(tài)結(jié)構(gòu)，β-糖苷鍵的吡喃型多糖；隨著多糖含量的提高，其自由基清除能力劑量效應(yīng)關(guān)系，DPPH·清除能力、·OH 清除能力和·O2-清除能力的IC50值分別為0.42、2.08、0.28 mg/mL。本研究可為藏藥柳茶的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考。