王冠英，李珂珂，李中玉，葉淑紅，孫浩*，弓曉杰*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116038）（2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116602）

文冠果（Xanthoceras sorbifoliumBunge）又名文冠木、木瓜、溫旦革子等，為無患子科（Sapindaceae）文冠果屬（Xanthoceras）植物，單屬單種[1]。文冠果原產(chǎn)于我國(guó)北方黃土高原地區(qū)，天然分布于北緯32°～46°，東經(jīng)100°～127°，是我國(guó)特有的珍稀木本油料作物[2]?？蓮奈墓诠手刑崛〉玫狡焚|(zhì)較高的食用油，文冠果果油含有豐富的人體不能自身合成的亞油酸、亞麻酸、二十碳烯酸等成分[3]。文冠果的果殼、葉片、莖枝、種皮、種仁均可入藥，曾列入1977 年版《中國(guó)藥典》，且作為蒙藥列入1984 年版《中國(guó)民族藥志》，主要用于治療風(fēng)濕病[4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)文冠果中含有豐富的玉蕊醇型三萜及皂苷類化學(xué)成分，其中，該成分在文冠果的果殼、果柄及種子中含量較高；另外，活性研究表明，此類皂苷具有顯著的抗腫瘤及抗阿爾茨海默病作用[5-7]。因此，通過開發(fā)高效的文冠果果殼總皂苷提取工藝，可為文冠果果殼的深入開發(fā)利用提供參考依據(jù)，并為玉蕊醇型皂苷的藥物篩選提供豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。

超聲細(xì)胞破碎法利用超聲分散破壞植物組織，能加速溶劑穿透組織的作用，提高樣品中有效成分的提?。涣硗猓谔崛∵^程中，可以利用冷凝裝置保持溫度的恒定，避免溫度升高對(duì)成分的破壞，具有高效節(jié)能、節(jié)約溶劑的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于龍葵多糖[8]、香蕉皮單寧[9]、甜菊多酚[10]等天然產(chǎn)物的提取。

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法對(duì)超聲細(xì)胞破碎法提取文冠果果殼總皂苷的工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在提供一種高效的文冠果果殼總皂苷的提取工藝。采用掃描電鏡對(duì)不同方式提取后的樣品粉末的形態(tài)進(jìn)行觀察，為不同提取工藝下總皂苷含量高低做出最直觀的科學(xué)解釋，并對(duì)優(yōu)化后的超聲細(xì)胞破碎法提取的總皂苷提取物的抗氧化、抗腫瘤作用進(jìn)行研究，為文冠果果殼中皂苷類物質(zhì)的生理活性研究提供理論支持，并為其廢棄物的充分開發(fā)利用提供實(shí)際的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

文冠果（X.sorbifoliumBunge）果殼（無霉變、無雜質(zhì)），采自遼寧朝陽；肺癌細(xì)胞A549 和肝癌細(xì)胞HepG2 為實(shí)驗(yàn)室保藏；齊墩果酸（標(biāo)準(zhǔn)品），上海阿拉丁生物化學(xué)科技有限公司；Trolox（標(biāo)準(zhǔn)品）、EDTA-2Na（標(biāo)準(zhǔn)品）、二苯基苦基苯肼自由基、2,2-聯(lián)氨-二-(3-乙基-苯并噻-6-磺酸)二胺鹽、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸，上海源葉公司；胎牛血清，美國(guó)Hyclone 公司；高糖DMEM，美國(guó)Gibco 公司；鏈霉素，美國(guó)Beyotime 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8，美國(guó)Dojindo 公司；胰蛋白酶EDTA，美國(guó)Gibco 公司；無水乙醇、甲醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸等均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

JY99-ⅡDN 超聲波細(xì)胞粉碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；Synergy HI 酶標(biāo)儀，美國(guó) BioTex Instruments 公司；SB-1300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛郎儀器有限公司；H2050R 高速冷凍離心機(jī)，廣州深華生物技術(shù)有限公司；S-4800 掃描電鏡，日本Hitachi 公司；KQ-3000TDE 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；102739-103Steri-Cycle CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Themo Electron 公司；HYC-950L-20 ℃冰箱，海爾集團(tuán)。

1.2 文冠果果殼總皂苷提取方法

1.2.1 超聲細(xì)胞破碎法

取1 g 文冠果果殼粉末，按液料比為35:1（mL/g）加入70%乙醇置于超聲細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行提取。超聲功率200 W、超聲時(shí)間35 min、超聲溫度50 ℃。分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間、超聲功率及超聲溫度對(duì)總皂苷提取得率的影響。

1.2.1.1 單因素試驗(yàn)

分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)及溶劑（60%、70%、80%、90%、無水乙醇、甲醇），液料比（20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1 mL/g），超聲時(shí)間（15、20、25、30、35、40 min），超聲功率（90、144、198、252、306、360 W）及超聲溫度（40、45、50、55、60、65 ℃）對(duì)總皂苷提取得率的影響。研究其中單一因素改變時(shí)，其他各因素固定的條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比35:1 mL/g、超聲時(shí)間35 min、超聲功率198 W、超聲溫度50 ℃。

1.2.1.2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以文冠果果殼中總皂苷得率作為響應(yīng)值，選取對(duì)果殼皂苷含量影響最大的液料比X1、乙醇體積分?jǐn)?shù)X2和超聲功率X3設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。在3 個(gè)水平上（-1、0、1）系統(tǒng)地確定了提取變量，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平編碼Table 1 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design

1.2.2 加熱回流法

取1 g 文冠果果殼粉末，按液料比為35:1（mL/g）加入φ=65%乙醇置于回流抽提器中，水浴加熱溫度90 ℃，回流提取3 次，每次35 min。將提取液離心（4 000 r/min，10 min），取上層溶液減壓濃縮至浸膏。將浸膏加正丁醇:水（V/V=1:1）萃取3 次，合并正丁醇層萃取液，減壓濃縮至膏狀，即得到文冠果果殼總皂苷。

1.2.3 常規(guī)超聲法

取1 g 文冠果果殼粉末，按液料比為35:1（mL/g）加入φ=65%乙醇置于超聲清洗器，其余方法同1.2.1。

1.2.4 掃描電鏡觀察

取適量提取后并曬干的文冠果果殼粉末，用雙面膠帶將其固定于樣品臺(tái)，進(jìn)行鍍膜處理后放置在掃描電鏡下觀察樣品形態(tài)。

1.3 文冠果果殼中總皂苷的含量測(cè)定

采用邱悅等[11]的香草醛-高氯酸比色法，并稍作修改。準(zhǔn)確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品6 mg，配置成0.12 mg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。量取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μL 于試管中，水浴揮干甲醇；加入新鮮配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.50 mL，高氯酸1 mL，于60 ℃恒溫水浴加熱15 min取出，流水冷卻，并在最佳波長(zhǎng)530 nm處測(cè)定吸光度。以齊墩果酸含量（X，mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=4.94x+0.12（R2=0.993 4）。取“1.2”項(xiàng)制備的文冠果果殼皂苷溶液50 μL 按標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)其吸光度值，計(jì)算出待測(cè)液的總皂苷含量，再通過公式（1）計(jì)算得到樣品中的總皂苷含量。

式中：

Y——樣品中總皂苷含量，mg/g;

c——待測(cè)液中總皂苷含量，mg/mL；

V——待測(cè)液總體積，mL；

m——文冠果果殼質(zhì)量，g。

1.4 抗氧化活性測(cè)定

將超聲細(xì)胞破碎法最佳工藝下提取的總皂苷提取物減壓濃縮，用無水乙醇配置成不同濃度的溶液。陽性對(duì)照Trolox（水溶性維生素E）用無水乙醇配置，EDTA-2Na 用去離子水配置。DPPH·清除能力測(cè)定參照Tsai 等[12]的方法；ABTS+·清除能力測(cè)定參照Luo等[13]的方法；Fe2+螯合能力測(cè)定參照Huang 等[14]的方法。

1.5 抗腫瘤活性測(cè)定

1.5.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

細(xì)胞活性的測(cè)定參照孟雪等[15,16]的方法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞從CO2培養(yǎng)箱取出，進(jìn)行消化，替換新的培養(yǎng)基并于37 ℃，φ=5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。按照空白對(duì)照組（牛血清）、藥物組（優(yōu)化后的文冠果果殼總皂苷提取物溶液20、40、60、80、100、120 μg/mL）加樣品處理，每組3 個(gè)復(fù)孔，每孔為1 mL。按上述處理方式孵育24 h 后，使用普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5.2 細(xì)胞活力測(cè)定

對(duì)空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組加樣品處理24 h 后，每孔加CCK-8 試劑100 μL，置于含有φ=5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中24 h。然后采用酶標(biāo)儀于450 nm 下測(cè)定OD值。以正常對(duì)照組OD 值為100%細(xì)胞活力，其余各組OD 值與正常對(duì)照組OD 值的比值為相對(duì)活力。以相對(duì)活力評(píng)價(jià)文冠果果殼總皂苷提取物對(duì)A549 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞增殖的抑制率。

式中：

C——細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，%；

OD450藥物——藥物組450 nm 下的OD 值；

OD450對(duì)照——細(xì)胞對(duì)照組450 nm 下的OD 值

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 23 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)行Duncan’s差異分析，以p＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 總皂苷提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)文冠果果殼總皂苷含量的影響

如圖1 所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%～100%時(shí)，總皂苷的含量先升高后降低，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)總皂苷得率為14.50 mg/g。乙醇與水的混合液可以破壞皂苷類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、糖類、果膠等物質(zhì)的結(jié)合鍵，有利于皂苷的提取[17]。用甲醇作提取溶劑時(shí)，總皂苷得率為13.20 mg/g，這說明大極性的甲醇也能夠提取獲得較大量的皂苷，但是得率還是低于φ=70%乙醇。這可能是因?yàn)橛眉状继崛r(shí)，沒有水的參與，只有甲醇與果殼細(xì)胞間的相互作用[18]。這與Escribano-Bailon[19]報(bào)道的結(jié)果類似。皂苷做為水溶性成分，在含水有機(jī)溶劑中有利于其從細(xì)胞中溶出，提高得率。因此，最佳提取溶劑為70%乙醇。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)及提取溶劑對(duì)文冠果果殼總皂苷含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration and extraction solvent on the total saponin yield from husk of X.sorbifolia

2.1.2 液料比對(duì)文冠果果殼總皂苷含量的影響

如圖2 所示，文冠果果殼總皂苷的得率先升高后降低。在液料比為20:1～35:1 時(shí)，隨著液料比不斷增加，總皂苷的含量不斷升高。這可能是由于溶劑的不斷增加，使其在超聲波作用下的分散系數(shù)和溶解細(xì)胞壁能力增強(qiáng)。當(dāng)液料比達(dá)到35:1 時(shí)，溶液的溶解度達(dá)到最大，總皂苷得率為13 mg/g。當(dāng)液料比超過35:1 時(shí)，總皂苷得率不斷下降。這可能是因?yàn)殡S著溶劑的增多，非皂苷類成分的溶出會(huì)影響皂苷的提取率。因此，最佳液料比為35:1。

圖2 液料比對(duì)文冠果果殼總皂苷含量的影響Fig.2 Effect of liquid material ratio on the total saponin yield from husk of X.sorbifolia

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)文冠果果殼總皂苷含量的影響

如圖3 所示，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，總皂苷的含量不斷升高。這可能是由于在一定的時(shí)間內(nèi)，果殼與溶劑能夠充分接觸，從而使皂苷在超聲波的作用下能最大程度地溶出至溶劑中。在超聲時(shí)間達(dá)到35 min 時(shí)，總皂苷的含量最高，為11.40 mg/g。但是，超聲時(shí)間超過35 min，總皂苷的含量會(huì)下降。這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的超聲波作用，使溶出的部分皂苷發(fā)生降解。因此，最佳超聲時(shí)間為35 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)文冠果果殼總皂苷含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the total saponin yield from husk of X.sorbifolia

2.1.4 超聲功率對(duì)文冠果果殼總皂苷含量的影響

如圖4 所示，文冠果果殼總皂苷的含量先升高后降低。提取功率為90～198 W 時(shí)，總皂苷含量隨超聲功率的增大而增加，這可能是由于超聲波傳質(zhì)能力的加強(qiáng)，不斷增強(qiáng)對(duì)果殼細(xì)胞的粉碎程度，促進(jìn)皂苷從細(xì)胞內(nèi)溶出。當(dāng)超聲功率超過198 W 時(shí)，總皂苷含量又呈下降趨勢(shì)，從14.45 mg/g 下降至6.36 mg/g。這可能是因?yàn)楣β试龃螅瑢?dǎo)致部分皂苷降解。因此，最佳超聲功率為198 W。

圖4 超聲功率對(duì)文冠果果殼總皂苷含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the total saponin yield from husk of X.sorbifolia

2.1.5 超聲溫度對(duì)文冠果果殼總皂苷含量的影響

如圖5 所示，在恒定的超聲功率下，超聲溫度在40～50 ℃時(shí)，隨著溫度的升高總皂苷的得率不斷增大，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致，升高溫度會(huì)提高溶質(zhì)的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)，促使小極性及含量低的皂苷也能溶解于提取溶劑中[20]。在超聲溫度為50 ℃時(shí)，總皂苷得率達(dá)到最大值12.02 mg/g。當(dāng)進(jìn)一步升高超聲溫度時(shí)，總皂苷含量呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)闇囟冗^高，改變了傳質(zhì)效率，導(dǎo)致皂苷結(jié)構(gòu)破壞。因此，最佳超聲溫度為50 ℃。

圖5 超聲溫度對(duì)文冠果果殼總皂苷得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the total saponin yield from husk of X.sorbifolia

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化法試驗(yàn)結(jié)果

以總皂苷得率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取液料比（X1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）及超聲功率（X3）進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2 所示。

根據(jù)Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法對(duì)文冠果果殼總皂苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以液料比X1、乙醇體積分?jǐn)?shù)X2和超聲功率X3為自變量，總皂苷含量（Y）為響應(yīng)值，得到文冠果果殼總皂苷得率的三因素三水平的結(jié)果如表 2 所示。二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=1.48-0.11X1-0.20X2+0.03X3-0.03X1X2+0.08X1X3-0.09X2X3-0.31X12-0.27X22-0.14X32。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

試驗(yàn)所選用模型F值（40.24）較高，p值較低（＜0.000 1），失擬項(xiàng)F值（p=0.662＞0.05）不顯著，決定系數(shù)R2值為0.981 0，校正系數(shù)Radj2為0.956 7。說明響應(yīng)值的變化有98.10%來源于所選變量，該方程的擬合情況較好，可以用來分析和預(yù)測(cè)文冠果果殼總皂苷得率的工藝參數(shù)[21]。通過F值分析，各因素對(duì)總皂苷含量的影響依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)及提取溶劑（X2）＞液料比（X1）＞超聲功率（X3）。

表3 回歸方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

由圖6a 可知，隨液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總皂苷含量顯示出先增大后減小的趨勢(shì)。在液料比為35:1（mL/g）左右、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%左右時(shí)，總皂苷含量達(dá)到最大值。液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用中坡度較為平坦，等高線圖近似圓形，影響不顯著。而乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)的曲線更陡峭，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)較液料比對(duì)文冠果果殼總皂苷含量影響更顯著，這與方差分析結(jié)果相符合。由圖6b 可知，隨著液料比和超聲功率的增加，總皂苷含量表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。在液料比為35:1（mL/g）左右，超聲功率為198 W 左右時(shí)，總皂苷含量達(dá)到最大值。液料比的曲面變化與超聲功率曲面相比，較為陡峭，說明液料比較超聲功率對(duì)文冠果果殼總皂苷含量影響更顯著。從等高線圖來看，其等高線圖近似橢圓，說明液料比和超聲功率對(duì)文冠果果殼總皂苷含量影響的交互作用較弱。由圖6c 可知，總皂苷含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲功率的增大先快速升高到最大值后緩慢下降，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%左右，超聲功率為198 W 左右時(shí)，總皂苷含量達(dá)到最大限度。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)的曲線變化更陡峭，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)較超聲功率對(duì)文冠果果殼總皂苷含量影響更顯著。此外，從曲面圖和等高線圖來看，其等高線圖呈明顯的橢圓形，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲功率之間交互作用較為顯著[22]。

圖6 兩因素交互作用對(duì)總皂苷提取量的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of ethanol concentration,solvent-to-solid ratio,and ultrasonic power on the extraction yield of total saponin from husk of X.sorbifolia

2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，考慮到實(shí)際性操作，將最優(yōu)工藝條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、液料比35:1（V/m）、超聲功率200 W、超聲時(shí)間35 min，進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)際總皂苷的含量為14.95 mg/g，而模型預(yù)測(cè)的總皂苷含量為15.26 mg/g，證明該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性較好[23]，具有一定的指導(dǎo)意義。

2.4 不同提取方法的總皂苷得率比較

本實(shí)驗(yàn)選取實(shí)驗(yàn)室常用的加熱回流法及常規(guī)超聲法，與優(yōu)化后得到的超聲細(xì)胞破碎法在同一工藝條件下進(jìn)行比較。結(jié)果表明，加熱回流法得到的總皂苷僅為5.95 mg/g，常規(guī)超聲法得到的總皂苷為10.72 mg/g，超聲細(xì)胞破碎法得到的總皂苷含量顯著高于其他兩種常規(guī)方法，分別是其2.51 倍和1.39 倍。圖7 是電鏡下不同提取方法所得文冠果果殼提取粉末的微觀結(jié)構(gòu)圖。

圖7 不同提取方法所得文冠果果殼提取粉末的掃描電鏡圖Fig.7 SEM of the extracted powder of husk of X.sorbifolia by different extraction methods

如圖7a，超聲細(xì)胞破碎法提取后的文冠果果殼粉末，細(xì)胞壁完全破裂，斷層及褶皺明顯；如圖7b，常規(guī)超聲法提取后的文冠果果殼粉末，其細(xì)胞壁雖有破裂，但鏈接密集度高；如圖7c，加熱回流法提取后的文冠果果殼粉末，細(xì)胞壁基本無破碎現(xiàn)象，細(xì)胞鏈接緊密。由此可見，超聲細(xì)胞破碎法的提取可以達(dá)到對(duì)樣品中所含物質(zhì)較為完全的獲取，是一種比較高效的活性物質(zhì)提取方法[24]。

2.5 總皂苷提取物抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.5.1 DPPH·清除能力測(cè)定結(jié)果

按照1.4 的方法進(jìn)行試驗(yàn)，總皂苷提取物對(duì)DPPH·清除能力的影響如圖8 所示。DPPH·是具有特征吸收的質(zhì)子自由基的化合物之一，在接觸自由基清除劑后，其吸收明顯減少。在與DPPH·相互作用時(shí)，抗氧化劑會(huì)將一個(gè)電子或一個(gè)氫原子轉(zhuǎn)移到DPPH·，從而中和它的自由基特性[25]。由圖8 可知，總皂苷提取物濃度為0.01～0.05 mg/mL 范圍內(nèi)時(shí)，DPPH·清除能力和總皂苷提取物質(zhì)量濃度呈顯著差異（p＜0.05）。對(duì)比陽性對(duì)照Trolox（96.22%），濃度為0.05 mg/mL 時(shí)，總皂苷提取物的DPPH·清除能力最強(qiáng)，清除率達(dá)到91.35%，其DPPH·清除率IC50值0.02 mg/mL。總皂苷提取物質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL 和0.05 mg/mL 時(shí)，兩者之間并無顯著性。齊國(guó)雨等[26]發(fā)現(xiàn)文冠果果殼提取物質(zhì)量濃度為0.75 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·清除率達(dá)97.25%，這可能是超聲細(xì)胞破碎法對(duì)文冠果果殼粉碎程度高，導(dǎo)致皂苷、多酚及色素等物質(zhì)的溶出量較大。

圖8 文冠果果殼總皂苷提取物DPPH·清除能力的測(cè)定結(jié)果Fig.8 Determination results of DPPH radical scavenging activity in husk of X.sorbifolia total saponins extraction

2.5.2 ABTS+·清除能力測(cè)定結(jié)果

按照1.4 的方法進(jìn)行試驗(yàn)，總皂苷提取物對(duì)ABTS+·清除能力的影響如圖9 所示。ABTS+·清除能力分析也是一種評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物抗氧化能力最常用的方法之一。由圖9 可知，總皂苷提取物質(zhì)量濃度為0.01～0.05 mg/mL 范圍內(nèi)時(shí)，ABTS+·清除能力與總皂苷提取物質(zhì)量濃度為極顯著差異（p＜0.01）。ABTS+·清除能力隨溶液濃度增加而增強(qiáng)，但都顯著低于陽性對(duì)照Trolox（99.62%）的清除率?？傇碥仗崛∥餄舛葹?.05 mg/mL，對(duì)ABTS+·最大清除能力為82.63%，其IC50值為0.01 mg/mL，說明超聲細(xì)胞破碎法得到的提取物中皂苷等有效組分的含量高。托盤根總皂苷提取物濃度為1 mg/mL 時(shí)，對(duì)ABTS+·清除能率為84.38%，其IC50值為0.28 mg/mL[27]。由此可見，總皂苷提取物質(zhì)量濃度對(duì)ABTS+·的形成具有明顯的抑制作用。

圖9 文冠果果殼總皂苷提取物ABTS+·清除能力的測(cè)定結(jié)果Fig.9 Determination results of ABTS+· scavenging activity in husk of X.sorbifolia total saponins extraction

2.5.3 Fe2+螯合能力測(cè)定結(jié)果

按照1.4 的方法進(jìn)行試驗(yàn)，總皂苷提取物對(duì)Fe2+螯合能力的影響如圖10 所示。金屬離子螯合劑可能通過穩(wěn)定Fe2+來抑制脂質(zhì)氧化[28]。由圖10 可知，總皂苷提取物質(zhì)量濃度為0.02～0.1 mg/mL 范圍內(nèi)時(shí)，F(xiàn)e2+螯合能力與總皂苷提取物質(zhì)量濃度為極顯著差異（p＜0.01）。濃度為0.1 mg/mL，總皂苷的Fe2+螯合能力達(dá)到最大值88.01%，其IC50值為0.02 mg/mL，但明顯弱于EDTA-2Na（93.62%）的Fe2+螯合能力。韋興英等[29]發(fā)現(xiàn)金屬離子的螯合能力與藜麥總皂苷提取物濃度呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明超聲細(xì)胞破碎法得到的提取物中皂苷分子中含有羥基、羧基，能夠起到較強(qiáng)的抗氧化效果[27]。

圖10 文冠果果殼總皂苷提取物Fe2+螯合能力的測(cè)定結(jié)果Fig.10 Determination results of Fe2+ reduction capacity in husk of X.sorbifolia total saponins extraction

2.6 總皂苷提取物抗腫瘤活性測(cè)定結(jié)果

2.6.1 肝癌HepG2 細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果

肝癌HepG2 細(xì)胞活力測(cè)定主要對(duì)總皂苷提取物作用于HepG2 細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞存活率進(jìn)行了分析，如圖11 所示。如圖11a 所示，從細(xì)胞存活率來看，CCK-8 試驗(yàn)結(jié)果顯示隨總皂苷提取物質(zhì)量濃度的升高，HepG2 細(xì)胞存活率逐漸降低，說明總皂苷提取物質(zhì)量濃度與細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性?？傇碥仗崛∥镔|(zhì)量濃度為100 μg/mL 和120 μg/mL 對(duì)HepG2 細(xì)胞的存活率為15.63%和10.95%，其作用于24 h 的IC50值為79.30 μg/mL，兩者無顯著差異。張志宇等[30]發(fā)現(xiàn)文冠果種仁對(duì)HepG2 細(xì)胞處理24 h 后的IC50為9.70 mg/mL，張富祿[31]發(fā)現(xiàn)文冠果果殼總總皂苷提取物質(zhì)量濃度為50 μg/mL 對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制率達(dá)到89.50%。從圖11b 結(jié)果來看，與對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞經(jīng)不同總皂苷提取物濃度處理后，其增殖受到明顯的抑制作用。對(duì)照組中HepG2 細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)良好，呈規(guī)則的圓形，細(xì)胞表面整體較為平滑[32,33]。隨著總皂苷提取物質(zhì)量濃度的增加（從20～120 μg/mL），HepG2細(xì)胞胞體出現(xiàn)坍塌，體積明顯收縮，細(xì)胞的數(shù)量明顯變少。這些結(jié)果表明果殼總皂苷提取物能明顯抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖11 文冠果果殼總皂苷提取物作用于HepG2 細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果Fig.11 Test results of husk of X.sorbifolia total saponins extraction acting on HepG2 cells

2.6.2 肺癌A549 細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果

肺癌A549 細(xì)胞活力測(cè)定主要對(duì)總皂苷提取物作用于A549 細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞存活率進(jìn)行了分析，如圖12所示。如圖12a所示，從細(xì)胞存活率來看，CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示隨總皂苷提取物質(zhì)量濃度升高，細(xì)胞存活率整體呈降低趨勢(shì)，細(xì)胞存活率與總皂苷提取物質(zhì)量濃度呈劑量依賴性。濃度為40 μg/mL～80 μg/mL 時(shí)，總皂苷提取物質(zhì)量濃度對(duì)A549 細(xì)胞抑制率尤為明顯，存活率顯著下降。質(zhì)量濃度為120 μg/mL，細(xì)胞存活率達(dá)到最低2.04%，其作用于24 h A549 細(xì)胞的IC50值為63 μg/mL。人參皂苷Rh2也可明顯抑制A549細(xì)胞增殖，其作用于24 h A549 細(xì)胞的IC50值為46.56 μg/mL[34]。從圖12b 顯微鏡觀察結(jié)果來看，與對(duì)照組相比，A549細(xì)胞經(jīng)不同總皂苷提取物質(zhì)量濃度處理后，其增殖受到明顯的抑制作用。對(duì)照組的A549 細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)為典型的上皮細(xì)胞樣，細(xì)胞狀態(tài)良好，呈立體的梭形，并且形成融合細(xì)胞集落[35]。隨著總皂苷提取物質(zhì)量濃度的增加（從20 μg/mL 至120 μg/mL），A549 細(xì)胞從細(xì)長(zhǎng)梭形逐漸皺縮變圓，細(xì)胞的數(shù)量明顯變少。當(dāng)總皂苷提取物質(zhì)量濃度達(dá)到最大的時(shí)候，細(xì)胞形態(tài)收縮變形，并伴有細(xì)胞數(shù)目的遞減。這些結(jié)果表明，果殼總皂苷提取物能明顯抑制A549 細(xì)胞的增殖[36]。

圖12 文冠果果殼總皂苷提取物作用于A549 細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果Fig.12 Test results of husk of X.sorbifolia total saponins extraction acting on A549 cells

3 結(jié)論

本研究采用超聲細(xì)胞破碎法對(duì)文冠果果殼總皂苷進(jìn)行提取，并在此基礎(chǔ)上評(píng)價(jià)其抗氧化及抗腫瘤效果。結(jié)果表明：通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化文冠果果殼總皂苷的提取工藝，同時(shí)輔以掃描電鏡，得到最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、液料比35:1（mL/g）、超聲功率200 W、超聲時(shí)間35 min、超聲溫度為50 °C，在此條件下，含量大小依次為超聲細(xì)胞破碎法（14.95 mg/g）＞常規(guī)超聲法（10.72 mg/g）＞加熱回流法（5.95 mg/g）；文冠果果殼總皂苷提取物具有良好的DPPH·、ABTS+·清除能力及Fe2+螯合能力，總皂苷提取物質(zhì)量濃度與ABTS+·清除能力及Fe2+螯合能力均呈極顯著差異（p＜0.01），與DPPH·清除能力呈顯著相關(guān)性（p＜0.05）。（3）文冠果果殼總皂苷提取物對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞和肺癌A549 細(xì)胞具有一定的抑制效果，總皂苷提取物質(zhì)量濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)率呈極顯著差異（p＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲細(xì)胞破碎法是一種高效的從文冠果果殼中獲得總皂苷的方法，成功開發(fā)了一種從廢棄資源中獲得具有豐富生物活性成分的提取方法；抗氧化、抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明文冠果果殼總皂苷提取物具有良好的抗氧化、抗腫瘤活性，具有開發(fā)成抗氧化劑和抗腫瘤藥物制劑的潛力。本文旨在促進(jìn)文冠果資源的充分利用及為其深入開發(fā)利用提供科學(xué)理論依據(jù)。