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        超聲輔助酶法提取咖啡果皮果膠工藝的優(yōu)化及其理化特性分析

        2023-01-12 03:45:02李澤林鄔文君高艷趙春燕范江平沈曉靜鄭婷婷
        現(xiàn)代食品科技 2022年12期
        關(guān)鍵詞:果膠果皮乳化

        李澤林,鄔文君,高艷,趙春燕,范江平,沈曉靜,2,3*,鄭婷婷

        (1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué),食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院/理學(xué)院,云南昆明 650201)(2.云南省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明醫(yī)科大學(xué),云南昆明 650500)(3.云南省有機(jī)茶產(chǎn)業(yè)智能工程研究中心,云南省高校智能有機(jī)茶園建設(shè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明 650201)(4.普洱茶研究院,云南普洱 665099)

        咖啡是世界三大飲料作物之一,是國際貿(mào)易中最重要的農(nóng)產(chǎn)品[1]。近年來,中國的咖啡消費(fèi)量快速增長,是潛在的世界咖啡貿(mào)易和消費(fèi)市場。云南種植的咖啡主要為小粒種咖啡,占全國咖啡豆產(chǎn)量的98.80%[2],因其獨(dú)特的氣候條件,所產(chǎn)的小??Х绕焚|(zhì)優(yōu)異,以普洱市、保山市、臨滄市和德宏州為主要種植區(qū)[3]。咖啡加工過程中會產(chǎn)生大量的咖啡果皮,這些果皮通常會被直接丟棄,只有小部分用于堆肥和制作咖啡果皮茶等再利用[4];被直接丟棄的咖啡果皮不僅造成資源浪費(fèi),而且在一定程度上還會對環(huán)境造成污染,因此對咖啡果皮進(jìn)行無害化處理或者再利用非常有必要[5]。研究報(bào)道顯示,咖啡果皮中含有25%~30%的果膠[6],從咖啡果皮中提取咖啡果膠,可達(dá)到分解咖啡果皮的效果,且產(chǎn)物對環(huán)境無污染,提取的果膠可用于開發(fā)新產(chǎn)品,如食品添加劑、制作面膜等,推動當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

        果膠是一種普遍存在于高等植物的酸性雜多糖,大多由α-1,4-糖苷鍵連接D-半乳糖醛酸殘基組成[7],以多聚半乳糖醛酸鏈構(gòu)成主鏈骨架,側(cè)鏈由中性糖連接而成[8]。果膠具有良好的抗氧化、抗炎癥、抗凝血、降脂、抑菌和免疫調(diào)節(jié)等生理和藥理活性作用,是天然的活性成分[9,10]。因上述結(jié)構(gòu)和功能特性,使其在工業(yè)生產(chǎn)、天然食品添加劑及功能食品的開發(fā)中得到了廣泛的應(yīng)用,具有較大的研究價(jià)值和發(fā)展前景[11,12]??Х裙z已被證明了有較好的抑菌作用[6],但是目前還尚未見到相關(guān)其起泡性、泡沫穩(wěn)定性、持水性和持油性等理化特性的研究報(bào)道;對咖啡果膠理化特性的深入研究可有助于其作為一種天然添加劑或者基料應(yīng)用在食品、工業(yè)、材料等領(lǐng)域,提高其經(jīng)濟(jì)和應(yīng)用價(jià)值。

        此外,目前咖啡果膠的提取以熱水和酸提取法為主,比較單一而且還鮮有研究報(bào)道超聲輔助酶提取咖啡果皮果膠。因此,本研究擬采用響應(yīng)面法優(yōu)化云南小??Х裙すz的最佳超聲輔助酶提取工藝條件,采用傅里葉紅外光譜(FT-IR)表征粗果膠官能團(tuán)組成;再經(jīng)純化后比較粗果膠和精果膠的理化特性。旨在為云南小粒咖啡果皮果膠的多元化提取、綜合利用和開發(fā)提供理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        云南小??Х龋ǖ倌贩N)果皮,購買自云南省保山市;纖維素酶(10 000 U/g),瑪雅試劑有限公司;透析袋MD34(7 000 u),上海源葉生物有限公司;AB-8大孔樹脂,河北美凱化工有限公司;三氯甲烷(AR),重慶川東化工有限公司;正丁醇(AR),廣東光華科技股份有限公司。

        1.2 儀器設(shè)備

        SCIENTZ-48 高通量組織研磨器,寧波新芝生物科技股份有限公司;DHG-9070A 電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;H3-18K 臺式高速離心機(jī),湖南可成儀器設(shè)備有限公司;RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;SCQ-9201B 超聲波提取儀,上海聲彥超聲波儀器有限公司。

        1.3 果膠的提取方法

        將咖啡果皮在45 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至含水率低于5%,打粉、過80 目篩,備用。準(zhǔn)確稱取120 g 咖啡果皮干粉加入3 000 mL 超純水中加入纖維素酶,調(diào)節(jié)pH值至4.9后水解90 min,沸水滅酶15 min,超聲15 min后過濾得到濾液,將浸提液旋蒸濃縮至原體積的1/3。加入等體積的乙醇,于4 °C 冰箱中冷藏,過夜醇沉、離心15 min(5 000 r/min),真空冷凍干燥后得到粗果膠,并按照公式(1)計(jì)算果膠得率。

        式中:

        G——果膠得率,%;

        m——果膠質(zhì)量,g;

        m0——咖啡果皮質(zhì)量,g。

        1.4 果膠提取單因素試驗(yàn)

        1.4.1 酶添加量對果膠得率的影響

        考察酶添加量對咖啡果皮中果膠得率的影響:固定pH 值4.9、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間90 min、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間15 min、超聲功率120 W 和料液比1:25,設(shè)置纖維素酶添加量分別為原材料的0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%,對果皮果膠進(jìn)行提取,計(jì)算果膠得率。

        1.4.2 酶解時(shí)間對果膠得率的影響

        考察酶解時(shí)間對咖啡果皮中果膠得率的影響:固定纖維素酶添加量1.5%、pH 值4.9、酶解溫度45 ℃、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間15 min、超聲功率120 W 和料液比1:25,設(shè)置酶解時(shí)間分別為6、30、60、90、120 min,對果皮果膠進(jìn)行提取,計(jì)算果膠得率。

        1.4.3 超聲時(shí)間對果膠得率的影響

        考察超聲時(shí)間對咖啡果皮中果膠得率的影響:固定纖維素酶添加量1.5%、pH 值4.9、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間1.0 h、超聲溫度50 ℃、超聲功率120 W 和料液比1:25,設(shè)置超聲時(shí)間分別為5、10、15、20、25 min,對果皮果膠進(jìn)行提取,計(jì)算果膠得率。

        1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

        在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,運(yùn)用Box-Benhnken 設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn),并以果膠得率為響應(yīng)指標(biāo)(%),詳情見表1。

        表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Response surface analysis factor level table

        1.6 紅外光譜表征

        準(zhǔn)確稱取粗果膠樣品1 mg,采用KBr 壓片法進(jìn)行檢測,在500~4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

        1.7 純化

        配制為1.5 mg/mL 的粗果膠溶液100 mL,添加7 g AB-8 大孔樹脂充分搖勻后,在55 ℃、130 r/min 的恒溫振蕩箱中振蕩5 h 脫色,過濾,濾液在50 ℃下減壓濃縮至原體積的一半[13-15];按Sevage 溶液(V氯仿:V正丁醇=4:1)為1/4 果膠液的比例加入Sevage 溶液后劇烈振蕩20 min 脫蛋白,4 000 r/min 離心,取上層水層,重復(fù)此步操作,直至沒有白色蛋白沉淀層產(chǎn)出為止。減壓濃縮去除有機(jī)溶劑,超純水透析48 h,真空冷凍干燥得到精果膠。

        1.8 理化指標(biāo)檢測

        參照Catalina 等[16]的方法,采用苯酚-硫酸法測定果膠的總糖含量。參照Antonela 等[17]的方法,采用福林酚比色法測定果膠的多酚含量。參照Ermias 等[18]的方法,采用考馬斯亮藍(lán)法測定果膠的蛋白質(zhì)含量和測定果膠的酯化度和乙?;?。含水量測定參考GB/T 5009.3-2016。

        1.9 理化特性檢測

        參照冀世敏等[19]的方法,測定果膠的理化特性。

        1.9.1 持水性的測定

        稱取0.1 g(m1)果膠樣品置于離心管中并稱重(m2),以1:20 質(zhì)量比的比例加入蒸餾水,攪拌30 min后于3 000 r/min 條件下離心10 min,倒去上清液記錄離心管和沉淀物的質(zhì)量(m3)。根據(jù)式(2)計(jì)算果膠的持水性(H,g/g)。

        1.9.2 持油性的測定

        稱取0.5 g(m1)果膠樣品置于離心管中并稱重(m2)。加5 mL純芝麻油,用玻璃棒攪均,于2 200 r/min條件下離心25 min,倒去上層液體記錄離心管和沉淀物的質(zhì)量(m3)。根據(jù)式(3)計(jì)算果膠的持油性(I,g/g)。

        1.9.3 起泡性與泡沫穩(wěn)定性的測定

        起泡性(FC)的測定:配制1%(m/V)的果膠樣品溶液120 mL,10 000 r/min 剪切2 min,然后立刻將溶液倒入量筒中,并記錄泡沫與液體的總體積(v0)。按式(4)計(jì)算FC。

        泡沫穩(wěn)定性(FS)的測定:將上述剪切后的溶液室溫靜置30 min 后,記錄沫與液體的總體積(v30),按照式(5)計(jì)算FS。

        1.9.4 乳化性與乳化穩(wěn)定性的測定

        乳化性的測定:配制0.2%(m/V)的樣品溶液120 mL于離心管中,加入60 mL 芝麻油,10 000 r/min 剪切60 s,于1 500 r/min 離心300 s 后靜置,記錄液體總高度(h,mm)和乳化層高度(h1,mm)。按式(6)計(jì)算乳化性(J)。

        乳化穩(wěn)定性的測定:將上述離心管置于85 ℃水浴鍋中加熱30 min,室溫靜置20 min,再次在離心機(jī)上用1 500 r/min 離心5 min,記錄此時(shí)的離心管中乳化層高度(h2,mm)及總高度(h3,mm)。按式(7)計(jì)算乳化穩(wěn)定性(K)。

        1.10 數(shù)據(jù)處理

        采用Microsoft Excel 2010 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件分析處理試驗(yàn)數(shù)據(jù),采用Design-expert 8.0.6 件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析;每組試驗(yàn)均重復(fù)三次,試驗(yàn)結(jié)果求平均值并以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。

        2 結(jié)果分析

        2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

        2.1.1 不同酶添加量對果膠得率的影響

        酶添加量對果膠得率的影響如圖1a 所示,隨著酶添加量的增加果膠得率增加,得率達(dá)到最大值(8.2%)時(shí),所需酶添加量為1.5%;當(dāng)酶添加量大于1.5%時(shí),果膠得率降低。當(dāng)酶添加量少于1.5%時(shí),酶活性較小對細(xì)胞壁的分解少,使果膠溶出量少;當(dāng)增加纖維素酶用量時(shí),由于纖維素酶分解破壞了咖啡果皮細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),使得咖啡果膠更易溶出,從而使果膠得率增加,但是隨著纖維素酶用量不斷增多,部分酶會相互附著在一起反而使酶的活性降低;同時(shí),本研究的纖維素酶由木霉發(fā)酵生產(chǎn),為多組分酶系含有的少量半乳糖醛酸酶和β-葡聚糖酶等酶,當(dāng)酶添加量增加時(shí)半乳糖醛酸酶積累可能會加速水解果膠鏈,使果膠得率降低[20]。所以,選擇酶添加量1.5%為最優(yōu)值。

        2.1.2 不同酶解時(shí)間對咖啡果膠得率的影響

        酶解時(shí)間對咖啡果膠得率的影響如圖1b 所示,在0~60 min 內(nèi)隨著酶解時(shí)間的增加果膠得率逐漸增大;當(dāng)酶解60 min 時(shí),果膠得率最高為15.45%,但之后隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)延長,果膠得率又呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。當(dāng)酶解時(shí)間過短時(shí),酶解作用不充分果膠未能完全溶出,隨著酶解時(shí)間延長,纖維素酶作用時(shí)間增長反應(yīng)充分進(jìn)行,果膠得率達(dá)到最大值,但隨著酶解時(shí)間的增加,果膠長時(shí)間在酸性和45 ℃條件下其分子會被破壞導(dǎo)致果膠內(nèi)部糖醛酸鏈發(fā)生斷裂,引起果膠分解從而使得率降低[21]。所以,選擇酶解時(shí)間60 min時(shí)為最優(yōu)值。

        2.1.3 不同的超聲時(shí)間對咖啡果膠得率的影響

        超聲時(shí)間對咖啡果膠得率的影響如圖1c 所示,超聲時(shí)間在5~15 min 之間果膠的得率隨超聲時(shí)間延長而增大,當(dāng)超聲時(shí)間為15 min 時(shí),果膠得率最高為18.1%。在超聲超過15 min 后得率下降,這可能是因?yàn)槌暡ň哂袕?qiáng)力的機(jī)械切割作用,長時(shí)間的作用可能使果膠被破壞,從而減少得率。所以,選擇超聲時(shí)間15 min時(shí)為最優(yōu)值。

        圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The results of single factor experiments

        2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

        2.2.1 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

        果膠提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

        表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

        由表3 回歸分析和方差分析結(jié)果可知,該回歸模型顯著(p<0.05);在各響應(yīng)因素中,二次項(xiàng)A2的p值小于0.01,表明該因素對粗果膠得率有極顯著的影響。交互項(xiàng)BC、二次項(xiàng)B2、C2的p值小于0.05,表明B(酶解時(shí)間)和C(超聲時(shí)間)的交互作用以及二次項(xiàng)B2、C2對粗果膠得率影響顯著。

        表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 3 Regression statistical analysis results

        模型的失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05),說明實(shí)際值與預(yù)測值之間無過度擬合,表明方程擬合性好,實(shí)驗(yàn)誤差小。根據(jù)各因素顯著水平,結(jié)合F值大小可以判斷各單因素對粗果膠得率影響程度的主次順序?yàn)镃(超聲時(shí)間)>A(酶添加量)>B(酶解時(shí)間)。以酶添加量(A)、酶解時(shí)間(B)、超聲時(shí)間(C)為自變量,咖啡粗果膠得率為因變量,對各組合處理得到的咖啡粗果膠得率進(jìn)行二次回歸分析,建立多元二次響應(yīng)面回歸模型:果膠得率=-55.91+66.74A+0.78B-1.29C-0.03AB-0.39AC-0.02BC-19.13A2-3.74E-0.03B2+0.11C2。

        2.2.2 交互作用分析

        響應(yīng)面圖的弧度與等高線圖的密集程度反映了各因素作用的大小。各個因素的交互作用對響應(yīng)值的影響可通過等高線圖直觀的反映出來,等高線圖的形狀可以反映出各因素交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,橢圓形的等高線圖表明兩因素的交互作用對果膠得率的影響作用顯著,當(dāng)?shù)雀呔€圖呈現(xiàn)圓形時(shí),則表明兩因素之間的交互作用不顯著[22,23]。但隨著酶解時(shí)間的增大果膠得率緩慢增大,在達(dá)到最大值后逐漸降低;隨著超聲時(shí)間的增加果膠得率先迅速升高到最大值,之后迅速降低,如圖2c 所示,酶解時(shí)間和超聲時(shí)間的等高線圖更接近橢圓形,說明酶解時(shí)間(B)和超聲時(shí)間(C)的交互作用顯著(p<0.05),交互作用分析結(jié)果與方差分析表中的結(jié)果相一致。

        圖2 各因素交互作用對果膠得率影響的三維曲面和等高線Fig.2 Three-dimensional surface plot and contour map of the interactive effects extraction yield of pectin

        2.2.3 最佳工藝條件的預(yù)測與模型驗(yàn)證

        根據(jù)以上模型得到最佳咖啡果膠提取工藝條件:纖維酶添加量1.49%,酶解時(shí)間45.78 min,超聲時(shí)間19.30 min,理論上得到咖啡果膠得率為16.43%。在此條件下進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)驗(yàn)證,得到實(shí)際的咖啡粗果膠得率為16.42%與模型理論值相接近且無顯著差異,證明該數(shù)學(xué)模型優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)具有可行性和重現(xiàn)性。

        2.3 紅外光譜結(jié)果分析

        對優(yōu)化提取的粗果膠進(jìn)行傅里葉紅外光譜測定,結(jié)果如圖3 所示,在3 375 cm-1處有一個很明顯的果膠多糖特吸收峰是由O-H 鍵伸縮振動造成[24,25];2 927 cm-1處的較弱吸收峰是由甲基的C-H 鍵的伸縮振動造成[26];在1 616 cm-1、1 425 cm-1處的吸收峰則分別由于C=O 和C=C 基團(tuán)的對稱伸縮振動造成的,是羧基的特征峰[27,28];碳水化合物的C-O、C-C-H、C-C 和OCH基團(tuán)在1 336 cm-1、1 248 cm-1、1 149 cm-1、1 105 cm-1、1 016 cm-1附近會有伸縮振動,而且1 010~1 150 cm-1范圍內(nèi)是阿拉伯半乳聚糖的特征峰[29],本研究結(jié)果在1 105 cm-1、1 016 cm-1處也檢測到了特征吸收峰。結(jié)果表明,使用超聲輔助酶提取的咖啡粗果膠含有典型的多糖結(jié)構(gòu)。

        圖3 咖啡粗果膠的FT-IRFig.3 FT-IR of crude coffee pectin

        2.4 咖啡果膠理化指標(biāo)檢測結(jié)果

        進(jìn)一步對咖啡粗果膠和脫色、脫蛋白后精果膠的理化指標(biāo)進(jìn)行對比,結(jié)果由表4 可知,精果膠的得率僅為粗果膠的22.20%,說明果膠在純化過程中的損失較大,是因?yàn)槊摰鞍走^程中Sevage 試劑在使蛋白質(zhì)變性沉淀的同時(shí)正丁醇會使部分果膠沉淀造成損失,且脫蛋白次數(shù)越多果膠的損失越多[30,31];精果膠的總糖含量達(dá)到了75.83%,較純化前增加了17.51%;粗果膠中多酚和蛋白的含量為6.09%和0.17%,純化后分別下降到1.68%和0.13%,下降了72.41%和23.53%,其中多酚的減少是因?yàn)榧兓^程中氧化和受熱分解造成的;粗果膠含水量為6.32%,純化后增加到了12.09%,增加了91.30%,原因可能咖啡果膠屬于多糖的一種,多醣具有一定的持水能力,純化之后精果膠總糖含量增加,所以持水能力增強(qiáng),含水量也就增大;粗果膠酯化度和乙?;确謩e是31.77%和17.43%,純化后分別下降到7.17%和1.54%,下降了77.43%和91.16%,一個原因可能是中溫提取不能鈍化內(nèi)源酶,在提取過程中引起的,另一個原因可能是粗果膠的檢測時(shí)伴有雜質(zhì)干擾造成的,且由于酯化度與果膠甲酯酶活性呈負(fù)相關(guān),可能純化過程中在果膠的內(nèi)源甲酯酶的作用下,導(dǎo)致的果膠酯化度降低[30,31];以上結(jié)果表明,咖啡果膠是一種低酯果膠,純化增加了咖啡果膠的純度,但是還可以使用其他方法進(jìn)一步純化。

        表4 咖啡果膠理化指標(biāo)(%)Table 4 Physicochemical characterization of coffee pectin

        2.5 咖啡果膠理化特性測試結(jié)果

        果膠是水溶性多糖,具有較強(qiáng)的親水和親油性;由表5 可知,咖啡粗果膠也檢測到具有一定程度的持水性、持油性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性和乳化性、乳化穩(wěn)定性。果膠經(jīng)純化后這些理化特性發(fā)生了改變,其中持水性增加了4.70 倍,原因可能是果膠是親水性大分子聚合物,經(jīng)純化后果膠內(nèi)部有更多親水基團(tuán)暴露使其持水性增大;持油性增加了52.25%,原因可能是果膠中含有一定量的水分,在攪拌過程中形成了乳液造成的;純化之后果膠的起泡性和泡沫穩(wěn)定性消失,原因是脫蛋白導(dǎo)致果膠純度增加,果膠體系的黏度也隨著增加,而泡沫結(jié)構(gòu)中薄層液體的排出速度隨著其黏度增加而降低,最終導(dǎo)致起泡性消失[32];純化后果膠黏度增加的同時(shí)也增加了參與乳化作用的基團(tuán)數(shù)量,使其乳化性和乳化體系穩(wěn)定性也隨著增加[33],相比于粗果膠分別增加了26.31%和9.64%。

        表5 咖啡果膠中功能特性測試結(jié)果Table 5 Test results of functinal characteristics in coffee pectin

        3 結(jié)論

        采用超聲波輔助酶提取咖啡果皮粗果膠得到最佳提取條件為:纖維素酶添加量1.49%,酶解時(shí)間45.78 min,超聲時(shí)間19.30 min,得到咖啡果膠實(shí)際得率為16.43%;咖啡粗果膠含有典型的多糖結(jié)構(gòu);純化使果膠總糖含量增加了17.51%,多酚和蛋白質(zhì)含量減少了72.41%和23.53%含水量為增加了91.30%,酯化度和乙?;确謩e下降了77.43%和91.16%;而且,純化可以增加咖啡果膠的持水性、持油性、穩(wěn)定性和乳化性、乳化穩(wěn)定性,但是會降低果膠的起泡性、泡沫穩(wěn)定性。本研究可為云南小??Х裙さ木C合利用和其果膠結(jié)構(gòu)特性和理化特性研究提供前期基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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