韓坤宸，竇君霞，黃國宏，于曉涵，廖艷婷，張欽任，宋瑤，馬金克，李全陽*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004）（2.泰山職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)工程系，山東泰安 271000)（3.廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣西南寧 530226）

腸道微生物作為“被遺忘的器官”，可參與體內(nèi)能量平衡和代謝過程，并對改善機(jī)體炎癥和免疫功能，調(diào)節(jié)機(jī)體健康狀態(tài)起著重要作用[1]。過去的研究表明，腸道菌群失調(diào)與肥胖、心血管疾病、過敏性疾病、炎癥性腸病等疾病密切相關(guān)[2,3]。因此，穩(wěn)定腸道菌群的平衡對改善機(jī)體健康狀態(tài)十分重要。飲食是影響腸道菌群組成的決定性因素之一。研究表明，即便短期飲食習(xí)慣的改變也可對腸道微生物產(chǎn)生很大影響。Cancello 等[4]的研究表明15 d 的低熱量地中海飲食可降低腸道中的促炎菌屬豐度，增加與“瘦”相關(guān)分類菌屬的豐度；Bonder 等[5]發(fā)現(xiàn)4 周的無麩質(zhì)飲食可以改變健康志愿者的腸道微生物組成。已有較多的研究試圖通過飲食干預(yù)的手段來調(diào)節(jié)腸道菌群失衡，改變機(jī)體的健康狀態(tài)。地中海飲食可增加代謝綜合癥患者糞便菌群中參與調(diào)控胰島素水平的菌屬，從而有效改善心血管疾病[6]；能量限制飲食可有效降低機(jī)體C 反應(yīng)蛋白（C-Reactive Protein，CRP）水平，影響微生物組成和豐度，繼而改善機(jī)體代謝[7]。然而，受限于不同國家和地區(qū)主要作物和飲食習(xí)慣差異，高依從性地遵循某種飲食并在全球推廣難度極大，且有關(guān)報道很少。因此，著眼于本土地區(qū)健康飲食開展研究所得成果，對幫助當(dāng)?shù)厝巳壕S持機(jī)體健康狀態(tài)更具實用價值。

本著“問計于百歲老人，求健康長壽”的初心，多年來，本團(tuán)隊聚焦廣西地區(qū)百歲老人，進(jìn)行了大量膳食方面的調(diào)查和研究，構(gòu)建了廣西長壽飲食模式，又從飲食的角度對百歲老人長壽的成因進(jìn)行了多方面的探索和研究。在對廣西長壽地區(qū)百歲老人的飲食及代謝物特征、腸道菌群等方面研究后，得知其飲食模式以膳食纖維多糖為主，具有高膳食纖維、高維生素A、低能量、低脂肪、低蛋白質(zhì)、低膽固醇的特征[8,9]。之后本團(tuán)隊又分別用D-半乳糖致衰老小鼠和自然衰老小鼠，從小鼠抗氧化損傷、認(rèn)知能力與代謝組學(xué)等方面逐步對構(gòu)建的廣西長壽飲食模式進(jìn)行了驗證優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的創(chuàng)新飲食模式具有明顯的降低炎癥、延緩衰老的作用[10-12]。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，試圖從腸道菌群的視角，對既有飲食模式的益生作用進(jìn)行闡釋，并通過分析飲食干預(yù)所引起的腸道菌群變化評估科學(xué)飲食對機(jī)體健康的有益作用，以期為豐富我國膳食營養(yǎng)與抗衰老理論體系提供基礎(chǔ)支持。

1 材料與方法

1.1 志愿者招募

篩選志愿者時，納入標(biāo)準(zhǔn)為：身體狀態(tài)穩(wěn)定；未長期服用且干預(yù)前一個月未服用影響免疫系統(tǒng)的藥物和抗生素；實驗前兩周內(nèi)未食用益生元、益生菌或維生素；對所涉及的食材均無過敏現(xiàn)象。經(jīng)過篩選，共有15 名志愿者參與了研究，并被告知試驗中涉及的內(nèi)容和潛在風(fēng)險，簽署了書面知情同意書。在飲食干預(yù)過程中，一名志愿者因依從性差而提前退出，故共有14 名志愿者（年齡50～75 歲）完成了整個研究，其中7 名男性，7 名女性。研究方案獲得廣西大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（No.GXU-2020-136）。

1.2 志愿者膳食調(diào)查

在廣西長壽飲食干預(yù)前，參考王芳等[9]的方法，采用半定量膳食頻率調(diào)查問卷法（Food Frequency Questionnaire，F(xiàn)FQ）分析了解志愿者的日常膳食攝入狀況。調(diào)查內(nèi)容包含23 種食物及食物組合。志愿者的食物攝入量計算方法為：

式中：

S——食物攝入量，g/d；

D——攝入頻率，次；

J——每次進(jìn)食量，g；

Z——進(jìn)食周期，d。

1.3 儀器與設(shè)備

Qubit 熒光定量儀，美國Invitrogen 公司；Agilent 2100 bioanalyzer，美國安捷倫公司；MiSeq 測序儀，美國Illumina 公司。

1.4 方法

1.4.1 廣西長壽飲食的優(yōu)化

本研究在團(tuán)隊前期工作的基礎(chǔ)上，結(jié)合《中國居民膳食指南2016 版》，《中國老年人膳食指南2010》和《廣西居民膳食營養(yǎng)與健康狀況報告》中各營養(yǎng)素推薦量，在能量、脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物和膳食纖維攝入量上對廣西長壽飲食模式進(jìn)行了設(shè)計和優(yōu)化。其中：能量攝入以膳食指南推薦量為基礎(chǔ)，結(jié)合團(tuán)隊前期動物實驗的優(yōu)化驗證結(jié)果計算得出[10]。膳食纖維攝入量參考前期動物實驗中的最佳劑量，結(jié)合對百歲老人的飲食調(diào)查結(jié)果設(shè)定[8,12]。蛋白質(zhì)，脂肪，碳水化合物的攝入量均基于百歲老人飲食特點(diǎn)[8]，結(jié)合《廣西居民膳食營養(yǎng)與健康狀況報告》和膳食指南推薦量優(yōu)化設(shè)計，分別占能量攝入的15%、25%和60%。

每位志愿者的營養(yǎng)素攝入量要根據(jù)前期調(diào)查和測量得到的性別、體重、身體活動水平等信息而進(jìn)行針對性地設(shè)計。在設(shè)計過程中，以BMI=21.25（18.5～24.0的中位數(shù)）為標(biāo)準(zhǔn)，以《中國居民膳食指南2016 版》，《中國老年人膳食指南2010》中推薦的不同性別、年齡、體力活動所需要的能量為基礎(chǔ)，根據(jù)廣西長壽飲食模式的設(shè)計要求，確定其總能量的攝入量。蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和膳食纖維攝入量在能量的基礎(chǔ)上根據(jù)廣西長壽飲食模式中所設(shè)計的各營養(yǎng)素攝入量計算而得。對于每一位志愿者，在同性別、年齡、身體活動水平所需能量的基礎(chǔ)上，設(shè)計所攝入的能量以其基礎(chǔ)代謝率與標(biāo)準(zhǔn)BMI 下比值作為系數(shù)進(jìn)行計算。同時，對于肥胖志愿者（BMI＞28），設(shè)定了0.95 的肥胖系數(shù)以控制其總能量攝入。據(jù)此，14 名志愿者在飲食干預(yù)期間的日平均攝入各營養(yǎng)素量如表1 所示。飲食干預(yù)期間志愿者所攝入的食物是基于所設(shè)定的廣西長壽飲食模式中的營養(yǎng)素量，根據(jù)百歲老人飲食習(xí)慣和廣西長壽地區(qū)的特色食物，參考《中國食物成分表標(biāo)準(zhǔn)版》凝練細(xì)化而來。食材主要選擇當(dāng)?shù)胤N植的季節(jié)性水果、蔬菜、谷物和肉類。所有食材都經(jīng)過精確計量。

表1 飲食干預(yù)期間志愿者平均每日所攝入營養(yǎng)素量Table 1 Average daily nutrient intake of volunteers during dietary intervention

1.4.2 飲食干預(yù)方法

志愿者在飲食干預(yù)前被要求保持至少兩周穩(wěn)定的習(xí)慣性飲食，之后再接受為期2 周高依從性的廣西長壽飲食模式干預(yù)。在廣西長壽飲食模式干預(yù)前后分別采集志愿者的糞便樣品并進(jìn)行腸道菌群檢測，具體實驗流程如圖1 所示。在飲食干預(yù)期間，志愿者所攝入的所有食物均由本團(tuán)隊提供，包括早餐、中餐、晚餐和水果等。且要求志愿者除自由飲水外，不再食用其他任何食物。此外，所有志愿者都被要求在飲食干預(yù)期間保持穩(wěn)定的身體活動水平。在整個過程中特別注意與志愿者保持溝通，了解其依從情況并幫助其隨時解決出現(xiàn)的問題。

圖1 樣品采集時間流程圖Fig.1 Illustration of sample collection time series

1.4.3 糞便樣品的采集及DNA 的提取

采集志愿者在廣西長壽飲食干預(yù)前和干預(yù)后的新鮮糞便樣本，將其立刻放入保溫冰盒并盡快轉(zhuǎn)存在-80 ℃冰柜中。按照說明，使用MagPure Stool DNA KF kit B 試劑盒（Magen）提取糞便中細(xì)菌的總DNA，并使用Qubit 熒光儀對DNA 定量，用1%（m/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA 的質(zhì)量。

1.4.4 16S rDNA 文庫構(gòu)建及測序

采用簡并PCR 引物341F（5’-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3’）擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA 基因V3-V4 可變區(qū)。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 3min；94 ℃ 30 s → 56 ℃ 45 s→ 72 ℃ 45 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物用AmpureXP 磁珠純化。文庫經(jīng)Agilent 2100 bioanalyzer質(zhì)檢合格后，按照Illumina 的標(biāo)準(zhǔn)流程在Illumina MiSeq 平臺上測序，產(chǎn)生2×300 bp 的雙端序列。

1.4.5 生物信息學(xué)分析

對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾去雜，采用FLASH（v1.2.11）軟件將去雜后的雙端序列拼接成高質(zhì)量的Tags，并使用UCHIME（v4.2.40）檢測過濾序列中的嵌合體。使用UPARSE 軟件（v7.0.1090）將序列相似度大于97%的tags 聚類為操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）。對比Greengenes 數(shù)據(jù)庫（v121305），利用RDP classifier 對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，設(shè)置最小置信閾值為0.60。使用MOTHUR（v1.31.2）軟件在OTU 水平上計算飲食干預(yù)前后腸道菌群的α多樣性。腸道菌群的β多樣性用于比較飲食干預(yù)前后的菌群結(jié)構(gòu)差異，以主坐標(biāo)分析（Principal Coordinate Analysis Biplots，PCoA）表示。此外，基于分類學(xué)信息，在門、屬等水平上進(jìn)行飲食干預(yù)前后腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成和差異性分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結(jié)果表示為。對于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用配對樣本t 檢驗，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用配對的Wilcoxon 非參數(shù)檢驗，顯著性水平為p＜0.05。冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）用來探究飲食與腸道菌群之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 志愿者飲食干預(yù)前后膳食攝入狀況

2.1.1 飲食干預(yù)前后志愿者膳食結(jié)構(gòu)分析

為充分體現(xiàn)廣西長壽飲食干預(yù)前后志愿者飲食結(jié)構(gòu)的整體變化，基于志愿者的飲食情況構(gòu)建了包含所有志愿者及其飲食信息的Heatmap 圖（圖2）。干預(yù)前志愿者的飲食信息來自對其飲食調(diào)查問卷的具體數(shù)據(jù)，形象展示了志愿者的習(xí)慣性飲食狀況。干預(yù)期間志愿者的飲食是在廣西長壽飲食模式的指導(dǎo)下，結(jié)合志愿者情況個性化設(shè)計而得。圖2 中縱坐標(biāo)表示志愿者飲食中平均每日各食物種類攝入量的對數(shù)值，橫坐標(biāo)表示廣西長壽飲食干預(yù)前后的志愿者樣本。彩色坐標(biāo)軸由藍(lán)色向紅色過度，表示志愿者平均每日攝入該類食物的數(shù)量逐漸遞增。由圖2 可知，在飲食干預(yù)前，入選的志愿者平均每日攝入食物以粥和稀飯、深色蔬菜、水果類、米飯為主（平均攝入量＞200 g/d），淺色蔬菜類、無餡類食物、家畜肉類次之（平均攝入量＞60 g/d），而對加工肉類、油炸類食物、糕點(diǎn)類食物等攝入量較低（平均攝入量＜10 g/d），還發(fā)現(xiàn)個別志愿者表現(xiàn)出對飲料類的高劑量攝入（平均攝入量＞400 mL/d）。在飲食干預(yù)期間，為志愿者設(shè)計的飲食所依據(jù)的長壽飲食模式多源自廣西長壽地區(qū)百歲老人飲食喜好，表現(xiàn)出與其較為一致的粥類、深色蔬菜類為主的特點(diǎn)[9]（平均攝入量＞500 g/d）。同時，飲食中包含較大量的水果類、薯類食物（平均攝入量＞180 g/d），對于粗雜糧類食物也有較多的攝入（平均攝入量＞75 g/d），而對乳制品、油炸類食物、加工肉類等食物則基本不涉及。謝琪等[13]對廣西長壽家庭進(jìn)行飲食調(diào)查后，亦發(fā)現(xiàn)長壽老人日常飲食中富含蔬菜，主食相對粗雜，谷薯類食物攝入較多，且基本不攝入乳制品，本研究中所設(shè)計飲食富含的食物種類與其對長壽老人的飲食調(diào)研結(jié)果較為一致。

圖2 飲食干預(yù)前后志愿者飲食結(jié)構(gòu)熱圖Fig.2 Heatmap of dietary pattern of volunteers before and after dietary intervention

2.1.2 飲食干預(yù)前后志愿者食物攝入量對比分析

為了進(jìn)一步對比廣西長壽飲食與志愿者習(xí)慣性飲食期間攝入食物的差別，本研究分析了志愿者在飲食干預(yù)前后各類食物的攝入量，結(jié)果如圖3 所示。在飲食干預(yù)期間，志愿者平均攝入蔬菜類（876.79 g/d）、水果類（387.72 g/d）、粗雜糧類（78.48 g/d）、蛋類食物量（65.74 g/d）較志愿者在習(xí)慣性飲食期間551.21 g/d、218.88 g/d、33.83 g/d、38.16 g/d 相比顯著升高（p＜0.05）。乳制品（0 g/d）、海鮮類（12.28 g/d）食物的平均攝入量則顯著低于志愿者習(xí)慣性飲食期間的攝入量66.51 g/d、33.29 g/d（p＜0.05）。同時，高碳水化合物類食物（971.01 g/d）、肉類（68.20 g/d）、豆制品（35.45 g/d）的平均攝入量相比志愿者習(xí)慣性飲食期間的平均攝入量1 130.22 g/d、84.63 g/d、52.45 g/d 也較低，然而這種差異并不顯著（p＞0.05）。通過對比分析，清晰地呈現(xiàn)了廣西長壽飲食模式中包含的主要食物種類及攝入量，突出了與志愿者習(xí)慣性飲食相比，廣西長壽飲食模式的主要特征。同時，與現(xiàn)存的健康飲食，如地中海飲食[14]比較來看，廣西長壽飲食模式立足于當(dāng)?shù)厥巢模嬍持懈缓攀忱w維，具有高水平蔬菜、水果、粗雜糧攝入，且摒棄了橄欖油，紅酒等食物的攝入，更符合國人飲食習(xí)慣，易于依從并推廣。

圖3 飲食干預(yù)前后志愿者各類食物每日平均攝入量比較Fig.3 Daily intakes of various type foods of volunteers before and after dietary intervention

2.2 廣西長壽飲食模式對人體腸道菌群的影響

2.2.1 飲食干預(yù)前后腸道菌群的物種豐富度和α多樣性分析

收集志愿者飲食干預(yù)前后的糞便樣品共28 份，經(jīng)MiSeq 平臺測序分析后，根據(jù)物種數(shù)量所測得稀釋曲線如圖4a 所示。稀釋曲線可用來判定測序數(shù)據(jù)的合理性，由圖4a 可知，在本研究中，當(dāng)測序深度至10 000 時，所有糞便樣品的稀釋曲線趨于平坦，這表明測序量合理，所得測序結(jié)果可靠[15]。同時，使用豐度等級曲線來表現(xiàn)每個樣本中腸道微生物的豐度和均勻性（圖4b）。其中，曲線的水平跨度越寬，表明樣本所含物種相對豐度越高，而曲線的平滑度則可有效反映物種的均勻性[16]。由圖4b 可知，飲食干預(yù)前后志愿者腸道微生物豐富度和均勻性整體差異較小。

圖4 飲食干預(yù)前后腸道菌群的稀釋曲線和豐富等級曲線Fig.4 Rarefaction curve and OTU rank-abundance curve of gut microbiota before and after dietary intervention

廣西長壽飲食模式對志愿者腸道菌群α多樣性的影響如表2 所示。α多樣性可有效量化比較腸道菌群的豐度和物種多樣性。其中，Coverage 作為測序深度指數(shù)，與樣本覆蓋率相關(guān)。本研究中所有樣本的Coverage均大于0.99，表明測序深度已基本覆蓋樣本中所有序列。Chao1 指數(shù)和Ace 指數(shù)可反映腸道菌群的豐度，Shannon 和Simpson 指數(shù)可反映腸道菌群的多樣性[17]。由表2 可知，飲食干預(yù)后志愿者腸道菌群的Chao1 指數(shù)、Ace 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均未發(fā)生顯著變化，表明短期的廣西長壽飲食干預(yù)未顯著改變腸道菌群的豐富度和多樣性。與本研究結(jié)果一致的是，Kohnert 等[18]的研究發(fā)現(xiàn)盡管短期的飲食干預(yù)改變了健康志愿者腸道菌群的組成，但未改變其腸道菌群的α多樣性；Willis 等[19]通過對15 項飲食干預(yù)研究薈萃分析，結(jié)果表明對健康志愿者進(jìn)行5 d 至24 周的全植物性食物的飲食干預(yù)亦未對α多樣性產(chǎn)生影響。這可能是因為成人腸道菌群整體多樣性相對穩(wěn)定，故短期的飲食干預(yù)對其α多樣性的影響較小。

表2 廣西長壽飲食干預(yù)前后腸道菌群的α多樣性分析Table 2 α diversity analysis of gut microbiota before and after dietary intervention

2.2.2 飲食干預(yù)前后腸道菌群的β多樣性分析

為了進(jìn)一步區(qū)分飲食干預(yù)前后志愿者腸道菌群的整體分布狀況，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行了PCoA 分析。未加權(quán)的UniFrac 分析可用于定性測量，通過計算系統(tǒng)發(fā)育樹中分支長度的比例來比較不同組別的群落距離，所得結(jié)果如圖5a 所示，兩組志愿者的樣品在PCoA 圖中分布較為一致，未明顯分開。加權(quán)的UniFrac 分析可在對樣品定性測量的同時，考慮每種類型生物的相對豐度，揭示由菌群豐度變化而導(dǎo)致的群落差異。對兩組樣品再次分析，所得結(jié)果如圖5b 所示，飲食干預(yù)前后志愿者樣品在PCoA 圖中分布仍較為聚集，β多樣性未發(fā)生顯著改變。這可能是由于飲食干預(yù)時間較短所致。毛丙永等[20]用復(fù)合益生菌對志愿者進(jìn)行短期的干預(yù)，未改變菌群結(jié)構(gòu)分布；Li 等[21]對志愿者進(jìn)行三周的蒙古飲食干預(yù)后，亦未改變其腸道菌群的PCoA 聚類模式，本研究的結(jié)果與其一致。

圖5 飲食干預(yù)前后志愿者腸道菌群的PCoA 主坐標(biāo)分析圖Fig.5 The PCoA analysis of gut microbiota of volunteers before and after dietary intervention

2.2.3 飲食干預(yù)前后腸道菌群門水平差異分析

為了評估廣西長壽飲食模式對腸道菌群的具體影響，本研究統(tǒng)計分析了在不同分類水平上腸道微生物優(yōu)勢菌群的相對豐度。志愿者門水平的腸道菌群組成如圖6a 所示。其中，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）為志愿者糞便樣品中的主要優(yōu)勢菌群，分別占比56.20%、22.37%、14.70%和6.04%。同時，對比飲食干預(yù)前后志愿者腸道菌群門水平結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，盡管TM7 在腸道菌群中占比很小，然而，在飲食干預(yù)后其相對豐度發(fā)生了顯著改變（圖6b），由0.05%降低至0.01%（p＜0.05）。TM7 屬于糖化細(xì)菌，是一種新發(fā)現(xiàn)的候選細(xì)菌，在機(jī)體內(nèi)，TM7 已被證明可參與炎癥性粘膜疾病的發(fā)生，與腸道炎癥正相關(guān)，且TM7的富集還會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)[22]。故飲食干預(yù)后TM7豐度的降低可能對志愿者腸道炎癥的改善具有積極影響。與本研究一致的是，Choi 等[23]的研究發(fā)現(xiàn)短期的水果和蔬菜汁干預(yù)可使腸道菌群中TM7 的豐度顯著降低，由于廣西長壽飲食模式中富含蔬菜和水果，因此，這可能是飲食干預(yù)后志愿者腸道菌群中TM7 相對豐度顯著降低的原因。

圖6 腸道菌群在門水平中物種相對豐度變化及TM7 相對豐度變化Fig.6 Changes of gut microbiota at the phylum level and the relative abundance of TM7

飲食干預(yù)后志愿者腸道菌群門水平上的其他菌群組成也發(fā)生了變化，如表3 所示。盡管無統(tǒng)計學(xué)顯著性，相比飲食干預(yù)前，14 名志愿者中有8 名志愿者（約占57.14%）糞便樣品中變形菌門豐度有所下降。研究表明，變形菌門豐度易受飲食等環(huán)境因素影響，其豐度的持續(xù)增加會導(dǎo)致腸道菌群的不平衡，且可能與慢性炎癥等疾病相關(guān)，可作為引發(fā)機(jī)體疾病的前兆和潛在診斷特征[24]。因此，廣西長壽飲食干預(yù)后志愿者變形菌門相對豐度在一定程度上的降低，可能對志愿者的腸道菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，機(jī)體健康狀況的改善有著積極影響。此外，Méndez-Salazar 等[24]的研究表明變形菌門的相對豐度與脂肪攝入量正相關(guān)，在廣西長壽飲食期間，志愿者肉類攝入較少，且蔬菜、水果攝入量較高，整體脂肪攝入量較習(xí)慣性飲食相比較低，故認(rèn)為變形菌門豐度的降低可能與此有關(guān)。De Filippo 等[25]的研究亦表明低脂肪，高膳食纖維的飲食與低豐度的變形菌門水平相關(guān)，本研究結(jié)果與其一致。此外，由于厚壁菌門和擬桿菌門的豐度在腸道中所占比例很大，因此，厚壁菌門和擬桿菌門豐度的比值（F/B）也可以很好的反映腸道菌群結(jié)構(gòu)在門水平上的變化。盡管在飲食干預(yù)后，腸道菌群中F/B 在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異，然而，由表2 可知，在飲食干預(yù)后，14 名志愿者中有9 名（約64.29%）志愿者F/B 值有所降低。與本研究一致的是，Pagliai 等[26]對志愿者進(jìn)行短期的純素食干預(yù)后，亦未發(fā)現(xiàn)飲食對厚壁菌門和擬桿菌門豐度比值造成顯著影響，但較飲食干預(yù)前相比有所降低。已有報道表明，厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度比值的降低與機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)的改善相關(guān)[27]，同時，厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度比值的增加與機(jī)體肥胖，罹患炎癥性腸病，便秘等多種疾病有關(guān)[28]。因此，飲食干預(yù)后，厚壁菌門與擬桿菌門豐度比值的降低在一定程度上表明了廣西長壽飲食對腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)和對宿主健康狀態(tài)的改善具有積極作用。此外，Rishi 等[29]的研究表明富含高纖維、高維生素的飲食可以有效降低腸道菌群中厚壁菌門和擬桿菌門豐度的比值，本研究所得結(jié)果可能與廣西長壽飲食模式中包含此特征相關(guān)。

表3 變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門相對豐度及F/BTable 3 Relative abundance of Proteobacteria,Firmicutes,Bacteroidetes and F/B

2.2.4 飲食干預(yù)前后腸道菌群屬水平差異分析

飲食干預(yù)前后志愿者腸道菌群相對豐度較大的前22 種菌屬如圖7a 所示，箭頭表示與飲食干預(yù)前相比菌群豐度的變化趨勢。其中，18 個屬的相對含量大于1%。在飲食干預(yù)前，糞便中埃希菌屬（Escherichia）所占比例最大（14.00% ），其次為柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium，7.80%），擬桿菌屬（Bacteroides，7.38%），普雷沃菌屬（Prevotella，6.78%），芽殖菌屬（Gemmiger，6.21%），羅氏菌屬（Roseburia，6.07%），瘤胃球菌屬（Ruminococcus，5.67%）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium，5.41%）。

對比飲食干預(yù)前后志愿者腸道菌群屬水平相對豐度發(fā)現(xiàn)，糞球菌屬（Coprococcus），瘤胃球菌屬，埃希菌屬和巨單胞菌屬（Megamonas）的相對豐度發(fā)生了顯著變化（p＜0.05）。其中，糞球菌屬豐度顯著升高（由1.04%增至1.39%），瘤胃球菌屬（由5.61%降至2.51%），埃希菌屬（由13.41%降至9.02%）和巨單胞菌屬（由4.06%降至0.04%）豐度顯著降低（圖7b～7e）。糞球菌屬已被證明對短鏈脂肪酸的合成有積極作用，且其豐度的增加可抑制體內(nèi)有害菌的生長，從而緩解腸道炎癥，改善腸道菌群失調(diào)[30]。研究表明，短期的純素飲食干預(yù)即可增加志愿者糞球菌屬水平，而富含肉類的飲食干預(yù)則可導(dǎo)致其豐度降低[18]。由此推測，飲食干預(yù)后糞球菌屬豐度的增高可能與飲食中富含蔬菜相關(guān)。瘤胃球菌屬豐度已被證實與LDL-c 水平正相關(guān)，且其豐度與動脈粥樣硬化病變程度顯著相關(guān)[31]。Gurung 等[32]的研究表明瘤胃球菌屬豐度與糖尿病和炎癥也呈正相關(guān)關(guān)系。而高纖維飲食可以通過有效降低腸道菌群中可能的促炎菌屬豐度，顯示出逆轉(zhuǎn)腸道促炎性生態(tài)失調(diào)的潛力。此外，瘤胃球菌屬豐度的增加也被證明與低水平的水果攝入有關(guān)[33]。廣西長壽飲食期間，志愿者水果攝入量較高，且飲食中富含膳食纖維，這可能與瘤胃球菌屬的降低相關(guān)。埃希菌屬作為革蘭氏陰性菌屬，可能會增加血清內(nèi)毒素水平，從而引起炎癥反應(yīng)。同時，研究表明，細(xì)胞壁脂多糖作為內(nèi)毒素的主要成分，可引起高脂血癥和內(nèi)臟器官中脂肪的積累[34]。因此，飲食干預(yù)后埃希菌屬豐度的降低可能與機(jī)體炎癥和血脂水平的改善相關(guān)。巨單胞菌屬豐度被證明與膽固醇水平正相關(guān)[35]，在百歲老人腸道菌群中也發(fā)現(xiàn)了較低水平的巨單胞菌屬豐度[36]。因此，飲食干預(yù)后巨單胞菌屬豐度的降低可能與改善機(jī)體膽固醇水平，降低志愿者心血管疾病風(fēng)險相關(guān)。Pisanu 等[37]的研究發(fā)現(xiàn)地中海飲食干預(yù)降低了志愿者瘤胃球菌屬和巨單胞菌屬的豐度，這可能與飲食中纖維和谷物攝入較多，紅肉攝入較低有關(guān)，本研究與其結(jié)果一致。

圖7 腸道菌群屬水平的變化及差異菌屬相對豐度比較Fig.7 Changes of gut microbiota at the genus level and comparison at the relative abundance of difference genus

此外，在飲食干預(yù)后，柔嫩梭菌屬、擬桿菌屬和羅氏菌屬豐度也發(fā)生了變化，如表4 所示。相比飲食干預(yù)前，飲食干預(yù)后14名志愿者中有10名（約71.42%）志愿者柔嫩梭菌屬豐度有所增加，整體來看，其相對豐度由7.80%增至11.92%，無統(tǒng)計學(xué)顯著性（p＞0.05）?，F(xiàn)有研究報道認(rèn)為，柔嫩梭菌屬中包含產(chǎn)生丁酸鹽的細(xì)菌，且對下調(diào)炎癥因子、維持結(jié)腸健康方面有積極作用[38]。且已有研究表明柔嫩梭菌屬豐度與低脂飲食相關(guān)[39]，這可能是飲食干預(yù)后柔嫩梭菌屬豐度增加的原因。同時，飲食干預(yù)后9 名（約64.29%）志愿者腸道菌群中擬桿菌屬有所增加（p＞0.05）。研究表明，富含谷物和蔬菜的飲食可通過提供多糖促進(jìn)擬桿菌屬豐度的增加，Koopen 等[40]通過對志愿者進(jìn)行地中海飲食干預(yù)后，亦發(fā)現(xiàn)腸道菌群中擬桿菌屬豐度有所增加，這與本研究所得結(jié)果較為一致。此外，在飲食干預(yù)后，14 名志愿者中有8 名志愿者（約57.14%）糞便樣品中羅氏菌屬豐度有所升高，相比飲食干預(yù)前，其平均豐度由6.07%增至7.93%，無統(tǒng)計學(xué)顯著性（p＞0.05）。羅氏菌屬可在機(jī)體內(nèi)參與分解糖，產(chǎn)生丁酸，它的增多與高膳食纖維攝入相關(guān)[41]，Haro 等[42]的研究表明羅氏菌屬的豐度升高還與胰島素敏感性增加相關(guān)，可能對預(yù)防和治療糖尿病有一定的作用。綜合廣西長壽飲食對腸道菌群在屬水平上的影響結(jié)果分析，表明廣西長壽飲食模式對優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，降低志愿者心血管疾病風(fēng)險，調(diào)節(jié)機(jī)體健康狀態(tài)有重要作用。

表4 柔嫩梭菌屬、擬桿菌屬、羅氏菌屬相對豐度Table 4 Relative abundance ofFaecalibacterium,Bacteroides andRoseburia

2.2.5 腸道菌群多級物種差異性判別分析

為了進(jìn)一步確定飲食干預(yù)對志愿者腸道菌群顯著改變的關(guān)鍵菌落，根據(jù)線性判別分析效應(yīng)值（Linear Discriminant Analysis Effect Size，LEfSe）評估了測序信息，設(shè)定線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）值為4.0 時，所得結(jié)果如圖8 所示。與飲食干預(yù)后相比，飲食干預(yù)前腸球菌科（Enterococcaceae）、腸球菌屬（Enterococcus）、埃希菌屬、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和巨單胞菌屬的相對豐度較高（LDA＞4.0）。Tian 等[43]的研究表明短期的膳食纖維干預(yù)可顯著降低腸球菌屬的豐度。此外，在純素食主義的人群中發(fā)現(xiàn)了較低水平的埃希菌屬[44]。廣西長壽飲食中包含較多的水果、蔬菜，較志愿者習(xí)慣性飲食相比攝入膳食纖維含量較高，攝入肉類和油脂較少，故飲食中脂肪含量較低，這可能是飲食干預(yù)后腸球菌屬和埃希菌屬降低的原因?？死撞暇鷮倏稍谀c道環(huán)境不佳時大量滋生，其豐度與高碳水化合物的攝入相關(guān)，高豐度的克雷伯氏菌屬還會引發(fā)機(jī)體炎癥，與細(xì)菌性肺炎，脊柱炎密切相關(guān)[45]。在廣西長壽飲食干預(yù)期間，志愿者所食用高碳水化合物類食物較少，故飲食干預(yù)后志愿者克雷伯氏菌屬豐度的降低應(yīng)該與此相關(guān)，這也表明了廣西長壽飲食具有改善機(jī)體炎癥水平的潛力。Beam 等[46]的研究也證實了高脂肪飲食會導(dǎo)致腸桿菌科，埃希菌屬，克雷伯氏菌豐度較高，這與本研究結(jié)果一致。巨單胞菌屬降低的結(jié)論與其在屬水平上豐度的顯著降低一致，這可能與降低志愿者心血管疾病風(fēng)險密切相關(guān)。

圖8 飲食干預(yù)前后腸道菌群的LDA 判別圖Fig.8 LDA score of gut microbiota before and after dietary intervention

2.2.6 RDA 分析飲食對腸道菌群的影響

為了進(jìn)一步探究廣西長壽飲食對腸道菌群結(jié)構(gòu)的具體影響，選取廣西長壽飲食模式中與志愿者習(xí)慣性飲食每日平均攝入量具有明顯差異的食物種類作為環(huán)境變量，應(yīng)用Envfit 函數(shù)來判斷食物種類與腸道菌群屬水平相對豐度之間的關(guān)系（999 次置換循環(huán)檢驗）。所得RDA 結(jié)果歸結(jié)于圖9。其中，箭頭的長度代表該食物種類的重要性。RDA1 和RDA2 占食物種類與腸道菌群組成之間相關(guān)性的49.67%和25.55%。結(jié)果表明：腸道菌群的組成變化與蔬菜類食物的每日平均攝入量相關(guān)性最高（r2=0.89，p＜0.01），其次為水果、牛奶、雞蛋、粗雜糧（r2＞0.60，p＜0.01），比較而言，腸道菌群的變化與海產(chǎn)品相關(guān)性較差，但仍十分顯著（r2=0.59，p＜0.01）。結(jié)合本研究結(jié)果分析，飲食中蔬菜的日攝入量可能對腸道菌群在屬水平相對豐度的影響最大。與本研究一致的是，Koponen 等[47]使用同樣的方法評估食物成分與腸道菌群關(guān)聯(lián)時，亦發(fā)現(xiàn)在所有飲食成分中，富含高纖維的蔬菜是影響腸道菌群最重要的因素。這些結(jié)果進(jìn)一步分析了飲食中對腸道菌群影響密切的食物種類，也為剖析飲食影響腸道菌群的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

圖9 飲食與腸道菌群關(guān)系的RDA 分析Fig.9 RDA analysis of diet and gut microbiota

3 結(jié)論

本研究通過分析志愿者在高依從地遵循廣西長壽飲食模式干預(yù)前后腸道菌群的變化，探究了飲食對腸道微生物的影響及廣西長壽飲食模式對人體腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明：廣西長壽飲食模式顯著降低了腸道微生物中TM7 的豐度，且促進(jìn)了糞球菌屬的增殖，同時顯著抑制了埃希菌屬、瘤胃球菌屬和巨單胞菌屬的生長。LEfSe 多級物種差異判別分析表明，飲食干預(yù)后腸球菌科、腸球菌屬、埃希菌屬、克雷伯氏菌屬和巨單胞菌屬的相對豐度有所降低。冗余分析表明志愿者每日攝入食物中，蔬菜的日平均攝入量與腸道菌群組成的相關(guān)性最高。結(jié)合飲食對腸道菌群的影響分析，認(rèn)為廣西長壽飲食干預(yù)所引起的腸道菌群變化可能對改善機(jī)體炎癥、降低心血管疾病風(fēng)險、維持機(jī)體健康狀態(tài)具有積極作用。這些結(jié)果有力地證明了廣西長壽飲食模式對人體腸道菌群的有益影響，也為進(jìn)一步探究通過飲食干預(yù)調(diào)節(jié)腸道菌群，促進(jìn)機(jī)體健康長壽的成效機(jī)制提供了理論依據(jù)。