李鶴賓，王楊，銀小倩，胡青松，吳婷，朱艷冰*

（1.廈門醫(yī)學院藥學系，福建廈門361023）（2.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建廈門 361021）

昆布多糖（Laminarin）是一種水溶性天然多糖，主要來源于海帶（Laminaria digitata）等褐藻細胞，是褐藻的重要貯藏多糖，約占其干重35%[1,2]。昆布多糖是一種帶有β-1,6-側鏈的線性β-1,3-葡聚糖分子，其結構特征隨藻類不同而存在差異[3]。昆布多糖可作為糖化和發(fā)酵后生物燃料生產的初始物質，屬于可再生生物質[4]。昆布多糖的降解產物具有抗氧化、抗凝血、抗細胞凋亡和抗腫瘤等生物活性，具有廣泛的應用前景[5-7]。目前已有許多方法應用于昆布多糖降解，例如光催化降解[8]、γ射線輻射降解[9]和酶水解[10]。由于酶法降解具有專一性強、效率高、反應條件溫和、產物易于控制，且最大限度地減少對糖分子修飾等特點，成為昆布多糖降解的優(yōu)選方法。

昆布多糖酶（EC 3.2.1.39）又稱為內切β-1,3-葡聚糖酶，是一種專一性水解β-1,3-葡聚糖中的β-1,3-糖苷鍵的酶類[11]。昆布多糖酶來源廣泛，包括細菌、真菌、植物和軟體動物等，其中微生物是該酶的重要來源。植物來源昆布多糖酶主要歸屬于糖苷水解酶17 家族（GH17），而細菌來源昆布多糖酶主要歸屬于GH16。目前已經報道的產昆布多糖酶的微生物包括強烈熾熱球菌（Pyrococcus furiosus）[12]、類芽孢桿菌（Paenibacillussp.）[13]、纖維化纖維菌（Cellulosimicrobium cellulans）[14]、海洋紅嗜熱菌（Rhodothermus marinus）[15]、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）[16]、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）[17]等。

在前期研究中，從腐爛海帶中分離到海洋微泡菌ALW1（Microbulbifersp.ALW1）[18,19]，該菌株的全基因組分析顯示，基因Lam128A預測編碼昆布多糖酶，本文進行微泡菌昆布多糖酶Lam128A 的克隆表達、酶學性質及酶解產物的抗氧化活性研究，為昆布多糖酶Lam128A 和昆布寡糖的進一步開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

海洋細菌Microbulbifersp.ALW1、E.coliDH5α、Pichia pastorisGS115 以及pPIC9K 質粒均為本實驗室保藏。10 kDa 的超濾離心管為Millipore 公司產品；TaqDNA 聚合酶、T4DNA 連接酶、dNTPs、NotI、EcoR I、BCA 蛋白質測定試劑盒為TaKaRa 公司產品；質粒DNA 小量純化試劑盒購自天根生化科技有限公司；DEAE-Sephrose Fast Flow 陰離子交換樹脂為GE Healthcare 公司產品；昆布多糖、普魯蘭多糖、可溶性淀粉、木聚糖購于Sigma-Aldrich 公司；石耳葡聚糖購于ELICITYL-OligoTech 公司；其余化學試劑均為分析純級產品。

1.2 主要儀器與設備

Avanti J-25 冷凍離心機，美國Beckman 公司；Epoch2T 微量酶標儀，美國BioTek 公司；冷凍干燥機，美國Thermo Fisher Scientific 公司；恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 昆布多糖酶Lam128A 的序列分析

利用ExPASy 中的ProtParam 工具對昆布多糖酶Lam128A 的DNA 和蛋白質序列、理論分子量和等電點等理化性質進行預測分析。采用信號肽預測工具SignalP v4.1 對昆布多糖酶的信號肽進行預測。在碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzyme，CAZy）數據庫中尋找不同家族來源的特征昆布多糖酶的蛋白質序列，利用MEGA7.0 構建微泡菌昆布多糖酶Lam128A 的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 昆布多糖酶Lam128A 的克隆及其在畢赤酵母中的表達

以微泡菌ALW1 的基因組為模板，利用正向引物Lam128A-F（5'-ATTTGCGGCCGCTATGACTGCAGTG CAACCC-3'，下劃線為NotI 位點）和反向引物Lam128A-R（5'-CCGGAATTC GCGATTGCGGATTTTG TCC-3'，下劃線為EcoRI 位點）擴增昆布多糖酶Lam128A 基因，將目的基因克隆到pPIC9K 載體中，并經測序驗證DNA 序列后，利用畢赤酵母GS115 細胞表達目的蛋白。將含有昆布多糖酶Lam128A 基因的畢赤酵母GS115 接種于YPD 種子培養(yǎng)基（20 g/L 胰蛋白胨、10 g/L 酵母提取物、20 g/L 葡萄糖、pH 值6.0）中，30 ℃、220 r/min 培養(yǎng)18 h。將菌液按1%接種量接入BMGY 培養(yǎng)基（20 g/L 蛋白胨、10 g/L 酵母提取物、100 mmol/L 磷酸鉀、1.34 g/L YNB、4×10-5%生物素、10%甘油，pH 值6.0）中，30 ℃、220 r/min 進行培養(yǎng)，當OD600達到3.0～5.0 時，靜置使菌體沉降。棄去上清，加入100 mL BMMY 培養(yǎng)基（20 g/L 蛋白胨、10 g/L 酵母提取物、100 mmol/L 磷酸鉀、1.34 g/L YNB、4×10-5%生物素、0.5%甲醇，pH 值6.0）重懸菌體，繼續(xù)進行培養(yǎng)（30 ℃、220 r/min）。每隔24 h，按體積比0.5%向培養(yǎng)基中加入甲醇，進行昆布多糖酶的誘導表達。培養(yǎng)7 d 后，4 ℃條件下8 000×g離心20 min，獲得的上清液即為昆布多糖酶的粗酶液。

1.3.3 重組昆布多糖酶（rLam128A）的分離純化

利用10 ku 的超濾膜對粗酶液樣品進行濃縮，濃縮液經50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 值7.0）透析后，上樣于DEAE-Sephrose Fast Flow 陰離子交換層析柱（1.5×10 cm）。用相同緩沖液以1 mL/min 的流速進行流洗，待流出液的OD280趨近于零后，用含0.05～1.0 mol/L NaCl 的50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 值7.0）緩沖液以1 mL/min 的流速對結合蛋白進行線性洗脫。在280 nm 處監(jiān)測洗脫液，并進行昆布多糖酶的活力測定，收集有酶活性的樣品，并利用50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 值7.0）進行透析。利用BCA 蛋白質測定試劑盒測定樣品的蛋白質濃度，并進行SDS-PAGE 分析。

1.3.4 昆布多糖酶的活力測定

采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定昆布多糖酶的活力[20]。取450 μL 濃度5 mg/mL 昆布多糖底物溶液（溶于50 mmol/L 醋酸鹽緩沖液，pH 值5.5），加入50 μL 昆布多糖酶（0.5 mg/mL），于45 ℃條件下反應30 min 后，加入500 μL DNS 試劑，沸水浴處理10 min 后，在540 nm 處測定反應液的吸光值。在上述條件下，每分鐘水解底物產生1 μmoL 還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量為1 個酶活力單位（U）。

1.3.5 重組昆布多糖酶的底物特異性分析

以5 mg/mL 的昆布多糖、普魯蘭多糖、可溶性淀粉、木聚糖和石耳葡聚糖為底物來測定酶的活力，研究酶對不同類型糖苷鍵的水解能力。分別將50 μL 酶溶液（0.5 mg/mL）加入450 μL 相應底物溶液（溶于50 mmol/L 醋酸鹽緩沖液，pH 值5.5），45 ℃反應30 min后，利用DNS 法測定酶的活力。

1.3.6 溫度對重組昆布多糖酶活性和穩(wěn)定性的影響

以5 mg/mL 昆布多糖為底物，測定不同溫度（25～65 ℃）下rLam128A 的活力，以最高酶活力為100%，研究酶的最適反應溫度。將rLam128A 置于不同的溫度（25～60 ℃）下處理1 h，測定酶的殘余活力，以未經熱處理的酶活力為 100%，研究溫度對rLam128A 穩(wěn)定性的影響。

1.3.7 pH 值對重組昆布多糖酶活性和穩(wěn)定性的影響

配制不同pH 值的緩沖液：50 mmol/L 醋酸鹽緩沖液（pH 值3.0～6.0）、50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 值6.0～7.0）、50 mmol/L Tris-HCl（pH 值7.0～9.0）、50 mmol/L甘氨酸-NaOH（pH 值9.0～11.0），在不同pH 值條件下測定酶的活力，以最高酶活力為100%，研究昆布多糖酶rLam128A 的最適反應pH 值。將昆布多糖酶rLam128A 在不同pH 值條件下（pH 值3.0、5.0、11.0）、25 ℃處理120 h，每隔24 h 檢測昆布多糖酶rLam128A的殘余酶活力，以未處理的酶活力為100%，研究pH值對昆布多糖酶rLam128A 穩(wěn)定性的影響。

1.3.8 重組昆布多糖酶的動力學參數測定

用50 mmol/L 醋酸鹽緩沖液（pH 值5.5）配制濃度為0～18 mg/mL 的昆布多糖溶液，將昆布多糖酶rLam128A 分別與不同濃度的昆布多糖反應，測定酶的活力。利用Lineweaver-Burk 雙倒數作圖法，計算昆布多糖酶rLam128A 的最大反應速度（Vmax）與米氏常數（Km）。

1.3.9 化學試劑對重組昆布多糖酶穩(wěn)定性的影響

將昆布多糖酶rLam128A 分別利用終濃度為1 mmol/L 或10 mmol/L 的不同金屬離子、終濃度為2 mmol/L 或10 mmol/L 的金屬螯合劑乙二胺四乙酸（EDTA）和還原試劑二硫蘇糖醇（DTT）、終濃度為0.2%（m/V或V/V）或2%（m/V或V/V）的去垢劑[Triton X-100、Tween 20、Tween 80、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）]、終濃度為2 mol/L或5 mol/L 的變性劑尿素，在25 ℃處理1 h 后，測定rLam128A 的殘余酶活力，以未經化學試劑處理的酶活力為100%，研究化學試劑對rLam128A 穩(wěn)定性的影響。

1.3.10 酶解產物的制備及抗氧化活性研究

利用50 mmol/L 醋酸鹽緩沖液（pH 值5.5）配制10 mg/mL 的昆布多糖溶液，100 mL 底物溶液中加入2.6 U 重組昆布多糖酶，40 ℃反應12 h，用沸水浴處理10 min。4 ℃條件下8000×g離心20 min，利用10 ku的超濾離心管對所得上清液樣品進行濃縮，收集濾過液，冷凍干燥至粉末。參考Zhu[18]等的方法，對酶解產物清除DPPH 自由基、ABTS 自由基、·OH 自由基的能力及酶解產物的還原能力進行測定，研究酶解產物的抗氧化活性。

1.3.11 數據處理

每組試驗設置3 次平行，數據應用Excel 軟件計算平均值，利用SPSS Statistics V17.0 軟件進行差異顯著性分析（p＜0.05）。

2 結果與討論

2.1 微泡菌昆布多糖酶Lam128A 的序列分析

微泡菌ALW1的昆布多糖酶Lam128A基因的開放閱讀框由1545 bp 組成，編碼具有514 個氨基酸的蛋白質，預測的理論分子質量為54.46 ku，理論pI 值為4.16。1-23 個氨基酸殘基預測為信號肽。系統(tǒng)進化分析顯示，Lam128A 與Lentinula edodes來源的昆布多糖酶（BAL27560.1）在同一分支（圖1），后者是GH128家族的代表，說明本研究的微泡菌昆布多糖酶歸屬于GH128 家族。

2.2 昆布多糖酶Lam128A 的體外表達與底物特異性

利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對表達蛋白進行檢測，重組昆布多糖酶rLam128A 的大小在70 ku 左右（圖2a），大于理論預測值，可能是由于蛋白質的糖基化修飾。酶的底物特異性分析顯示，微泡菌rLam128A 除了對昆布多糖（β-1,3，β-1,6）有較好的水解性能外，對普魯蘭多糖（α-1,4，α-1,6）、可溶性淀粉（α-1,4）、木聚糖（β-1,4）和石耳葡聚糖（β-1,6）底物的水解效果不明顯（圖2b）。rLam128A 對上述多糖的活性譜表明，rLam128A 主要作用于含有β-1,3-糖苷鍵的昆布多糖，表明其是一種β-1,3-葡聚糖酶。rLam128A 的底物特異性與Flavobacteriumsp.來源的昆布多糖酶相似[21]，但與來自Vibrio.campbellii的昆布多糖酶不同，后者對海帶二糖（β-1,3）有強烈的偏好，但也催化纖維二糖（β-1,4）和龍膽二糖（β-1,6）[22]。

圖2 昆布多糖酶Lam128A 的體外表達（a）及底物特異性（b）Fig.2 Expression of laminarinase Lam128A (a) and its substrate specificity (b)

2.3 重組昆布多糖酶的酶學性質

測定不同溫度下rLam128A 的活力，發(fā)現酶的最適反應溫度為45 ℃（圖3a）。該酶在25～45 ℃處理1 h后，殘余酶活性在95%以上；在50 ℃處理1 h 后，酶活力保留39.37%（圖3b）。rLam128A 與來自Arca inflata的昆布多糖酶類似[23]，在55 ℃下失活（表1）；而S.cerevisiae來源的昆布多糖酶只在小于37 ℃的情況下穩(wěn)定[24]（表1）；Aplysia kurodai來源的昆布多糖酶AKLam33 在45 ℃下溫浴15 min 后，殘余酶活力僅剩50%[25]（表1）。在不同pH 值緩沖液中測定昆布多糖酶的活力，酶的最適反應pH 值為5.5（圖3c）。4 ℃條件下，分別在pH 值3.0、5.0 和11.0 條件下處理96 h 后，殘留酶活力仍有60%以上（圖3d），說明在強酸和強堿環(huán)境下，微泡菌rLam128A 的pH 穩(wěn)定性都非常好。rLam128A 在極端酸性和堿性條件下的pH 值穩(wěn)定性優(yōu)于來自Streptomyces matensis[26]和Mitsuaria chitosanitabida[27]的昆布多糖酶（表1）。微泡菌重組昆布多糖酶的動力學參數Km和Vmax分為4.34 mg/mL 和0.21 U/mg。

表1 一些表征的昆布多糖酶的熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性Table 1 Thermostability and pH stability of some characterized laminarinases

圖3 溫度和pH 對rLam128A 活性和穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of temperature and pH on the activity and stability of rLam128A

2.4 化學試劑對重組昆布多糖酶穩(wěn)定性的影響

測定不同金屬離子對rLam128A 穩(wěn)定性的影響，結果如圖4a 所示。1 mmol/L K+對酶活力有微弱促進作用；Na+、Mg2+和Ba2+對酶活力有促進作用，隨著濃度升高促進作用增強。與之類似的，鄭必勝等[28]的研究表明，Ba2+對裂褶菌來源的酶具有促進作用。10 mmol/L的Ca2+對酶活力有促進作用，而低濃度對酶活力無影響。Cu2+、Zn2+、Cd3+、Al3+和Fe3+對酶活力產生不同程度的抑制作用，Lee 等[11]的研究也表明，Cu2+和Zn2+對昆布多糖酶具有抑制作用。1 mmol/L 的金屬離子中，Cu2+的抑制作用最強；10 mmol/L 的金屬離子中，Al3+的抑制作用最強，酶活力基本喪失。

圖4 化學試劑對rLam128A 穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of chemical reagents on the stability of rLam128A

測定其他化學試劑對rLam128A 穩(wěn)定性的影響，結果如圖4b 所示。還原試劑DTT 對酶活力有促進作用，且隨濃度的升高促進作用明顯增強，而螯合劑EDTA對酶活力影響不大。除了SDS 和CTAB，rLam128A 對測試的其他去垢劑表現出一定的穩(wěn)定性，2%的Tween 20 和Tween 80 室溫處理1 h，可以保留不低于60%的酶活力，而同樣條件下經Triton X-100 處理后，酶活力保留38.57%。rLam128A 對尿素表現出一定的穩(wěn)定性，5 mol/L 尿素室溫處理1 h，可保留50.44%殘余酶活力。

2.5 酶解產物的抗氧化活性

研究表明，分子結構、單糖單元的數量、支化度和長度，都可能影響昆布多糖的抗氧化活性[29]。昆布多糖經昆布多糖酶水解的產物主要為單糖、二糖和五塘等小分子單糖和寡糖[30]。本研究中，利用重組昆布多糖酶rLam128A 制備昆布多糖酶解產物，并進行產物的抗氧化活性分析。結果顯示，當質量濃度為12.50 mg/mL時，酶解產物對DPPH 自由基的清除率達到63.62%，而昆布多糖對該自由基的清除率僅為14.40%（圖5a），酶解產物對DPPH 自由基的半抑制濃度IC50為7.12 mg/mL。當質量濃度達到2.40 mg/mL 時，酶解產物對ABTS 自由基的清除率達到84.45%，而昆布多糖對該自由基的清除率僅為3.27%（圖5b），酶解產物對ABTS 自由基的半抑制濃度IC50為1.01 mg/mL。昆布多糖及其酶解產物均對·OH 自由基表現出良好的清除效果（圖5c），酶解產物對·OH 自由基的半抑制濃度IC50為2.40 mg/mL，低于昆布多糖。由圖5d 可知，隨著質量濃度的增大，昆布多糖及其酶解產物的還原能力均增強，但相較于昆布多糖，酶解產物的還原能力更強。綜上，rLam128A 水解昆布多糖，獲得的酶解產物具有更高的抗氧化活性。

圖5 昆布多糖及其酶解產物的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activities of laminarin and its enzymatic hydrolysis products

3 結論

本研究中，從海洋細菌Microbulbifersp.ALW1 中克隆昆布多糖酶Lam128A 基因，并在畢赤酵母中進行表達，獲得的重組昆布多糖酶rLam128A 具有良好的溫度穩(wěn)定性，以及強酸和強堿環(huán)境中的穩(wěn)定性。rLam128A能特異性水解昆布多糖，且水解產物的抗氧化能力提高。重組昆布多糖酶rLam128A 成為可能的工具酶，促進昆布多糖的高值化開發(fā)利用。