管雪婷，韓勝?gòu)?qiáng)，謝元，胡衛(wèi)成*，沈婷*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）（2.淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江蘇淮安 223300）

免疫是機(jī)體對(duì)于外界抗原的侵入及疾病預(yù)防的一道必不可少的防線[1]，因此，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫受到廣泛的關(guān)注。免疫反應(yīng)需要免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，這些細(xì)胞在增強(qiáng)免疫和通過(guò)信號(hào)分子有效對(duì)抗感染發(fā)揮重要作用[2]。巨噬細(xì)胞是一種多功能免疫細(xì)胞[3]，在先天免疫系統(tǒng)中占據(jù)一個(gè)獨(dú)特的生態(tài)位，負(fù)責(zé)清除入侵的病原體和死亡細(xì)胞[4]?；罨木奘杉?xì)胞通過(guò)觸發(fā)不同的信號(hào)通路有效地降低疾病的易感性。當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活時(shí)，它們表達(dá)表面識(shí)別受體，如Toll 樣受體TLR2/TLR4，觸發(fā)多個(gè)信號(hào)通路，如絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）、磷酸肌醇3 激酶（PI3K）-Akt 和Janus 激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)換器，釋放炎癥因子（如一氧化氮NO）和促炎細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素IL-6、IL-1β和腫瘤壞死因子TNF-α）[5]。最近的證據(jù)表明，有效增強(qiáng)免疫系統(tǒng)是治療免疫抑制、微生物感染和腫瘤的一種新興治療方法[6]。

多糖是由大量單糖組成的一類(lèi)重要的天然生物大分子，廣泛分布于植物、動(dòng)物、藻類(lèi)和微生物中[7]。它們對(duì)人體幾乎沒(méi)有危害，因此人們對(duì)多糖的生物活性越來(lái)越感興趣，包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗感染、抗病毒等治療應(yīng)用[8,9]。而在這些生物活性中，免疫刺激活性受到了廣泛的關(guān)注。刺槐花多糖可以與巨噬細(xì)胞表面的TLR2/4 結(jié)合，誘導(dǎo)其釋放NO 和TNF-a、IL-18和IL-6，上調(diào)MAPKS 和NF-KB 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白及各自磷酸化蛋白的表達(dá)[10]。因此，多糖可以與巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活巨噬細(xì)胞釋放NO 及細(xì)胞因子，通過(guò)受體激活巨噬細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，發(fā)揮多糖的免疫活性。

蓮（Nelumbo nuciferaGaertn.），屬蓮科[11]，多年水生植物，蓮藕是蓮的膨大根莖[12]，作為食物和藥物在東南亞廣泛種植多年[13]。蓮藕具有抗氧化、抗癌、抗炎和免疫刺激活性[14-16]。在蓮藕加工過(guò)程中，產(chǎn)生了大量的蓮藕渣。然而，只有少量蓮藕渣被用作飼料，大部分被丟棄，導(dǎo)致環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[16]。若加以利用，不僅能科學(xué)合理地解決資源浪費(fèi)問(wèn)題，還能將廢物實(shí)現(xiàn)價(jià)值最大化。蓮藕渣中含有多糖[17]，但由于缺乏相關(guān)研究，嚴(yán)重限制了對(duì)這一資源的有效開(kāi)發(fā)。實(shí)驗(yàn)室前期研究[18]發(fā)現(xiàn)，蓮藕渣多糖（LRP）平均分子量為1.24×104ku，結(jié)構(gòu)為α-D-(1→4)連接的葡萄糖吡基，在O-6 處的非還原端α-D-Glcp 大約每6 個(gè)殘基作為分支。LRP 具有免疫刺激活性，顯著促進(jìn)NO、IL-6 和TNF-α的產(chǎn)生，促進(jìn)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠中TNF-α和IL-2 的分泌。張夢(mèng)潔等[19]發(fā)現(xiàn)蓮藕多糖能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，具有激活免疫細(xì)胞的潛能。但LRP 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答途徑及信號(hào)通路尚不可知。此外，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞接近于小鼠體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境[20,21]，一方面可以更好的還原動(dòng)物體內(nèi)的結(jié)果，另一方面可相對(duì)減少對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的殺害。阿拉伯木聚糖可以活化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，增加NO 產(chǎn)生，促進(jìn)免疫關(guān)聯(lián)基因mRNA 的表達(dá)，激活MAPK 和Akt 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)免疫[22]。因此，本試驗(yàn)取用小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞，觀察LRP 對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO 的影響，通過(guò)PCR 與Western Blot 檢測(cè)免疫關(guān)聯(lián)基因mRNA與MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量，初步探討LRP 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性及其信號(hào)機(jī)制，為L(zhǎng)RP 的開(kāi)發(fā)與利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮藕渣購(gòu)買(mǎi)于江蘇淮安本地市場(chǎng)，蓮藕渣多糖（LRP）按照前期文獻(xiàn)的方法分離純化[18]。RPMI 1640培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco 公司；臺(tái)盼藍(lán)、脂多糖（LPS）、甲氮甲唑藍(lán)（MTT）、對(duì)氨基苯磺酰胺、亞硝酸鈉（NaNO2）、N-1-萘乙胺鹽酸鹽，美國(guó)Sigma 公司；PVDF膜（0.2 μm），美國(guó)Bio-Rad 公司；抗體p-Akt、p-ERK、p-JNK、p-p38、Akt、ERK1/2、JNK、p38，美國(guó)CST公司；山羊抗兔 IgG-HRP，美國(guó) abcam 公司；Anti-β-Actin pAb-HRP-Direct，日本MBL 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國(guó)Thermo 公司；Trizol 試劑，美國(guó)ambion公司；30% Acr-Bis（29:1）、2×Taq Master Mix、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，北京cwbio 公司；異丙醇、甲醇、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、甲醛、氯化鈉、三氯甲烷、無(wú)水乙醇等試劑為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HERACELL I50i 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo 公司；JY88-IIN 細(xì)胞超聲破碎儀，寧波新芝生物科技公司；5414R 小型高速離心機(jī)、5810R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；Tecan Infinite M200 Pro 酶標(biāo)儀，瑞士Tecan 公司；PowerPacTMHC 電泳槽、T100 Thermal PCR 擴(kuò)增儀，美國(guó)BIO-RAD 公司；5200 multi 數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

從SPF 級(jí)BALB/c 小鼠中分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞[22]，分離后的細(xì)胞培養(yǎng)在濕度適宜，溫度為37 ℃，CO2含量為5%（V/V）的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞培養(yǎng)基為1%的青霉素和鏈霉素（V/V）以及10%（m/V）胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基。

1.3.2 LRP 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的毒性

將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)后加入RPMI 1640 培養(yǎng)基中，細(xì)胞稀釋至每毫升1×106個(gè)后接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，每組3 個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)過(guò)夜。向96孔培養(yǎng)板中加入不同濃度的LRP（0、12.5、25、50、100、200 μg/mL），于濕度適宜、溫度為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄掉孔內(nèi)上層培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 的0.5 mg/mL MTT 工作液，在培養(yǎng)4 h 后每孔立即加入100 μL 的stopping buffer，在16～20 h 后混勻，酶標(biāo)儀在570 nm 處測(cè)定吸光度值。

1.3.3 LRP對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO的影響

取細(xì)胞密度為每毫升1×106個(gè)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，每孔100 μL 接種于96 孔培養(yǎng)板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在培養(yǎng)板中加入不同濃度的LRP（0、12.5、25、50、100、200 μg/mL），以未添加LRP 組作為陰性對(duì)照組，同時(shí)以1 μg/mL 的LPS 將其設(shè)置為陽(yáng)性對(duì)照組，24 h 后用Griess 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO 含量。在培養(yǎng)板中加入200 μg/mL 的LRP，在不同時(shí)間段（0、1、3、6、12、24 h）取細(xì)胞上清液測(cè)定NO 的釋放量。

1.3.4 LRP 對(duì)免疫關(guān)聯(lián)基因mRNA 表達(dá)的影響

用RPMI 1640 培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為每毫升5×106個(gè)后接種至培養(yǎng)皿中，用200 μg/mL 的LRP 分別處理細(xì)胞0、0.5、1、3、6 h。在不同的時(shí)間段棄去培養(yǎng)皿中上清液，加入1 mL Trizol 裂解細(xì)胞，收集不同時(shí)間段的樣品待用。上述溶液中加入100 μL 三氯甲烷，混勻、離心，取水層加入等體積異丙醇，充分振蕩，靜置、離心，管底出現(xiàn)膠狀沉淀即為RNA，用0.1%（m/V）DEPC（焦炭酸二乙酯）水配制的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇清洗RNA 后置于通風(fēng)櫥中晾干，再加入30 μL DEPC 水溶解RNA，置于-80 ℃超低溫冷凍箱中待測(cè)。RNA 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，使用不同的引物（上海生工生物工程股份有限公司）在PCR 擴(kuò)增儀中檢測(cè)不同免疫因子mRNA 的表達(dá)量。其中PCR 反應(yīng)體系如下：6 μL 的無(wú)菌超純水，10 μL 的2×Taq Master Mix、1 μL 的上游引物、1 μL 的下游引物、2 μL 的cDNA。引物序列及PCR 擴(kuò)增條件如表1 所示。

表1 引物序列及PCR 條件Table 1 Primer sequence and conditions for PCR

1.3.5 Western Blot 檢測(cè)MAPK/NF-κB 和Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)量

在培養(yǎng)皿中接種小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，細(xì)胞密度為5×106個(gè)，使用200 μg/mL 的LRP 培養(yǎng)細(xì)胞，在不同時(shí)間段獲取樣品（0、0.5、1、3、6 h）。將培養(yǎng)基上清吸除后用1 mL 的PBS 沖洗并收集細(xì)胞，離心后取沉淀加入250 μL 蛋白酶裂解液充分混勻，使用超聲破碎儀破碎細(xì)胞后，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，得到上清液。BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，通過(guò)Western Blot 檢測(cè)MAPK/NF-κB 和AKt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)。將樣品蛋白在95 ℃下變性5 min 后，SDS-PAGE 電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF 膜。將膜移至封閉液（5% BSA，m/V）中，加入一抗孵育過(guò)夜，二抗孵育2 h，室溫下在搖床上用TTBS 洗滌后加入曝光液采集圖像。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究的數(shù)據(jù)分析使用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，結(jié)果表示為Mean±SD，p＜0.05 表示差異顯著，繪圖軟件為Sigma Plot。

2 結(jié)果與討論

2.1 LRP 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活力的影響

如圖1 所示，考察LRP 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活力的影響。使用不同濃度梯度的LRP 培養(yǎng)細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示，濃度為25～50 μg/mL 的LRP 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活力有促進(jìn)作用（p＜0.05），細(xì)胞存活率分別為104.82%和102.53%，200 μg/mL 濃度以?xún)?nèi)細(xì)胞活力沒(méi)有降低趨勢(shì)。小麥麩皮中阿拉伯木聚糖與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示6.25 和12.5 μg/mL 多糖處理后細(xì)胞存活率分別為90.42%和89.99%，證實(shí)阿拉伯木聚糖對(duì)細(xì)胞沒(méi)有顯著毒性[22]。因此，200 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，LRP對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞無(wú)毒性作用。

圖1 LRP 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of LRP on the activity of mouse peritoneal macrophages

2.2 LRP對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO釋放量的影響

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)接近動(dòng)物體內(nèi)的環(huán)境，可研究對(duì)病原體的先天免疫應(yīng)答[22]。一氧化氮（NO）是巨噬細(xì)胞的主要介質(zhì)，對(duì)細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用[23]。為了確定巨噬細(xì)胞的活性，用不同濃度的LRP刺激腹腔巨噬細(xì)胞后，測(cè)定細(xì)胞上清中NO 的濃度。巨噬細(xì)胞中NO 濃度隨LRP 濃度的提高顯著增加（p＜0.05），LRP 濃度為200 μg/mL 時(shí)NO 產(chǎn)量為36.47 μmol/L，略低于陽(yáng)性對(duì)照組LPS 中NO 濃度46.58 μmol/L，如圖2 所示。為了監(jiān)測(cè)NO 釋放的具體時(shí)間段，使用200 μg/mL 的LRP 處理腹腔巨噬細(xì)胞。如圖3，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NO 產(chǎn)量逐漸增多，培養(yǎng)時(shí)間至24 h 時(shí)NO 產(chǎn)量為44.18 μmol/L。不難看出，NO的釋放量由6 h 開(kāi)始顯著增加（p＜0.05），處理24 h 后的NO 釋放量大致與之前處理結(jié)果吻合。研究表明，NO 調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，在細(xì)胞中，NO 濃度在（0.01～0.25）mmol/L 的低濃度下，細(xì)胞增殖增加，在＞0.5 mmol/L 的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯[24]。圖2～3 中，200 μg/mL 的LRP 處理巨噬細(xì)胞24 h 產(chǎn)生NO 的量處于（0.01～0.25）mmol/L 間，即LRP 可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。玉米麩皮中阿拉伯木聚糖的體外結(jié)果顯示阿拉伯木聚糖促進(jìn)人U937 單細(xì)胞細(xì)胞株NO 合成，從53.7 μmol/L增加至62.9 μmol/L，研究表明來(lái)自玉米麩皮膳食可能會(huì)增強(qiáng)先天免疫反應(yīng)[25]。因此，LRP 激活腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，提高巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，發(fā)揮LRP 的免疫刺激活性。

圖2 LRP 的不同處理濃度對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO 的影響Fig.2 Effect of different treatment concentration of LRP on the release of NO from mouse peritoneal macrophages

圖3 LRP 的不同處理時(shí)間對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO 的影響Fig.3 Effect of different treatment time of LRP on the release of NO from mouse peritoneal macrophages

2.3 LRP 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR4/TLR2 及免疫關(guān)聯(lián)因子表達(dá)的影響

多糖具有免疫刺激活性，巨噬細(xì)胞已被報(bào)道為多糖反應(yīng)的靶點(diǎn)[26]。多糖對(duì)免疫細(xì)胞的直接刺激作用涉及到特定的識(shí)別受體，這些識(shí)別受體可以決定最終的反應(yīng)。多糖與這些受體結(jié)合時(shí)，可能會(huì)觸發(fā)不同的信號(hào)通路，使反應(yīng)可以被檢測(cè)到。多糖可以通過(guò)激活toll樣受體對(duì)細(xì)胞產(chǎn)物如脂多糖和脂磷壁酸產(chǎn)生反應(yīng)，從而產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，可能在炎癥中誘發(fā)T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[27,28]。TLR2 和TLR4 在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)[29]，TLR2 被多糖激活后，TGF-激活激酶被磷酸化，激活由絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）組成的激酶復(fù)合物，分別激活NF-κB 和c-Jun 端激酶（JNK）信號(hào)通路，從而觸發(fā)細(xì)胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的表達(dá)[30]。同時(shí)，TLR4 已被確定為巨噬細(xì)胞對(duì)植物多糖的重要膜受體，利用轉(zhuǎn)接分子傳遞信號(hào)至細(xì)胞內(nèi)，激活下游相關(guān)分子，如NF-κB，從而促進(jìn)炎性因子的分泌[31]。iNOS是免疫中最重要的內(nèi)源性免疫介質(zhì)之一，在正常免疫功能中起著關(guān)鍵作用，包括巨噬細(xì)胞活化和宿主對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體的防御[32]。

為了探討LRP 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Toll 樣受體及免疫關(guān)聯(lián)因子表達(dá)的影響，使用PCR 儀半定量檢測(cè)細(xì)胞中Toll 樣受體（TLR4、TLR2）以及免疫關(guān)聯(lián)因子（TNF-α、IL-6、iNOS、1L-1β、COX-2、Nfkbia）等基因的表達(dá)。

如圖4～5 所示，在細(xì)胞中，TLR4 和TLR2 的表達(dá)隨LRP 刺激時(shí)間延長(zhǎng)而增加，因此，LRP 與巨噬細(xì)胞表面的TLR4、TLR2 結(jié)合，使其表達(dá)量提高；而TNF-α、IL-6、iNOS、1L-1β、COX-2、Nfkbia 等基因的mRNA在前1 h 內(nèi)幾乎不表達(dá)，而在LRP 處理3 h 之后的表達(dá)量顯著增加，其中，TNF-α與IL-1β在6 h 表達(dá)降低。因此，LRP 與巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合，刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，3 h 時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)條帶較亮。大量研究表明，在機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的過(guò)程中，TLR2 與TLR4 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮著最為重要的作用，植物多糖可以通過(guò)Toll 樣受體介導(dǎo)巨噬細(xì)胞激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子的釋放，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能[33]。β2GPI/抗β2GPI 復(fù)合物激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞過(guò)程中,TLR2 表達(dá)增加[34]；蘑菇多糖在腹腔巨噬細(xì)胞中通過(guò)激活TLR4/NF-κB 途徑，致其細(xì)胞因子的分泌量顯著增強(qiáng)[35]；大黃多糖刺激巨噬細(xì)胞激活TLR4/MyD88/NF-κB 途徑，誘導(dǎo)IL-1β、IFN-β、IL-6及TNF-α等細(xì)胞因子表達(dá)[36]。這些研究結(jié)果與此結(jié)果皆顯示誘導(dǎo)TLR2與TLR4受體及其下游免疫相關(guān)因子表達(dá)的增加是植物多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要途徑之一。因此，免疫關(guān)聯(lián)細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)上調(diào)結(jié)果顯示，LRP 結(jié)合巨噬細(xì)胞表面免疫關(guān)聯(lián)Toll 樣受體，刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，從而激活細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

圖4 LRP 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫關(guān)聯(lián)Toll 樣受體mRNA 表達(dá)的影響Fig.4 Effect of LRP on mRNA expression of immune-associated Toll-like receptors in mouse peritoneal macrophages

圖5 LRP 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫關(guān)聯(lián)因子mRNA 表達(dá)的影響Fig.5 Effect of LRP on mRNA expression of immune-related factors in mouse peritoneal macrophages

2.4 LRP 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MAPK/NF-κB及Akt 信號(hào)通路的影響

據(jù)報(bào)道，MAPK/NF-κB 信號(hào)通路參與刺激免疫應(yīng)答中的基因表達(dá)（如iNOS、IL-6、TNF-αmRNA）和細(xì)胞因子分泌（如NO、IL-6 和TNF-α）[37]。MAPK通路與激活蛋白1（AP-1）信號(hào)通路相關(guān)，它在巨噬細(xì)胞激活過(guò)程中介導(dǎo)免疫關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)[38]。p38 MAPK、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和c-Jun NH2末端激酶（JNK）的磷酸化和激活已在免疫細(xì)胞中通過(guò)各種炎癥刺激得到證實(shí)[39,40]。NF-κB 是參與炎癥過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)IκB 亞基磷酸化和從非活性細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物分離而激活，p65 的活性二聚體易位到核[41]。這些免疫細(xì)胞的激活對(duì)免疫系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)可能是治療各種疾病的有前途的治療策略之一。為了檢測(cè)MAPK/NF-κB 通路是否介導(dǎo)了LRP 處理后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，用200 μg/mL的LRP 處理細(xì)胞0、0.5、1、3、6 h，測(cè)定了ERK1/2、JNK、p38 的磷酸化及核蛋白中c-Jun 和p65 的水平。另外，Akt 參與細(xì)胞生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝及凋亡。有研究表明Akt 可能激活MAPK 信號(hào)通路[42]，因此，測(cè)定Akt 的磷酸化水平，確定Akt 信號(hào)通路是否與介導(dǎo)LRP處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫關(guān)聯(lián)因子相關(guān)。

在LRP 刺激的腹腔巨噬細(xì)胞中，如圖6 所示，核蛋白p65 的水平在0～3 h 逐漸增多，在3 h 后略有降低；c-Jun 的水平也在3 h 達(dá)到峰值后降低。結(jié)果顯示，LRP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞的刺激上調(diào)其核蛋白中p65 及c-Jun 表達(dá)的水平，c-Jun 的表達(dá)與AP-1 有關(guān)[38]，證明LRP 可激活巨噬細(xì)胞介導(dǎo)免疫相關(guān)因子表達(dá)，p65 的活性二聚體易位至核，這說(shuō)明參與此過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 也被激活。在圖7 中，磷酸化的ERK1/2 在0.5 h 顯著增多，隨后逐漸降低；磷酸化的JNK 在1 h 時(shí)顯著增多，隨后降低；磷酸化的p38 具體來(lái)說(shuō)，在0～1 h 呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢(shì)，而1～6 h 逐漸降低。值得注意的是，巨噬細(xì)胞中Akt 的磷酸化水平?jīng)]有顯著變化趨勢(shì)。這些結(jié)論在其他研究中也得到了證明。玫瑰茄（Hibiscus sabdariffaLinn.）多糖通過(guò)MAPKs 信號(hào)通路激活巨噬細(xì)胞，進(jìn)而激活ERK、JNK、p38 和p65 的磷酸化，顯著增加細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)[31]。蘑菇多糖通過(guò)TLR/NF-κB 途徑增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞因子的mRNA 的表達(dá)[35]。與其他同類(lèi)型多糖相比，LRP 實(shí)現(xiàn)廢物利用，而小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞比其他來(lái)源巨噬細(xì)胞更接近小鼠體內(nèi)反應(yīng)。這些結(jié)果證實(shí)LRP 激活MAPK 和NF-κB 信號(hào)通路，上調(diào)通路中關(guān)鍵蛋白p38、ERK1/2 和JNK 及其磷酸化，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。

圖6 LRP 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞p65 及c-Jun 蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of LRP on the expression of p65 and c-Jun proteins in mouse peritoneal macrophages

圖7 LRP 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MAPK 和Akt 信號(hào)通路表達(dá)的影響Fig.7 Effects of LRP on the expression of MAPK and Akt signaling pathways in mouse peritoneal macrophages

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)LRP 與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，探究LRP 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答的信號(hào)通路。研究結(jié)果表明，LRP 通過(guò)激活MAPK/NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮其免疫作用。LRP 結(jié)合巨噬細(xì)胞表面受體TLR4 及TLR2，刺激腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO，促進(jìn)TNF-α、IL-6、iNOS、1L-1β、COX-2、Nfkbia 等細(xì)胞因子的釋放，上調(diào)MAPK/NF-κB 信號(hào)通路中核蛋白c-Jun 和p65 的表達(dá)，增強(qiáng)關(guān)鍵蛋白ERK1/2、JNK、p38及其磷酸化。因此，LRP 在預(yù)防疾病及增強(qiáng)免疫中可發(fā)揮重要作用，但需要更多的研究來(lái)闡明LRP 在體內(nèi)免疫應(yīng)答中的作用。