張玉姣，孫曉娜，田偉功，王松濤，沈才洪，艾春青，宋爽*

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連 116034） （2.瀘州品創(chuàng)科技有限公司國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川瀘州 646000）

巖藻多糖是一種含有大量巖藻糖和硫酸基團的硫酸多糖，主要來自于褐藻[1]。巖藻多糖具有多種生物活性如抗凝血[2]、抗病毒[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤和免疫活性[5]等。然而，巖藻多糖作為一種天然的高分子化合物，通常無法被人體的消化系統(tǒng)降解[6]，僅少量可被吸收入血[7]，絕大部分是以原型到達宿主腸腔內(nèi)影響腸道微生物及其代謝產(chǎn)物[8]，這可能是巖藻多糖發(fā)揮健康功效的最重要途徑[9]。但是巖藻多糖在體內(nèi)被腸道菌群代謝情況及其對腸道代謝物的影響仍不清楚，這阻礙了對巖藻多糖功效機制的了解。

腸道微生物群產(chǎn)生的代謝物對宿主的生理狀態(tài)有重要影響[10,11]，因此闡明巖藻多糖對腸道代謝的影響對揭示巖藻多糖功效機制具有重要意義。非靶向代謝組學采用液相色譜-質(zhì)譜檢測（LC-MS）等技術，無偏向性的檢測生物體內(nèi)受到刺激前后所有小分子代謝物的動態(tài)變化，并通過生信分析篩選差異代謝物，對差異代謝物進行通路分析，揭示其變化的生理機制[12-14]。因此，在本研究中，非靶向代謝組學被應用于檢測巖藻多糖及其降解產(chǎn)物對腸道代謝物的調(diào)控作用，以探究巖藻多糖及其降解產(chǎn)物的作用機制。

本研究通過分析巖藻多糖（FUC）、巖藻多糖弱酸降解產(chǎn)物（AFUC）和氧化降解產(chǎn)物（OFUC）在小鼠腸道代謝情況、主要參與巖藻多糖及其降解產(chǎn)物在腸道內(nèi)代謝的腸道微生物以及其對腸道代謝物的影響，揭示巖藻多糖通過腸道菌群發(fā)揮功效的機制及結構因素（硫酸基和相對分子質(zhì)量）對作用效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巖藻多糖（FUC），青島明月海琳巖藻多糖生物科技有限公司提供，巖藻多糖弱酸降解產(chǎn)物（AFUC）和氧化降解產(chǎn)物（OFUC）由實驗室前期制得，F(xiàn)UC、AFUC和OFUC 的相對分子質(zhì)量分別為188.6、7.4、19.6 ku，硫酸基含量分別為 28.3%±4.4%、3.1%±0.7%、28.2%±3.1%。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；氨水（分析純），天津石英鐘廠；乙酸（分析純），大茂化學試劑有限公司；氯仿（分析純），武漢化學試劑廠；乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），Spectrum 公司；甲醇（色譜純）；1-Methylnicotinamide-d3Iodide（標準品），Acetyl-L-carnitine-(N-methyl-d3)（標準品），Dl-glutamic acid（標準品），劍橋同位素；12-[(Cyclohexylcarbamoyl)amino]dodecanoic acid（標準品），Sigma 公司；巖藻糖（標準品），F(xiàn)luka 公司；乳糖（分析純），天津光復精密化工研究所。AB SCIEX 4000 QTRAP 質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX；LXQ 液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；CF16RX II 高速冷凍離心機，日本日立公司；XW-80A 漩渦混合器，上海精科有限公司；干燥箱，上海-恒科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗

動物實驗研究方法：本研究方案和實驗均得到動物實驗倫理委員會的批準（批準方案 I D SYXK2017-0005）。10 只BALB/c 雄性小鼠（SPF 級4周齡），購買于遼寧長生生物技術股份有限公司。小鼠生活環(huán)境溫度維持在（23±2）℃，相對濕度為55%±5%，明/暗循環(huán)12 h 的條件下，自由進食和飲水。小鼠飼養(yǎng)于潔凈的標準實驗動物飼養(yǎng)籠適應兩周。實驗前，稱量實驗小鼠質(zhì)量，收集實驗小鼠的新鮮糞便記為空白組（BLK），凍存于-80 ℃冰箱中。對小鼠灌胃200 μL FUC（每天300 mg/kg），并將小鼠放進代謝籠中，收集24 h 糞便。一天后，再灌胃200 μL AFUC（每天300 mg/kg），并收集24 h 糞便。間隔24 h 以后，再次灌胃200 μL OFUC（每天300 mg/kg），收集24 h 糞便，將糞便樣品置于-80 ℃冰箱凍存。

1.2.2 巖藻多糖及其降解產(chǎn)物在糞便中的含量測定

1.2.2.1 混合標準工作液的配制

稱取巖藻多糖FUC 或其降解產(chǎn)物（AFUC，OFUC）10 mg，用水溶解并定容至10 mL，制得巖藻多糖標準儲備液。分別移取適量巖藻多糖標準儲備液，用水逐級稀釋成質(zhì)量濃度為1 000、500、200、100、50、20、10 μg/mL 的混合標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2.2 標準溶液的水解

量取0.5 mL 上述標準工作液于5 mL 具螺口和膠墊片的水解管中，再加入0.5 mL 的4 mol/L 的三氟乙酸溶液，密封，放入恒溫干燥箱中，設定溫度120 ℃，水解3 h，取出水解管，室溫冷卻。氮吹除去溶劑，再加入0.5 mL 甲醇，氮吹至完全干燥以除去殘余的三氟乙酸。

1.2.2.3 樣品前處理與水解

準確稱取凍干后的糞便樣品0.1 g，加入2 mL 純凈水溶解，離心（8 000 r/min，10 min，4 ℃），取1 mL上清溶液加入4 mL 乙醇，在4 ℃條件下靜置 4 h 以上，離心（4 000 r/min，10 min，4 ℃），得到沉淀樣品。

向離心管中加入0.5 mL 2 mol/L 的三氟乙酸，旋渦混勻，再轉移至5 mL 具螺口和膠墊片的水解管中，該操作重復2 次，以保證離心管中沉淀全部轉移至水解管中。將水解管密封，放入恒溫干燥箱中，設定溫度120 ℃，水解3 h。取出水解管，室溫冷卻。氮吹除去溶劑，再加入0.5 mL 甲醇，氮吹至完全干燥以除去殘余三氟乙酸。

1.2.2.4 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化

向樣品水解物或標準品水解物中加入400 μL 的氨水，使水解管中的殘渣充分溶解，然后加入100 μL 10 μg/mL 乳糖內(nèi)標工作液，再加入400 μL 的PMP 甲醇溶液（0.5 mol/L），混勻，密封后在70 ℃水浴條件下加熱反應30 min，氮吹除去溶劑。再加入0.5 mL 甲醇，氮吹除去溶劑，重復2 次，以除去氨水。然后加入1%的乙酸溶液1 mL，再加入1 mL 三氯甲烷，充分渦旋混勻，靜置后去除有機相。重復該操作三次，以保證萃取效果。將萃取后水相溶液過0.22 μm 有機系濾膜，得到待測樣品供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測。衍生后的試樣應在48 h 內(nèi)完成檢測，否則需凍存（-18 ℃，6 個月內(nèi)）。

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測條件：

色譜柱：Thermo scientific Hyperisil Gold（150 mm×2.1 mm，5 μm）；進樣量：2 μL；柱溫：30 ℃；流動相：20 mmol/L 乙酸銨-乙腈（85:15，V/V），等度洗脫；流速：0.5 mL/min。離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；噴霧電壓：5 500 V；輔助加熱氣溫度：600 ℃；掃描模式：多重反應監(jiān)測（MRM）模式。

1.2.3 小鼠的腸道微生物群分析

16S 擴增子測序采用SDS 方法提取小鼠糞便菌群基因組的DNA，然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。對基因組DNA 中的16S rRNA 基因V3-4 區(qū)擴增，引物選用806R 和515F。根據(jù)TruSeq?DNA 無PCR 樣品制備試劑盒（Illumina，美國）的說明生成測序文庫，并在Qubit@2.0 熒光計（Thermo Scientific）上進行了評估。動物糞便樣品測序由諾禾致源生物信息科技有限公司完成。小鼠腸道菌群主成分分析、花瓣圖、聚類分析、菌群的相對豐度和熱圖等在網(wǎng)站上操作得出（https://magic.novogene.com）。

根據(jù)Caporaso 等[15]的分析方法，采用QIIME V1.7.0 對Alpha 多樣性、Rarefaction 曲線進行分析，使用R 軟件V3.0.3 顯示計算得出的樣本中的辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)等。測序深度指數(shù)用Good's coverage 來展現(xiàn)，菌群豐富度采用Chao1 指數(shù)和Ace 來評估確定，并采用辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)來分析菌群多樣性[15]。Venn 圖采用R 軟件包V3.0.3 進行構建，用來比較分析不同組間腸道菌群里OTUs 的組成差異[16]。主坐標分析PCoA和β多樣性使用QIIME 軟件V1.7.0 進行計算，使用R 軟件V2.15.3 中的Stat、Ggplot2 和WGCNA 軟件包進行展示。在PCoA 分析基礎上進一步做聚類分析，采用R 軟件V2.15.3 中的Ggplot2 和FactoMineR程序包來降低原始變量的維度。Wilcoxon 秩和檢驗用來分析各個組之間在門和屬上存在的統(tǒng)計差異。對每個樣本中相對豐度前35 的屬，采用R 軟件包V2.15.3制成熱圖。采用線性判別分析（LDA）和LEfSe（LDA Effect Size）分析來確定各個組之間存在的統(tǒng)計差異[16]。

1.2.4 非靶向代謝組學測定

1.2.4.1 樣品處理

稱取糞便樣品100 mg，加入500 μL 乙腈-甲醇-水（2:2:1，V/V/V）溶液，再加入10 μL 內(nèi)標（20 ng/mL 12-[(cyclohexylcarbamoyl) amino] dodecanoic acid，210 ng/mL 1-methylnicotinamide-d3iodide，51 ng/mL acetyl-L-carnitine-(N-methyl-d3)和3 500 ng/mL DL-glutamic acid（2,4,4-d3，98%），放在冰浴中渦旋振蕩30 s 直至形成完全分散的勻漿，將其放置于-20 ℃冰箱保持30 min。在4 ℃的溫度條件下，12 000 r/min離心12 min。取上清液置于干凈離心管中，低溫保存。再于4 ℃的溫度條件下，12 000 r/min 離心5 min 后留取上清，并用0.22 μm 的有機濾膜進行過濾。取上清液到進樣瓶中用于代謝分析。

1.2.4.2 AB TripleTOF 5600 液質(zhì)測定

（1）色譜條件

色譜柱：Waters Xselect @HSS T3（2.5 μm，100×2.1 mm）；柱溫30 ℃；流速0.4 mL/min；正離子模式下使用的流動相：A 相采用水-乙腈（95:5，V/V）并向其中添加體積分數(shù)0.1%甲酸，B 相采用水-乙腈（5:95，V/V）并向其中添加體積分數(shù)0.1%甲酸；負離子模式使用的流動相為C 相：將5 mmol 的CH3COONH4溶解在1 L 的純凈水中，并加入5%的乙腈；D 相：5 mmol 的CH3COONH4溶解在1 L 的95%乙腈中。

（2）質(zhì)譜條件

AB TripleTOF 5600 質(zhì)譜儀使用離子源氣體1（GS1）：55 arb；離子源氣體2（GS2）：55 arb；幕氣（CUR）：35 arb；溫度（TEM）；550 ℃；離子噴霧電壓浮動（ISVF）：5 500 V 為正離子模式，-4 500 V 為負離子模式。為了確保系統(tǒng)的準確性，所有樣品各取10 μL混合在一起得到QC，每8 個檢測樣品之間增加一個QC 樣品，通過QC 樣品對系統(tǒng)一致性進行驗證。

1.2.4.3 非靶向代謝組學數(shù)據(jù)分析

將采集出來的原始數(shù)據(jù)轉換成“abf”格式，轉換的文件導入到MSDIAL 中進行原始峰的提取，去卷積，峰對齊，峰識別，再將數(shù)據(jù)導出，然后用SIMCA 14.1軟件來進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA），再利用MSDIAL 中的資料庫來鑒別VIP 值大于1 的代謝產(chǎn)物。

1.3 統(tǒng)計學分析

多元線性回歸分析用于研究巖藻多糖及其降解產(chǎn)物的利用率與細菌OTUs 之間的關系。至少一個樣本中豐度大于1%的細菌OUTs 才會被納入到回歸模型中。采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 8.3 進行作圖。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準誤差。兩組或兩個樣本間的比較使用Student's t-test 檢驗。檢驗三組之間的差異使用單因素方差分析（ANOVA）中Duncan's range 檢驗。p＜0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 腸道菌群對巖藻多糖及其降解物的利用作用分析

巖藻多糖（FUC）主要由硫酸化的(1-3)-α-L-巖藻糖為重復單元構成，結構如圖1 所示。氧化降解通常不會破壞硫酸基團[17]，所以氧化降解產(chǎn)物（OFUC）與FUC 重復結構單元相同，只是分子量降低。而酸降解會使硫酸基團嚴重脫落，生成脫硫酸化的降解產(chǎn)物[18]

圖1 巖藻多糖結構[19]Fig.1 Structure of fucoidan

對實驗小鼠定量灌胃FUC、AFUC 和OFUC，收集0～24 h 內(nèi)糞便，通過HPLC-MS/MS 定量分析FUC、AFUC 和OFUC 的排出率。結果表明FUC 的排出率為48.85%±23.43%，OFUC 的排出率為40.99%±13.86%，AFUC 的排出率為40.78%±19.66%，但是AFUC、OFUC與FUC 的排出率沒有顯著差異，這可能是由于小鼠個體之間存在較大的代謝差異。該結果說明相對分子質(zhì)量對FUC、AFUC 和OFUC 在腸道內(nèi)代謝情況無顯著影響。

圖2 FUC、AFUC 和OFUC 24 h 內(nèi)隨糞便排出率Fig.2 The excreted proportions of FUC,AFUC and OFUC through feces within 24 h

2.2 利用巖藻多糖及其降解物的關鍵腸道微生物分析

為了分析利用巖藻多糖及其降解物的關鍵腸道微生物，采用16S rRNA 菌群測序分析小鼠腸道菌群，并分析FUC、AFUC 和OFUC 的利用率與腸道菌群之間的關系。首先分析了腸道菌群在門水平上的相對豐度，可以看出不同小鼠的腸道菌群組成存在著很大差異。如圖3 擬桿菌門和厚壁菌門占總體細菌的80%以上，是最具優(yōu)勢的腸道菌門。

圖3 不同大鼠的腸道菌群在在門水平的相對豐度圖Fig.3 The intestinal flora of different mice at the relative abundance at the phylum level

為了更進一步分析腸道菌群與巖藻多糖及其降解產(chǎn)物的相互作用關系，找出能夠利用巖藻多糖及其降解產(chǎn)物的關鍵細菌，我們對腸道細菌與FUC、AFUC和OFUC 的腸道代謝率做多元線性回歸分析，得到與FUC、AFUC 和OFUC 的在腸道內(nèi)的代謝率呈正向相關的腸道細菌如表1 所示。FUC 在腸道中的代謝與Bacteroides 菌屬，Muribaculaceae 菌科的未知菌屬以及Lachnospiraceae_NK4A136_group菌屬呈正向相關；AFUC在腸道中的代謝與Muribaculaceae菌科呈正向相關；OFUC 在腸道中的代謝與Muribaculaceae 菌科、Lachnospiraceae 菌科和Lachnospiraceae_NK4A136_group菌屬呈正向相關。其中，F(xiàn)UC、AFUC 和OFUC在腸道中的代謝均與Muribaculaceae 菌科呈正向相關。據(jù)報道Muribaculaceae 菌科確實存在與糖類降解有關的酶，分析結果進一步證實了Muribaculaceae 菌科在糖類消化吸收方面的重要作用[20,21]。然而，F(xiàn)UC和OFUC在腸道中的代謝均與Lachnospiraceae_NK4A136_group菌屬呈正向相關。Lachnospiraceae_NK4A136_group菌屬雖然沒有降解多糖的報道，但是有研究表明給高脂模型小鼠灌胃硫酸化多糖以后，會增加Lachnospiraceae_NK4A136_group菌屬的豐度[22]，因此推測Lachnospiraceae_NK4A136_group菌屬同樣參與FUC 和OFUC 在腸道內(nèi)的消化降解過程。從FUC、AFUC 和OFUC 的結構差異來看，硫酸基團含量高的復雜多糖在腸道內(nèi)的代謝需要更復雜的菌群合作代謝，且Muribaculaceae 菌科，Lachnospiraceae 菌科和Bacteroidaceae 擬桿菌科等是對FUC、AFUC 和OFUC在腸道內(nèi)代謝的關鍵菌群。

表1 與FUC、AFUC 和OFUC 在腸道內(nèi)利用存在相關性的腸道細菌Table 1 Gut microbiota correlated with FUC,AFUC and OFUC utilization in vivo

2.3 巖藻多糖及其降解物對腸道代謝產(chǎn)物的影響

為了研究AFUC、OFUC 和FUC 對腸道代謝產(chǎn)生的影響，對小鼠糞便進行了基于LC-MS 的非靶向代謝組學分析。從圖4 中可以看出，與空白組（BLK）相比，AFUC、OFUC 和FUC 均對腸道代謝產(chǎn)生了顯著的影響，而且三者之間沒有明顯分離，但有一定的差異性。

圖4 糞便中代謝物的PLS-DAFig.4 PCA analysis of the feces metabolites

根據(jù)OPLS-DA 模型的VIP（Variable Importance in the Projection）值對變量進行篩選，通過比較VIP 的值，來確定不同離子模式下FUC 組與空白組之間VIP 大于1 的差異代謝物，并通過t-test 檢驗篩選出p＜0.05 的差異性代謝產(chǎn)物，初步鑒定出92 個差異性代謝物。對篩選出的差異代謝物進行代謝通路研究（Pathway Analysis），以-log10 (p)和impact 分別為橫坐標和縱坐標，得到分析結果如圖5 所示。Y 軸基于p 值（來自通路富集分析），X 軸基于pathway impact value（來自通路拓撲分析）。FUC 組與空白組相比主要影響了泛酸和輔酶 A 生物合成（Pantothenate and CoA Biosynthesis）、氨酰-tRNA 合成（Aminoacyl-tRNA Biosynthesis）、苯丙氨酸代謝（Phenylalanine Metabolism）、精氨酸生物合成（Arginine Biosynthesis）、煙酸和煙酰胺代謝（Nicotinate and Nicotinamide Metabolism）、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（Phenylalanine，Tyrosine and Tryptophan Biosynthesis）、D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代謝（D-Glutamine and D-Glutamate Metabolism）、胺基代丙酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（Alanine，Aspartate and Glutamate Metabolism）和維生素B6代謝（Vitamin B6 Metabolism）等27 個代謝通路。以上代謝通路主要與機體內(nèi)氨基酸代謝有關，有研究表明部分氨基酸水平的變化會影響機體的血脂水平[24]，苯丙氨酸能夠被苯丙氨酸羥化酶催化為酪氨酸，酪氨酸水平的升高進一步對機體的糖脂代謝產(chǎn)生影響[30]，這可能是巖藻多糖發(fā)揮降血脂[32]作用的重要原因之一。除此之外，F(xiàn)UC 還顯著調(diào)節(jié)了泛酸和輔酶A（CoA）生物合成途徑。CoA 是許多代謝反應中必不可少的輔助因子，例如脂肪酸的合成和氧化、復雜脂質(zhì)的合成和檸檬酸循環(huán)中丙酮酸的氧化等，CoA 來源于泛酸（維生素B5），泛酸可以從飲食中和腸道細菌中獲得[31]。張彤彤等[33]研究發(fā)現(xiàn)海參多糖可以影響腸道內(nèi)泛酸和輔酶A（CoA）生物合成途徑，增加不飽和脂肪酸排泄從而影響脂質(zhì)代謝。本研究說明FUC 可能被腸道細菌代謝產(chǎn)生代謝產(chǎn)物激活氨基酸代謝、以及泛酸和輔酶A（CoA）生物合成等多條代謝途徑發(fā)揮降脂抗肥胖等生理作用。

圖5 FUC 代謝通路分析圖Fig.5 Pathway analysis of FUC

OFUC 組篩選得到83 個差異代謝物，分析代謝通路結果如圖6 所示。OFUC 主要影響了不飽和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids）、生物素合成（Biotin Metabolism）、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成（Phenylalanine，Tyrosine and Tryptophan Biosynthesis ）、氨 酰-tRNA合成（Aminoacyl-tRNA Biosynthesis）、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝（D-Glutamine and D-Glutamate Metabolism）、牛磺酸和低?；撬岽x（Taurine and Hypotaurine Metabolism）等28 個代謝通路。OFUC 與FUC 相比，除了影響氨基酸代謝途徑以外還顯著影響了不飽和脂肪酸的合成。腸道內(nèi)不飽和脂肪酸的合成與多種生理功能相關。有研究表明低分子量麥冬寡糖通過調(diào)節(jié)腸道中不飽和脂肪酸的生物合成、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、花四烯酸代謝等代謝途徑來緩解糖尿病[34]；硫酸化修飾的涼粉草多糖通過影響腸道中不飽和脂肪酸的合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等代謝途徑來發(fā)揮肝保護作用[35]。本研究發(fā)現(xiàn)OFUC 經(jīng)體內(nèi)消化可以調(diào)節(jié)機體腸道中的脂肪酸代謝和氨基酸代謝等代謝途徑，這為OFUC 發(fā)揮多種生理功能提供了數(shù)據(jù)支持。

圖6 OFUC 代謝通路分析圖Fig.6 Pathway analysis of OFUC

AFUC 組篩選出76 個差異代謝物，分析代謝通路結果如圖7 所示。AFUC 主要影響了不飽和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids）、谷胱甘肽代謝（Glutathione Metabolism）、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝（D-Glutamine and D-Glutamate Metabolism）、氮代謝（Nitrogen Metabolism）、二羧酸代謝（Glyoxylate and Dicarboxylate Metabolism）、維生素B6 代謝（Vitamin B6 Metabolism）、生物素合成（Biotin Metabolism）等24 個代謝通路。結果發(fā)現(xiàn)AFUC 與FUC 相比，還顯著影響不飽和脂肪酸的合成，與OFUC 的作用效果相似，說明AFUC 與OFUC 影響體內(nèi)區(qū)別于FUC 的多種代謝通路可能與分子量有關，低分子量的AFUC 與OFUC 更容易被腸道微生物代謝產(chǎn)生代謝產(chǎn)物激活多種代謝通路從而發(fā)揮益生功效。

圖7 AFUC 代謝通路分析圖Fig.7 Pathway analysis of AFUC

通過比較FUC 與AFUC、OFUC 的代謝差異，發(fā)現(xiàn)FUC、AFUC 和OFUC 共同影響了D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝（D-Glutamine and D-Glutamate Metabolism）途徑。谷氨酸代謝在蛋白質(zhì)和核酸生物合成的調(diào)節(jié)中起重要作用。谷氨酰胺是一種非必需氨基酸，作為三羧酸循環(huán)的底物參與中樞代謝過程[23]。Petrus 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺可以減少大鼠脂肪組織的炎癥，并與脂肪量成反比。Hu 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，飲食補充植物乳桿菌FZU3013發(fā)酵海帶能影響D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝途徑來改善高脂血癥大鼠的血脂紊亂。因此，這可能是FUC 與AFUC、OFUC 發(fā)揮降血脂的功效的重要代謝途徑。降解后的OFUC、AFUC 與FUC 相比，顯著調(diào)控了生物素代謝（Biotin Metabolism）的代謝通路。有研究表明，生物素（維生素H）是一種含硫的酶輔因子[26]，是生命三個領域所必需的微量營養(yǎng)素，它與中樞代謝有關，如羧化、脫羧化和反式羧化反應等[27]，且由大多數(shù)細菌合成[28]，在人體內(nèi)，生物素可以被大腸桿菌以pimeloyl-ACP 為前體開始合成[29]。因此我們推測降解后的巖藻多糖更容易被腸道微生物利用，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物參與機體代謝途徑從而發(fā)揮的益生效果。

3 結論

通過對糞便中FUC、AFUC 和OFUC 的定量分析，發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量對AFUC、OFUC 與FUC 在腸道內(nèi)的代謝無顯著影響。通過分析FUC、AFUC 和OFUC與腸道菌群的相互作用關系發(fā)現(xiàn)，AFUC 在腸道內(nèi)的代謝主要與腸道中的Muribaculaceae 菌科存在相關性；FUC 和OFUC 在腸道內(nèi)的代謝主要與腸道中毛螺菌科（Lachnospiraceae），Muribaculaceae 菌科和擬桿菌科（Bacteroidaceae）等存在相關性。FUC、AFUC 和OFUC在宿主體內(nèi)通過影響腸道菌群代謝，共同影響了D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝（D-Glutamine and D-Glutamate Metabolism）途徑，降解產(chǎn)物OFUC 和AFUC 均顯著影響生物素代謝（Biotin Metabolism）的代謝途徑，說明巖藻多糖及其降解產(chǎn)物對腸道菌群相互作用的效果存在差異。本研究為巖藻多糖在體內(nèi)吸收研究以及巖藻多糖衍生化產(chǎn)品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。