文蘭，祝靜，高輝，張昌軍，刁紅錄*

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，十堰 442000；3.湖北省生殖醫(yī)學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，十堰 442000；4.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研究院，十堰 442000)

溴結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)域(Bromodomain and extra-terminal domain，BET)家族成員是一類含有溴結(jié)構(gòu)域的蛋白。溴結(jié)構(gòu)域是一種由約110個氨基酸組成的，存在于真核生物中的保守蛋白質(zhì)基序，是已知唯一可以結(jié)合乙?；嚢彼釟埢牡鞍踪|(zhì)模塊，其在結(jié)構(gòu)上具有4個α-螺旋和2個環(huán)，可與組蛋白和其他蛋白質(zhì)中的乙?；嚢彼釟埢Y(jié)合[1]。組蛋白乙?；墙M蛋白修飾的重要事件之一，BET能夠特異性的識別組蛋白上乙?；娜旧|(zhì)位點(diǎn)，通過激活轉(zhuǎn)錄因子來促進(jìn)基因的表達(dá)，對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能有重要的意義[2-3]。不僅如此，BET蛋白還可以作為蛋白質(zhì)支架、有絲分裂標(biāo)記、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[4]。本文主要對BET家族在精子發(fā)生、胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESCs)分化、胚胎發(fā)育及妊娠分娩中的作用進(jìn)行綜述。

一、溴結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)域概述

BET家族由四名成員組成：溴結(jié)構(gòu)域蛋白2(BRD2，又稱RING3和Fsrg1)、溴結(jié)構(gòu)域蛋白3(BRD3，又稱Fsrg2和ORFX)、溴結(jié)構(gòu)域蛋白4(BRD4，又稱Fsrg4、MCAP和HUNK1)以及睪丸特異性含溴結(jié)構(gòu)域的蛋白(BRDT，又稱Fsrg3和BRD6)[5]。BETs包含兩個串聯(lián)的溴結(jié)構(gòu)域和一個超末端結(jié)構(gòu)域(ET)，其中溴結(jié)構(gòu)域與染色質(zhì)內(nèi)的核小體相互作用，是BET蛋白調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄所必需的；ET是一個由約80個氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)域，通過招募特異性效應(yīng)蛋白發(fā)揮調(diào)控功能[6]。此外，還有一個C端結(jié)構(gòu)域，僅存在于BRD4和BRDT的兩個家族成員結(jié)構(gòu)中，是招募正性轉(zhuǎn)錄延長因子b(Positive transcription elongation factor b，P-TEFb)所必需的結(jié)構(gòu)。BETs可與位于“超級增強(qiáng)子”中的組蛋白上乙?；馁嚢彼峄蚧騿幼訁^(qū)結(jié)合，對基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行表觀遺傳調(diào)控，與細(xì)胞生長、分化和炎癥密切相關(guān)。BETs屬于胞核蛋白，可以影響細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄，參與DNA修復(fù)和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[7]。此外，溴結(jié)構(gòu)域可以特異性識別乙?；馁嚢彼?，促進(jìn)染色質(zhì)開放，激活或暫停RNA聚合酶Ⅱ(RNA Pol Ⅱ)復(fù)合物以促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄延長，它的作用位點(diǎn)包括組蛋白H3上的乙酰化賴氨酸14(H3K14ac)、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、非組蛋白如紅系核蛋白轉(zhuǎn)錄因子GATA-1、堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)類型的轉(zhuǎn)錄因子TWIST、RelA和信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3等[8]。BET與靶標(biāo)分子相互作用的形成，為修飾染色質(zhì)的效應(yīng)子成功募集到啟動子和增強(qiáng)子奠定了基礎(chǔ)，支持組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子乙酰化的識別[9-10]。綜上所述，BET通過其特殊的結(jié)構(gòu)域識別乙酰化的賴氨酸，作用于特定的靶標(biāo)，對染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。

二、BETs與哺乳動物生殖

1.BETs與精子發(fā)生：精子發(fā)生過程受睪丸生精小管調(diào)控，包括精原細(xì)胞增殖、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子形成，是由精原細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生精母細(xì)胞，精母細(xì)胞通過減數(shù)分裂形成單倍體細(xì)胞群即精子細(xì)胞的過程[11]。四種BET基因都在成年哺乳動物的睪丸中表達(dá)，表達(dá)具有時空差異性。在小鼠中，BRD4在精原細(xì)胞中表達(dá)水平較高，BRD2在精原細(xì)胞中表達(dá)水平較低；但在精母細(xì)胞晚期和圓形精子細(xì)胞中BRD2表達(dá)水平最高，Brd3 mRNA在圓形精子細(xì)胞中有較高水平的表達(dá)；BRDT的第一個溴結(jié)構(gòu)域(BD1)缺失會導(dǎo)致睪丸形態(tài)嚴(yán)重受損、精子形態(tài)嚴(yán)重缺陷、精子濃度降低；BRDT可以激活精母細(xì)胞進(jìn)入第一次減數(shù)分裂時所需基因的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白A1，當(dāng)BRDT發(fā)生突變時會導(dǎo)致精母細(xì)胞減數(shù)分裂停止在前期，由此可見，BRDT是精子發(fā)生所必需的[1，5]。BRDT還可以作用于精母細(xì)胞減數(shù)分裂后乙?；娜旧|(zhì)，并且只有在H4K5和H5K8同時乙?；那闆r下，BRDT的第一個溴結(jié)構(gòu)域BD1才與組蛋白H4結(jié)合。由于H4K5和H4K8的乙?；歉咭阴；疕4的一個特征，因此，BRDT也是第一個被確定為可以鑒別高乙酰化H4的特異性因子。在減數(shù)分裂后期階段，精母細(xì)胞的細(xì)胞核體積會急劇減少，全基因組組蛋白移除，在此過程中，組蛋白首先會被過渡蛋白取代，隨后被魚精蛋白取代，這種取代與組蛋白H4的高乙?；嘘P(guān)，因?yàn)楫?dāng)組蛋白H4高乙?；瘯r，染色質(zhì)直接或者通過與BRDT等溴結(jié)構(gòu)域蛋白的結(jié)合去促進(jìn)組蛋白的移除。在精子細(xì)胞中組蛋白乙?；虰RDT都可促進(jìn)圓形精子細(xì)胞的激活，減數(shù)分裂后，BRDT與基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上結(jié)合的喪失，與其在單倍體細(xì)胞中的表達(dá)減少有關(guān)[12]。此外，BRDT可以結(jié)合并識別生精細(xì)胞的減數(shù)分裂相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上的乙?；M蛋白，從而激活減數(shù)分裂。當(dāng)BRDT的溴結(jié)構(gòu)域失去功能時，不能結(jié)合乙?；馁嚢彼?，就會影響染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄激活，改變精母細(xì)胞的正常染色質(zhì)組織，影響染色體軸的長度[13]。BRD4在小鼠精子發(fā)生的減數(shù)分裂期和減數(shù)分裂后均可表達(dá)，精子發(fā)生過程中的染色質(zhì)重組與頂體形成和組蛋白過度乙?；峭瑫r開始的，隨著組蛋白過度乙?；珺RD4在精子細(xì)胞頂體底部的核膜上形成一個與頂體直接連在一起的環(huán)，但此環(huán)在頂體突變小鼠中不會形成。頂體突變的小鼠與人類球形精子癥患者高度相似，均表現(xiàn)出核壓實(shí)和生育缺陷，這是一種頂體畸形或缺失、精子頭部呈圓形、染色質(zhì)壓實(shí)異常的情況，說明BRD4在整個精子發(fā)生的過程中發(fā)揮著重要的作用[14]。綜上所述，BRD4和BRDT在精子發(fā)生的過程中都發(fā)揮著重要的作用，尤其是BRDT，不僅在減數(shù)分裂的過程中高乙?；M蛋白H4，還可以與基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上乙?；慕M蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄與調(diào)控，從而對減數(shù)分裂中基因激活以及精母細(xì)胞的染色質(zhì)產(chǎn)生重要影響。

2.BETs與ESCs：ESCs主要依賴一組核心多能性轉(zhuǎn)錄因子來保持自我更新能力和細(xì)胞可塑性，這些細(xì)胞具有獨(dú)特的開放色質(zhì)結(jié)構(gòu)，在組蛋白的N端尾部有豐富的翻譯后修飾，這使得它們能夠維持高水平的轉(zhuǎn)錄活性[15]。在腫瘤中，BRD4以多種方式維持干細(xì)胞的多能性[16-17]。BRD4還可以維持ESCs的多能性以及干細(xì)胞基因的表達(dá)，敲除了Brd4基因的小鼠由于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的退化會發(fā)生胚胎致死，BRD2或BRD3沉默不影響ESCs集落形態(tài)或干細(xì)胞基因的表達(dá)，這說明BRD2和BRD3對于ESCs的維持不是必須的，而BRD4對于ESCs的維持至關(guān)重要[18-19]。BETs也在細(xì)胞周期進(jìn)程和有絲分裂中發(fā)揮重要作用，BRD2、BRD3和BRD4在新合成的DNA上顯著富集。沉默了BRD2、BRD3或BRD4基因，S期細(xì)胞染色質(zhì)上的增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)水平表達(dá)下調(diào)，BRD2、BRD3或BRD4的ET結(jié)構(gòu)域會引起PCNA保留在S期染色質(zhì)上，影響DNA的復(fù)制[19-20]。P-TEFb由細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶9(CDK9)和細(xì)胞周期蛋白亞基組成，可以磷酸化RNA Pol Ⅱ的C末端結(jié)構(gòu)域的色氨酸，BRD4與組蛋白修飾劑、染色質(zhì)重塑劑和P-TEFb相互作用，從而暫停和開始轉(zhuǎn)錄延伸的過程[21-22]。此外，ESCs的分化過程中，組蛋白H3和H4的乙酰化整體性減少，這表明組蛋白乙?；贓SCs多能性的維持中起著重要作用。有研究表明，BET蛋白抑制劑JQ1可以抑制BET的BD活性，從而導(dǎo)致ESCs核心轉(zhuǎn)錄因子Nanog表達(dá)下調(diào)，而且與BRD2和BRD3相比，BRD4與JQ1的結(jié)合力更強(qiáng)[18]。在Brd4基因敲除小鼠中，ESCs的形態(tài)分化增強(qiáng)，Nanog表達(dá)水平下調(diào)，這說明BRD4可以識別乙?；疕4K16，調(diào)節(jié)Nanog啟動子的轉(zhuǎn)錄活動，因此，BRD4抑制劑JQ1對ESCs的作用可能主要是通過抑制其與Nanog啟動子內(nèi)乙?；M蛋白的結(jié)合來介導(dǎo)的[23-24]。所以說，BRD4通過識別H4K16ac與ESCs的Nanog啟動子相互作用，進(jìn)而維持Nanog的表達(dá)，從而影響ESCs的干細(xì)胞基因的表達(dá)與多能性。

3.BETs與胚胎發(fā)育：胚胎發(fā)育是從受精卵發(fā)育成胚胎，再由胚胎發(fā)育成胎兒，直至娩出的過程。在小鼠妊娠中期(胚胎發(fā)育至13.5 d)時，BRD2在胚胎的大腦中表達(dá)最高，Brd2缺失的小鼠，其胚胎大小整體性減小，大腦發(fā)育缺陷；Brd4缺失會引起小鼠內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的退化導(dǎo)致胚胎在著床前死亡[25-26]。所以，Brd2和Brd4基因敲除的小鼠都會出現(xiàn)使胚胎發(fā)育異常。BRD2是賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶7(Lysine acetyltransferase，KAT7)向核糖體RNA(rRNA)位點(diǎn)募集所必需的載體，也可以增強(qiáng)組蛋白H4乙?；?。小鼠Ly-1抗體反應(yīng)克隆基因(Rattus norvegicus Ly1 antibody reactive，Lyar)mRNA可在早期胚胎的未成熟精母細(xì)胞和睪丸中檢測到，Lyar可與BRD2-KAT7復(fù)合物結(jié)合，加速組蛋白H4和組蛋白H3乙?；?，并且通過BRD2增強(qiáng)KAT7和BRD4向rDNA募集，促進(jìn)rRNA的合成，使rRNA上調(diào)，rRNA合成的調(diào)節(jié)是促進(jìn)包括人ESCs在內(nèi)的各種類型干細(xì)胞分化的一個重要因素，由此可知，BRD2可以調(diào)節(jié)早期胚胎中ESCs的發(fā)育[27]。此外，有研究表明BRDT蛋白在整個精子核中都能被檢測到，在精子核的早期分解過程中，殘留的BRDT可能與這些保留的組蛋白相互作用，并參與調(diào)節(jié)早期父系基因胚層特異性轉(zhuǎn)錄子基因的轉(zhuǎn)錄，對胚胎發(fā)育產(chǎn)生一定的影響[1]。綜上所述，BRD2可以影響小鼠胚胎器官的發(fā)育，BRD4卻影響小鼠內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的進(jìn)化，總之這些研究表明，盡管相關(guān)BET家族成員的基本結(jié)構(gòu)是保守的，但它們在哺乳動物胚胎發(fā)育中的功能是多樣的，對胚胎發(fā)育具有重要意義。

4.BETs與妊娠分娩：多項(xiàng)研究結(jié)果表明BETs可以結(jié)合乙酰化染色質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和炎癥免疫過程，并且在妊娠與分娩的過程中發(fā)揮著重要的作用[28-31]。子宮肌層激活是分娩的正常過程，它是通過肌肉收縮相關(guān)蛋白如催產(chǎn)素受體(Oxytocin receptor，OXTR)、間隙連接蛋白(Connexin 43，CX43)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)和前列腺素F2α受體(Prostaglandin F2 alpha Receptor，PTGFR)的作用而發(fā)生的。前列腺素F2α(Prostaglandin F2 alpha，PGF2α)通過PTGFR發(fā)出信號，也可以通過上調(diào)這些收縮相關(guān)蛋白的表達(dá)，刺激子宮肌層細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子和趨化因子來參與分娩的準(zhǔn)備[32]。BET蛋白抑制劑JQ1顯著降低了OXTR、PTGS2和PTGFRmRNA的表達(dá)以及PGF2α分泌，Brd2敲低可導(dǎo)致OXTR的表達(dá)降低，Brd4敲低會導(dǎo)致PTGFR表達(dá)降低，Brd3和Brd4同時敲低可導(dǎo)致PGF2α表達(dá)降低，說明BET蛋白可以誘導(dǎo)炎性信號，使肌層細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槭湛s狀態(tài)[31]。因此，BET蛋白可以通過對OXTR、PTGF、RPGF2α的調(diào)控在分娩過程中發(fā)揮重要的作用。NF-κB信號通路參與分娩過程中促炎性的調(diào)節(jié)[33]，BET蛋白則通過結(jié)合并激活NF-κB族中RELA蛋白來促進(jìn)炎癥[34-35]。因此，BET蛋白可以通過支持NF-κB調(diào)控轉(zhuǎn)錄對炎性反應(yīng)及分娩相關(guān)介質(zhì)發(fā)揮作用，從而利于調(diào)節(jié)哺乳動物的妊娠分娩。

三、展望

在組蛋白修飾中，賴氨酸乙?；揎椧驯粡V泛研究，組蛋白乙?；梢杂绊懭旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA的功能，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和修復(fù)，以及細(xì)胞周期的進(jìn)展。在哺乳動物生殖的領(lǐng)域中，BETs蛋白對于精子發(fā)生、胚胎發(fā)育以及妊娠分娩都有著重要的影響，這對染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和胚胎發(fā)育過程中表觀遺傳控制的主要標(biāo)記基因的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制具有十分重要的研究意義，同時也為胚胎著床、胚胎發(fā)育以及不孕不育的發(fā)生機(jī)制提供新的科學(xué)理論參考和治療策略。