向煒 黃山峻 曹家全 陳孝均 劉安銘 吳佳奇

骨折愈合是一個時空調(diào)控的再生過程，理想情況下骨折可完整恢復(fù)且沒有纖維瘢痕形成[1]。目前，骨折的治療已取得了巨大進(jìn)展，但仍有5%～10%的骨折因為治療不當(dāng)或其他原因?qū)е鹿钦垩舆t愈合，甚至不愈合。從骨折愈合的機制研究發(fā)現(xiàn)，除了軟骨區(qū)域外，骨是高度血管化、代謝活躍的組織[2]，血管生成和骨生成相互耦合[3]，從而維持正常骨的形態(tài)和功能。近年來，骨科領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)了一種可成骨并促進(jìn)骨折愈合的動脈分支亞型（H 型血管），是一種高表達(dá)血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（PECAM-1/CD31）和內(nèi)皮黏蛋白的毛細(xì)血管，主要分布在骨內(nèi)膜和干骺端，周圍有豐富的Osterix+骨祖細(xì)胞、成骨細(xì)胞等，可以增加骨量，加速骨形成[4]。眾所周知，血管再生在骨折愈合中起著關(guān)鍵作用，血管的形成將為骨折愈合提供充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)、分泌活躍生長因子及轉(zhuǎn)運代謝產(chǎn)物，從而增強血管和成骨細(xì)胞間的通信，加強血管和成骨耦合[5]。骨折后的前2 周是血管生成-成骨耦合的關(guān)鍵窗口，在此過程中新生血管的生長對骨折愈合起了不可替代的作用。因此，在骨折愈合窗口期使用H 型血管誘導(dǎo)劑促進(jìn)H 型血管形成，恢復(fù)骨折處血供，這將是一種促進(jìn)骨折愈合的可靠的治療新方法。本文旨在綜述誘導(dǎo)H 型血管形成的因素并歸納其可能形成的主要機制，為骨折愈合相關(guān)研究提供一個新的視角。

1 藥物因素

1.1 去鐵胺（DFO）DFO 是一種低氧模擬劑，已被FAD 批準(zhǔn)用于治療輸血鐵過量疾病，其不僅可用于治療缺血性疾病，還可作為脯氨酸羥化酶抑制劑（PHDi）和血管生成興奮劑。在移植BMSCs 的大鼠中，使用去鐵胺模擬組織缺氧環(huán)境發(fā)現(xiàn)，去鐵胺可通過增強SDF-1/CXCR4 信號軸通路功能促進(jìn)BMSCs 靶向歸巢，加速BMSCs 在缺血組織中的分化，促進(jìn)缺血皮瓣血管化，增加皮瓣缺血缺氧處細(xì)胞因子的表達(dá)，從而改善局部血流，減少壞死面積，有助于骨折處血管的生成及周圍損傷組織的修復(fù)[6]。還發(fā)現(xiàn)去鐵胺可以穩(wěn)定HIF-1α 的表達(dá)，激活PI3K/AKT 信號通路，上調(diào)下游SDF-1、VEGF等因子的表達(dá)從而有效地促進(jìn)EPCs 向損傷處遷移、靶向歸巢，提高缺血組織血管化[7]。去鐵胺不僅可通過促進(jìn)骨內(nèi)H 型血管形成改善骨密度[8]，還在牽張成骨和小鼠股骨骨折愈合過程中發(fā)現(xiàn)可提高骨的再生能力。在愈傷組織部位，去鐵胺螯合鐵觸發(fā)血管生成，可以抑制HIF-1α 的脯氨酸羥基化，使HIF-1α 積累，引起核易位、二聚作用與HIF-1β，反式激活VEGF 和其他下游介質(zhì)的新血管的形成，因此，注射去鐵胺可以部分挽救切除卵巢小鼠受損的H 型血管[9]。在體外，去鐵胺已被證明可以促進(jìn)血管生成[10]，在動物模型骨折部位連續(xù)注射去鐵胺時可增強骨痂新生血管生成，從而改善骨生成。去鐵胺通過刺激HIF-1α 表達(dá)促H 型血管增殖，以H 型血管聯(lián)合生成大量成骨轉(zhuǎn)錄因子Osx 為中心的高代謝成骨分化區(qū)域，可有效促進(jìn)節(jié)段性骨缺損修復(fù)[11]。有研究首次發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素A（HSYA）與DFO 聯(lián)合用藥，上調(diào)HIF-1α 分泌，促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面新生血管相對細(xì)胞聚集，使傷口內(nèi)形成更多的血管，從而加速創(chuàng)面修復(fù)[12]。因此，去鐵胺促進(jìn)血管成骨耦合機制可以歸納為主要通過調(diào)節(jié)HIF-1α 引起下游細(xì)胞分子的集連反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)血管成骨耦合?；仡櫸墨I(xiàn)發(fā)現(xiàn)將DFO 與生物支架聯(lián)合用于促進(jìn)骨折愈合可能也是一種很好的治療方法。最近有DFO 在人體內(nèi)的首次應(yīng)用報道[13]，即將可植入式血管生成/成骨刺激劑HA-DFO，用于骨折后血管生成關(guān)鍵時期內(nèi)，將DFO 緩慢釋放至骨折部位。作者主要是對一名繼發(fā)于放療后上頜發(fā)育不全的年輕患者進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)DFO 通過上調(diào)HIF-1α 途徑間接刺激血管生成從而使治療區(qū)域的骨面積和骨密度增加，因此，可推測植入式緩慢釋放去鐵胺將會取得好的臨床療效，但其具體效果如何、具體注入體內(nèi)時間、劑量等仍需要實驗進(jìn)一步研究。綜合現(xiàn)有實驗研究發(fā)現(xiàn)：DFO 可通過調(diào)節(jié)HIF-1α 有效促進(jìn)H 型血管生成和成骨，有利于骨折后血供的建立從而促進(jìn)骨折愈合，但其具體治療的標(biāo)準(zhǔn)仍需大量實驗深入研究。

1.2 雷帕霉素 雷帕霉素是一種免疫抑制劑，最早用于器官移植以減輕排斥反應(yīng)，后來發(fā)現(xiàn)也是一種有效的自噬誘導(dǎo)劑，近年來在實驗研究中也發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)血管和骨生成的作用，可能會對H 型血管的形成也有很大的促進(jìn)作用。有關(guān)骨質(zhì)疏松的研究表明：鐵積聚可通過mTOR/STAT1/Cxcl9 通路損害骨質(zhì)疏松癥的骨再生，鐵積聚激活mTOR，而雷帕霉素作為mTOR 抑制劑，可改善骨丟失，促進(jìn)高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥的血管生成和成骨，從而增加骨量[14]。雷帕霉素可促進(jìn)骨折部位血管的生成，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，抑制破骨細(xì)胞的分化，從而在成骨和骨保護(hù)中發(fā)揮重要作用[15]，而且還可以通過抑制mTOR活性進(jìn)而增強細(xì)胞自噬活性，抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)骨折部位血管生成，加速骨折的有效愈合[16]。新近研究表明，在脊髓橫斷后，將聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）微球從施萬細(xì)胞（SC）負(fù)載的帶正電荷的富馬酸聚乙二醇支架中持續(xù)釋放雷帕霉素，可使軸突再生的能力增強并改善脊髓功能，促進(jìn)新生血管的正?；痆17]。但也有研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的雷帕霉素對骨愈合有不同的影響：使用中、低劑量的雷帕霉素可改善血管的數(shù)量、長度和表面積[18]；如果持續(xù)或過多使用雷帕霉素將會抑制骨折愈合[19]，研究發(fā)現(xiàn)高劑量雷帕霉素可通過過度的抗增殖作用、自噬或抑制VEGF 的產(chǎn)生而損害血管形成或抗血管生成[17]，使血管數(shù)量、長度和表面積下降到未植入細(xì)胞或藥物時的水平。在骨折部位血管的生成和成骨中發(fā)現(xiàn)，持續(xù)過多的雷帕霉素劑量將會抑制血管生成使骨折延遲愈合，甚至不愈合；適當(dāng)?shù)膭┝繉龠M(jìn)血管生成從而加速骨折愈合。很顯然，不同劑量的雷帕霉素和/或不同實驗對象以及雷帕霉素的不同分子的作用機制都會對骨和血管的作用有不同的影響，因此，雷帕霉素雖然有研究表明可促進(jìn)血管和成骨耦合，但其具體機制有待進(jìn)一步研究。

1.3 紅景天苷 藏藥紅景天具有活血化瘀、通脈止痛、扶正固本和補腎強身等功效?，F(xiàn)代研究表明：紅景天含有40 多種化合物，主要成分為紅景天苷、酪醇等，具有抗缺氧、抗病毒、抗衰老以及神經(jīng)系統(tǒng)的雙向調(diào)節(jié)作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，紅景天可以促進(jìn)骨折部位血管新生以及對成骨具有保護(hù)作用，其中紅景天苷（salidroside，SAL）是最重要的成分，具有上調(diào)成骨細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）促進(jìn)骨生成，在低氧和常氧條件下，SAL 對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及成管都有明顯的促進(jìn)作用。SAL 通過調(diào)節(jié)HIF-1α 信號通路改善骨折部位血供，促進(jìn)骨折部位血管和新骨的形成，并且可以很大程度改善骨的力學(xué)性能、韌性和強度，同時SAL 被證實可通過上調(diào)HIF-1α 信號通路，促進(jìn)其下游靶基因VEGF 表達(dá)促進(jìn)胎鼠跖骨的血管新生[21]，能直接和間接誘導(dǎo)ECs 的增殖、遷移和毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)的形成，并在胎鼠長骨中產(chǎn)生血管生成活性因子，通過HIF-1α 介導(dǎo)的VEGF 誘導(dǎo)骨組織血管生成，促進(jìn)血管和骨生成的偶聯(lián)[22]，并可以有效上調(diào)bFGF、VEGF 等細(xì)胞因子的表達(dá)，誘導(dǎo)血管新生，改善成骨細(xì)胞的供血供氧狀態(tài)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化成熟，調(diào)節(jié)骨代謝動態(tài)平衡，最終骨化形成骨組織[23]。紅景天苷作為中藥紅景天里的重要成分，對骨折部位血管形成具有重大的促進(jìn)作用，其機制大致歸納為：一可直接上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 促進(jìn)成骨；二通過調(diào)節(jié)HIF-1α，使下游靶基因VEGF 等細(xì)胞因子充分表達(dá)，從而調(diào)節(jié)H 型血管形成，促進(jìn)血管成骨耦合。紅景天苷的臨床應(yīng)用有利于發(fā)揮中醫(yī)藥對骨折愈合的作用，但其促進(jìn)H 型血管形成的具體機制有待進(jìn)一步實驗確認(rèn)。

1.4 其他藥物 在骨折局部使用氯化錳，使骨痂中細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外VEGF-A 和VEGF-C 的增加，從而增加骨折骨痂處骨膜下血管生成，促進(jìn)成骨[24]。層粘連蛋白α4 鏈功能肽修飾脫鈣骨基質(zhì)支架材料可促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的黏附并顯著促進(jìn)H型血管的生成，從而在骨缺損修復(fù)中實現(xiàn)血管生成和骨再生的有效耦聯(lián)[25]。中成藥骨疏康（GSK）可通過增強HIF-1α 的表達(dá)誘導(dǎo)H 型血管并促進(jìn)骨形成[26]。目前H 型血管形成機制不唯一，除了通過增強HIF-1α 的表達(dá)誘導(dǎo)H 型血管并促進(jìn)成骨之外，還有通過促進(jìn)PDGF-BB 分泌增加，從而促進(jìn)H 型血管形成，誘導(dǎo)成骨。黃芪總黃酮（TFRD）在大鼠牽張成骨（DO）模型中可通過PDGFBB/PDGFR-β代替HIF-1α/VEGF 軸，加快H 型血管形成，并增強血管成骨耦合[27]。在骨質(zhì)疏松小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，注射肉葉蕓香堿（harmine）后可抑制破骨前細(xì)胞向破骨細(xì)胞的融合，使破骨前細(xì)胞和CM 中分泌的PDGF-BB 顯著增加，使小鼠骨質(zhì)中PDGF-BB 濃度和H 型血管數(shù)量明顯增加[28]。不同藥物誘導(dǎo)H 型血管形成雖然有個例報道，但其研究的實驗支持較少，具體的促進(jìn)H 型血管形成機制不唯一，因此其誘導(dǎo)H 型血管促進(jìn)骨折愈合的機制仍值得我們進(jìn)一步研究。

2 物理因素

2.1 超聲 目前，研究超聲在骨愈合過程中的作用已經(jīng)很普遍，尤其是低強度脈沖超聲。低強度脈沖超聲可以在細(xì)胞水平誘導(dǎo)機械力，而且已被證實可以調(diào)節(jié)血管和骨的形成[29]。從數(shù)學(xué)模型解釋超聲的作用發(fā)現(xiàn)，超聲在血管生成中起關(guān)鍵作用，可加速血管生成，縮短骨愈合時間[30]。例如，在大鼠創(chuàng)傷性椎體骨折模型中發(fā)現(xiàn)，低強度脈沖超聲可通過在時間和空間上增加軟骨形成，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞成骨以及促進(jìn)H 型血管生成來加速創(chuàng)傷性椎體骨折愈合[31]；在體外和體內(nèi)HADSC/HUVEC 共培養(yǎng)中，使用低強度脈沖超聲可以增強血管生成，制備的膠原聯(lián)合Col/0.5HA 支架以及低強度脈沖超聲應(yīng)用于干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，可有效促進(jìn)血管生成[32]。研究發(fā)現(xiàn)低強度脈沖超聲處理可以激活YAP/TAZ，并將其轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中激活靶基因，該過程可以被siYAP 滅活，被shLATS1/2 激活，通過低強度脈沖超聲治療，與Hippo 通路的交叉作用啟動血管生成，從而促進(jìn)骨折愈合[33]。在使用低強度脈沖超聲對13 名腓骨延遲愈合患者的研究中發(fā)現(xiàn)，血管大小和類骨質(zhì)體積之間有顯著的相關(guān)性，在腓骨延遲愈合患者的骨中，低強度脈沖超聲增加血管體積，使延遲愈合中類骨質(zhì)體積增加，從而增加骨折部位血液供應(yīng)和灌注[34]，促進(jìn)血管生成和骨折愈合。超聲作為一種無創(chuàng)、無痛苦、便捷、價廉的方法，對骨折愈合具有顯著的競爭力，雖然目前已有相當(dāng)多的實驗研究，但其具體促進(jìn)血管成骨耦合的機制有待進(jìn)一步實驗研究，具有深遠(yuǎn)的研究價值。

2.2 機械應(yīng)力 力學(xué)環(huán)境影響骨折愈合過程中的組織血管化，機械不穩(wěn)定力較穩(wěn)定力更能促進(jìn)早期血管生成和骨修復(fù)[35]。文獻(xiàn)[36]表明，血管重建和骨形成依賴于碎片間運動的方向，其中循環(huán)壓迫最能促進(jìn)血管重建從而刺激骨愈合過程。因為循環(huán)機械載荷不僅對細(xì)胞行為（如增殖、遷移和分化）有直接影響，還對改變生化和生物物理環(huán)境有間接影響，在骨愈合早期，適度的運動會改善無血管化骨折血腫細(xì)胞或血管化不足的早期肉芽組織內(nèi)的供氧，從而促進(jìn)血管生成和骨折的愈合[37]。通過離體實驗發(fā)現(xiàn)，機械牽張力能夠通過調(diào)控成骨細(xì)胞促進(jìn)相關(guān)血管生成因子的分泌[38]，在牽張成骨（DO）實驗過程中發(fā)現(xiàn)，形成的骨和血管比單純骨折愈合過程中更多，因此機械牽拉應(yīng)力有利于血管生成和成骨[27]。雖然有相關(guān)文獻(xiàn)論述機械應(yīng)力能夠促進(jìn)骨折部位血管生成以及成骨，但其具體機制仍然有待進(jìn)一步實驗研究。機械應(yīng)力的改變，一方面可能會刺激骨折斷端與周圍組織的接觸，從而促進(jìn)周圍相關(guān)細(xì)胞因子的分泌和活躍；另一方面可能是通過機械應(yīng)力的改變使周圍血管收縮，加快血流速度，促進(jìn)周圍各種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)運以及獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，為進(jìn)一步促進(jìn)血管生成和成骨提供機會。

3 展望

大量研究表明H 型血管可以協(xié)調(diào)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞譜系細(xì)胞之間的細(xì)胞信號傳導(dǎo)，并產(chǎn)生促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖和分化的因子，促進(jìn)骨愈合。作為一種新發(fā)現(xiàn)的動脈分支的毛細(xì)血管亞型，H 型血管在骨折愈合中的形成將會為骨折部位提供充足的氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)，傳輸成血管和成骨生長因子以及排出代謝產(chǎn)物，使血管生成和成骨處于動態(tài)平衡之中，從而加快骨折愈合。通過回顧文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)：（1）目前關(guān)于H 型血管在骨折愈合中形成的研究較多，但多處于動物實驗階段，在臨床實驗中不多，個體差異較大，需要更加深入的進(jìn)行實驗研究，以便進(jìn)一步驗證H 型血管形成的機制，為進(jìn)一步靶向治療提供確切指導(dǎo)。（2）通過歸納H 型血管在骨折愈合中形成的誘導(dǎo)因素發(fā)現(xiàn)：藥物中去鐵胺誘導(dǎo)H 型血管形或成為重要因素；H 型血管形成的主要機制可能是通過調(diào)控HIF-1α，激活下級靶細(xì)胞因子相關(guān)作用，從而促進(jìn)血管生成和成骨。（3）超聲和機械應(yīng)力均是一種無創(chuàng)、痛苦小、便捷、價廉的方法，適合大眾人群，可行性較高，但具體機制有待進(jìn)一步實驗驗證。

綜上所述，H 型血管形成的誘導(dǎo)因素主要集中在藥物、超聲和機械應(yīng)力方面，但缺乏系統(tǒng)的歸納，且已有相當(dāng)多的綜述論述H 型血管的形成機制，但促進(jìn)H 型血管形成的最主要機制尚不明確，通過對H 型血管在骨折愈合中形成的誘導(dǎo)因素進(jìn)行回顧發(fā)現(xiàn)：目前主要可能誘導(dǎo)因素為DFO；H 型血管形成的機制主要可能是HIF-1α 信號通路。本文雖然不能對所有已知的誘導(dǎo)因素進(jìn)行全面的論述，但筆者希望通過對涉及H 型血管在骨折愈合中形成的誘導(dǎo)因素回顧，找到主要可能誘導(dǎo)因素，并找到促進(jìn)H型血管在骨折愈合中形成的主要可能機制，為骨折愈合的相關(guān)研究提供一個新的視角。