繆曉杰 ,桂定坤 ,陳玉強(qiáng) ,呂 榮 ,李道鴻 ,楊緒楓

(1.蘇州市第九人民醫(yī)院老年科,江蘇蘇州 215200;2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腎內(nèi)科,上海 200233)

據(jù)統(tǒng)計[1],我國糖尿病患病率為9.7%,且呈快速增長趨勢,已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。其中30%～40%的糖尿病患者最終進(jìn)展為糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN),糖尿病腎病是糖尿病全身性微血管病變表現(xiàn)之一,也是最嚴(yán)重、危害最大的慢性并發(fā)癥之一。

研究發(fā)現(xiàn),足細(xì)胞損傷在DN 發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。足細(xì)胞是終末分化的腎小球上皮細(xì)胞,它附著在腎小球基底膜外側(cè),是腎小球濾過膜的重要組成部分[2]。DN 時受損的足細(xì)胞對ECM 的生成調(diào)節(jié)紊亂,造成Ⅳ型膠原等基膜樣基質(zhì)增加,導(dǎo)致腎小球硬化,加速DN 的進(jìn)展[3]。因此,改善高糖環(huán)境下足細(xì)胞凋亡對防治糖尿病腎病具有重要意義。

黃芪甲苷(astragaloside IV,AS-IV)是黃芪主要活性成分之一,也是《中國藥典》2005年版用以控制其藥材質(zhì)量的指標(biāo)成分[4]。我們的前期研究[5]顯示,AS-IV 可顯著改善糖尿病腎病大鼠腎組織病理損傷,減輕尿白蛋白。此外,AS-IV 能夠通過VEGFR2/GIV 通路保護(hù)嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[6];黃芪甲苷能夠保護(hù)體外高糖刺激足細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的影響[7]。但是,關(guān)于黃芪甲苷保護(hù)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的具體機(jī)制尚未明確。本研究進(jìn)一步討論AS-IV是否對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷及線粒體功能障礙具有保護(hù)作用,并探討其潛在的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

小鼠腎足細(xì)胞(MPC-5)購自舜冉(上海)生物科技有限公司,RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Thermo Fisher Scientific(中國),黃芪甲苷購自成都普瑞法科技有限公司(中國),CCK-8試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、ATP 檢測試劑盒以及DAPI染色液購自碧云天生物技術(shù)有限公司(上海),JC-1線粒體膜電位熒光探針購自上海翊圣生物科技有限公司(中國),Bcl2兔單克隆抗體、Bax兔單克隆抗體、cleavedcaspase 9兔多克隆抗體、cleaved-caspase 3兔單克隆抗體、Nephrin兔單克隆抗體、Podocin 兔單克隆抗體、Jagged1兔單克隆抗體、Notch1兔單克隆抗體、Hes1兔多克隆抗體、Hey1兔多克隆抗體、GAPDH 兔多克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白IgG二抗均購自Abcam(美國)。

1.2 Cell Counting Kit-8(CCK-8)實驗

根據(jù)CCK-8試劑盒制造商提供的說明書檢測細(xì)胞活性。簡而言之,將細(xì)胞以5×104/孔分組接種在不同處理條件下的96孔板當(dāng)中,培養(yǎng)24 h后。每孔加入10μL CCK-8試劑,37℃避光孵育3 h,酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處的光密度值。

1.3 細(xì)胞分組培養(yǎng)與處理

細(xì)胞在含100 mL/L FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,37℃50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的MPC-5細(xì)胞分為對照組(control 組,含5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24 h)、等滲對照組(MA組,含5mmol/L葡萄糖+25mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基共孵育細(xì)胞24 h)、高糖誘導(dǎo)組(HG組,含30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24 h)、低劑量AS-IV與高糖共處理組(含30 mmol/L葡萄糖+5μg/mL AS-IV 的培養(yǎng)基共孵育細(xì)胞24 h)、中劑量AS-IV 與高糖共處理組(含30 mmol/L 葡萄糖+15μg/m L AS-IV 的培養(yǎng)基共孵育細(xì)胞24 h)、高劑量AS-IV 與高糖共處理組(含30 mmol/L 葡萄糖+30μg/m L AS-IV 的培養(yǎng)基共孵育細(xì)胞24 h),篩選出最佳的黃芪甲苷作用濃度用于后續(xù)實驗。

1.4 TUNEL染色

將各組細(xì)胞收集并用PBS洗滌1次后,40 g/L多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min。PBS洗滌1次去除多余固定液,用含3 mL/L Triton X-100的PBS,室溫孵育5 min。PBS洗滌2次后,加入50μL TUNEL檢測液,37℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次后,加入少量DAPI染色液(覆蓋住細(xì)胞即可),室溫放置3～5 min,用PBS洗滌2次,每次3～5 min。最后用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下重點觀察代表細(xì)胞凋亡的綠色熒光信號。

1.5 Western blotting檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

將各組細(xì)胞收集并用預(yù)冷的細(xì)胞裂解液冰浴裂解10 min,提取總蛋白。BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量分析,加入6×SDS loading buffer,105℃孵育10 min,獲取變性的細(xì)胞總蛋白。每孔加入50μg蛋白在100 V 條件下SDS-PAGE凝膠電泳1.5 h分離總蛋白。將分離的蛋白在60 V 條件下轉(zhuǎn)膜2 h,將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上。隨后用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入按比例稀釋后的一抗4℃孵育過夜,用TBST 充分洗滌NC 膜2～3次后,加入按比例稀釋后HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,在黑暗環(huán)境下加入ECL 反應(yīng)液進(jìn)行發(fā)光反應(yīng),利用凝膠成像儀拍攝蛋白質(zhì)印跡,最后采用Image J(v.1.8.0)軟件分析蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6 JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位

收集各處理組細(xì)胞,加入足夠覆蓋所有細(xì)胞的預(yù)先配置好的JC-1工作液,37℃50 mL/L CO2條件下孵育15 min。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,并用PBS洗滌細(xì)胞2次后,加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液并置于熒光顯微鏡下使用514 nm 激發(fā)波長,529 nm 發(fā)射波長檢測JC-1單體綠色熒光信號以及使用585nm激發(fā)波長、590 nm 發(fā)射波長觀察JC-1聚合物紅色熒光信號。

1.7 試劑盒檢測ATP含量

收集各處理組細(xì)胞,按照6孔板每孔加入200μL裂解液的比例加入裂解液,裂解細(xì)胞,取上清,用于后續(xù)的測定。將100μL預(yù)先配置好的ATP 檢測工作液加到檢測管內(nèi),室溫放置3～5 min后,加入20μL樣品,迅速用微量移液器混勻后,用化學(xué)發(fā)光儀測定相對發(fā)光單位RLU 值。根據(jù)預(yù)先測定好的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中ATP的濃度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗均進(jìn)行3次平行實驗,并用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,并采用Tukey進(jìn)行事后檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS-IV提高高糖下調(diào)的MPC-5細(xì)胞活力

如圖1所示,我們首先檢測AS-IV 對MPC-5細(xì)胞的細(xì)胞毒性,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),分別用5、15、30μg/mL的AS-IV處理后,對細(xì)胞活性沒有明顯影響(P＞0.05)。和control組相比,HG組細(xì)胞活性降低(P＜0.001),而用AS-IV 處理后,提升高糖誘導(dǎo)的MPC-5細(xì)胞活性(P＜0.05),并隨藥物濃度梯度依賴性增加。由于30μg/mL AS-IV 處理的效果最為明顯,故而選擇30μg/mL AS-IV處理進(jìn)行下一步研究。

圖1 AS-IV提高高糖誘導(dǎo)的MPC-5細(xì)胞活力Fig.1 AS-IV enhanced the viability of MPC-5 cells induced by high glucose

2.2 AS-IV抑制高糖誘導(dǎo)的MPC-5細(xì)胞凋亡

TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡水平,結(jié)果如圖2A所示,和control組相比,HG 組細(xì)胞凋亡水平增加(P＜0.001);和HG組相比,HG+AS-IV 組細(xì)胞凋亡水平降低(P＜0.001)。如圖2B所示,和control組相比,HG組細(xì)胞抗凋亡蛋白(Bcl2)表達(dá)降低(P＜0.001),凋亡蛋白(Bax、cleaved-caspase 9,cleaved-caspase 3)表達(dá)升高(P均＜0.001);和HG 組相比,HG+AS-IV 組細(xì)胞抗凋亡蛋白(Bcl2)表達(dá)升高(P＜0.001),凋亡蛋白(Bax、cleaved-caspase 9,cleaved-caspase 3)表達(dá)降低(P均＜0.001)。Nephrin、Podocin等足細(xì)胞相關(guān)蛋白在足細(xì)胞裂孔膜丟失。如圖2C 所示,和control組相比,HG組細(xì)胞Nephrin、Podocin表達(dá)降低(P均＜0.001);和HG 組相比,HG+AS-IV 組細(xì)胞Nephrin、Podocin表達(dá)升高(P均＜0.01)。

圖2 AS-IV抑制高糖誘導(dǎo)的MPC-5細(xì)胞凋亡Fig.2 AS-IV inhibited apoptosis of MPC-5 cells induced by high glucose

2.3 AS-IV 改善高糖誘導(dǎo)的MPC-5 細(xì)胞線粒體功能障礙

結(jié)果如圖3A 所示,和control組相比,HG 組細(xì)胞線粒體JC-1聚合物含量下降,JC-1單體含量升高(P均＜0.001);和HG 組相比,HG+AS-IV 組細(xì)胞線粒體JC-1 聚合物含量升高,JC-1 單體含量降低(P均＜0.001)。ATP 檢測試劑盒結(jié)果顯示,和control組相比,HG組細(xì)胞ATP 含量下降(P＜0.001);和HG組相比,HG+AS-IV組ATP 含量升高(P＜0.001)。

圖3 AS-IV改善高糖誘導(dǎo)的MPC-5細(xì)胞線粒體功能障礙Fig.3 AS-IV ameliorated mitochondrial dysfunction in MPC-5 cells induced by high glucose

2.4 AS-IV抑制NOTCH 信號通路激活

結(jié)果如圖4所示,和control組相比,HG 組細(xì)胞NOTCH 信號通路相關(guān)蛋白(Jagged1、Notch1、Hes1、Hey1)表達(dá)升高(P均＜0.001);和HG 組相比,HG+AS-IV組細(xì)胞NOTCH 信號通路相關(guān)蛋白(Jagged1、Notch1、Hes1、Hey1)表達(dá)降低(P均＜0.001)。

2.5 分子對接顯示AS-IV靶向作用于Notch1蛋白

結(jié)果如表1所示,AS-IV 與Notch1蛋白之間存在結(jié)合位點,發(fā)現(xiàn)mode1 和AS-IV 結(jié)合效率最高。因此,選擇mode1進(jìn)行分子對接,結(jié)果如圖5所示,AS-IV 能夠作用在notch1 蛋白F109、V112、K127、L176、N227、L229、F241等氨基酸殘基上。

表1 分子對接顯示AS-IV與Notch1蛋白之間存在結(jié)合關(guān)系Tab.1 Molecular docking showed a binding relationship between AS-IV and Notch1 protein

圖5 分子對接顯示AS-IV與notch1蛋白的結(jié)合位點Fig.5 Molecular docking showed the binding site of AS-IV to notch1 protein

3 討 論

糖尿病腎病屬中醫(yī)學(xué) “消渴、虛勞、水腫”等疾病范疇。黃芪為豆科植物,是中醫(yī)常用的“益氣藥”,具有補(bǔ)氣升陽、益氣固表、利水消腫、托瘡生肌的功效,至今已有兩千多年的藥用歷史,被廣泛用于糖尿病及腎臟疾病的治療。黃芪甲苷是黃芪主要活性成分之一,本研究探討黃芪甲苷對足細(xì)胞活性和凋亡的影響,并進(jìn)一步探究其潛在的作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn),高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞后,細(xì)胞活性降低,凋亡水平升高,抗凋亡蛋白(Bcl-2)表達(dá)降低,凋亡蛋白(Bax、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3)表達(dá)升高;而通過黃芪甲甘處理后能夠改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞活性降低和凋亡。當(dāng)足細(xì)胞受到損傷時,Nephrin和Podocin等足細(xì)胞相關(guān)蛋白在足細(xì)胞裂孔膜丟失,使腎小球濾過電荷屏障減弱,促進(jìn)蛋白尿的發(fā)生;同時,足細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2、p53、NF-κB等凋亡通路可被激活,誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡[3,8]。本研究發(fā)現(xiàn),高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞Nephrin和Podocin蛋白丟失,足細(xì)胞損傷加重,而黃芪甲苷處理則能改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞Nephrin和Podocin蛋白丟失。

盡管糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜,但越來越多的證據(jù)表明,線粒體功能障礙在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[9]。人糖尿病腎小管和腎小球中線粒體蛋白表達(dá)較少,其中足細(xì)胞對線粒體功能障礙很敏感[10]。有研究發(fā)現(xiàn),在鏈脲佐菌素(STZ) 誘導(dǎo)的DN 動物模型和高脂肪飲食誘導(dǎo)的腎小球病變的動物模型中,足細(xì)胞線粒體均出現(xiàn)異常,表明足細(xì)胞線粒體功能障礙在DN 發(fā)病機(jī)制中的重要性[11-12]。還有研究發(fā)現(xiàn),調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài),改善線粒體功能障礙,能夠預(yù)防糖尿病腎病中的足細(xì)胞損傷[13-14]。本研究通過JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位。在正常線粒體內(nèi),JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物,發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光;而在不健康的線粒體中,由于膜電位的下降或喪失,JC-1只能以單體的形式存在于胞漿中,產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)果發(fā)現(xiàn),高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞綠色熒光增強(qiáng),ATP含量降低,而黃芪甲苷處理則增加紅色熒光信號,ATP含量升高,表示黃芪甲苷能夠改善高糖誘導(dǎo)的線粒體功能障礙。

許多研究表明,Notch信號通路的異常表達(dá)與糖尿病腎病及足細(xì)胞的具有密切關(guān)系。Notch通路在糖尿病腎病腎活檢標(biāo)本中以及db/db2 型糖尿病腎病模型中發(fā)現(xiàn)Notch通路被激活[15-16],而激活Notch通路促進(jìn)糖尿病蛋白尿的發(fā)生[17-18]。靶向Notch能夠通過抑制鏈霉菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中TGF-β/Smad3信號通路激活來減輕腎臟纖維化[19];MicroRNA-145-5p通過靶向Notch信號通路降低高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn),黃芪甲苷能夠抑制高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞的Notch信號通路激活,并進(jìn)一步通過分子對接實驗發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷和Notch1 具有結(jié)合位點,暗示黃芪甲苷通過直接與Notch1 配體結(jié)合,從而抑制Notch信號。

總而言之,本研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能夠改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷和線粒體功能障礙,并且其可能通過抑制Notch信號發(fā)揮上述作用。為防治糖尿病腎病提供新的治療思路奠定理論基礎(chǔ)。