宋 淵 ,王海剛 ,何志軍 ,劉 濤 ,梁旭東 ,何元旭 ,沈稼軒,張團(tuán)莊

(1.甘肅省中醫(yī)院手外二科,甘肅蘭州 730050;2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院,甘肅蘭州 730030;3.甘肅省中醫(yī)院足踝外科,甘肅蘭州 730050)

皮瓣移植技術(shù)作為顯微外科及骨科領(lǐng)域的重要技術(shù),已被廣泛應(yīng)用于整形外科等其他特殊領(lǐng)域。但皮瓣移植術(shù)后經(jīng)常發(fā)生皮瓣壞死,有臨床報(bào)道壞死率高達(dá)10%～15%[1]。皮瓣的缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion,I/R)是指缺血組織重新開放血流時(shí),組織的缺血狀態(tài)不但沒有改善,損傷反而加重的現(xiàn)象[2]。目前發(fā)現(xiàn)的與皮瓣缺血再灌注損傷相關(guān)的信號(hào)通路主要有p38MAPK、JNK、ERK、PI3K、PPARγ、NF-κB信號(hào)通路,p38MAPK、JNK、ERK都屬于MAPKs的亞類[3],其中p38MAPK信號(hào)通路被細(xì)胞內(nèi)各種環(huán)境刺激及炎性刺激所激活,在皮瓣缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要通過促進(jìn)組織微血管再生、減輕組織炎癥反應(yīng)以及抑制細(xì)胞凋亡等手段來提高皮瓣存活率[6-7]。但是中醫(yī)藥因其多中心、多靶點(diǎn)的作用,對(duì)治療皮瓣缺血再灌注損傷具有獨(dú)特的優(yōu)勢。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),消腫止痛合劑可明顯降低軟組織白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子的表達(dá)水平,在一定程度上阻止外傷后炎癥介質(zhì)的釋放[8]。本研究應(yīng)用消腫止痛合劑,借助分子生物學(xué)技術(shù),探討皮瓣缺血再灌注損傷過程中p38MAPKPPARγ/NF-κB信號(hào)通路的作用機(jī)制,以期為活血化瘀類中藥治療皮瓣缺血再灌注損傷提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF 級(jí)SD 大鼠180只,雌雄各半,體質(zhì)量為200～220 g,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度控制在24～26℃,濕度控制在45%～60%,定期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室消毒,光照為12 h光照、12 h黑暗晝夜交替循環(huán),進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)。動(dòng)物合格證編號(hào):No.62001000 000533;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(甘)2020-0009;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(甘)2020-0001。甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)文號(hào):2020-287。

1.1.2 主要試劑 消腫止痛合劑由甘肅省中醫(yī)院制劑中心提供(批準(zhǔn)文號(hào):甘藥制字Z04 000844;生產(chǎn)批號(hào):20200804);SB203580(批 號(hào):HY-10256)、GW9662(批號(hào):HY-16578)、PDTC(批號(hào):HY-18738)均購自MCE(中國上海)皓元生物科技有限公司;蘇木素染液(批號(hào):CR2011040)、伊紅染液(批號(hào):CR2012206)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;PCR擴(kuò)增試劑(批號(hào):A2A1652)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào):A2A1186)均購自上海依可賽公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)分組,將180只大鼠按體質(zhì)量編號(hào)后隨機(jī)分為6 組,A 組(模型對(duì)照組)、B組(假手術(shù)組)、C組(消腫止痛合劑組)、D 組(p38MAPK 抑制劑組)、E 組(PPARγ抑制劑組)、F組(NF-κB抑制劑組),每組各30只。

1.2.2 動(dòng)物造模 術(shù)前灌胃及注射信號(hào)通路阻斷劑,消腫止痛合劑組、p38MAPK 抑制劑組、PPARγ抑制劑組、NF-κB 抑制劑組給予消腫止痛合劑灌胃(100 g/m L),模型對(duì)照組、假手術(shù)組以同體積0.9%氯化鈉注射液灌胃;各組右下腹腔注射,p38MAPK 抑制劑組以SB203580(1.5 mg/100 g)注射,PPARγ抑制劑組GW9662(0.2 mg/100 g)注射,NF-κB抑制劑組以PDTC(10 mg/100 g)注射。設(shè)計(jì)皮瓣大小為8 cm×2 cm 矩形隨意皮瓣,皮瓣蒂位于尾端雙側(cè)髂嵴連線上,皮瓣縱軸與大鼠長軸平行,左右對(duì)稱,沿設(shè)計(jì)畫線行皮瓣手術(shù),除假手術(shù)組外其余各組均行皮瓣缺血處理(皮瓣手術(shù)+夾閉血管蒂)。

1.2.3 動(dòng)物取材 在術(shù)后1 h、24 h、7 d,隨機(jī)將大鼠麻醉后,切取皮瓣取出置于-80℃冰箱中保存待用。

1.2.4 術(shù)后形態(tài)學(xué)觀察及皮瓣存活面積 分別在術(shù)后1 d、3 d、7 d三個(gè)時(shí)相觀察各組大鼠背部皮瓣的大體形態(tài)并采集圖像,將采集到的照片輸入到圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus.V6.0)進(jìn)行分析并計(jì)算皮瓣存活率,皮瓣壞死標(biāo)準(zhǔn)為:皮瓣表面痂皮形成、顏色變黑、質(zhì)地變硬、無彈性。皮瓣存活率的計(jì)算公式如下:

皮瓣存活率(%)=皮瓣存活面積/皮瓣總面積×100%。

1.2.5 HE染色 將制作好的石蠟切片依次進(jìn)行脫蠟、沖洗、切片水化,蘇木素、伊紅染色后的切片依次進(jìn)入75%、80%、95%、100%的乙醇中各5 min進(jìn)行切片脫水,再依次放入二甲苯一號(hào)、二甲苯二號(hào)各5 min進(jìn)行切片透明,顯微鏡下觀察并采集圖像信息。

1.2.6 TUNEL 染色 同上述步驟制作石蠟切片,脫蠟、脫水,晾干后使用胰蛋白酶K 試劑處理切片,將反應(yīng)液滴加至切片上,蓋玻片后固定后放置于濕盒內(nèi),保持濕盒內(nèi)一定濕度,置于37℃恒溫箱中孵育1 h,PBS洗滌,DAB 染色切片,蘇木素復(fù)染,將染色后的切片依次進(jìn)入75%、80%、95%、100%的乙醇中各5 min進(jìn)行切片脫水,再依次放入二甲苯一號(hào)、二甲苯二號(hào)各5 min進(jìn)行切片透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察細(xì)胞并采集圖像信息。

1.2.7 qRT-PCR 檢測 將-80℃保存待用的皮瓣組織加入裂解液裂解,然后將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 mL去酶的EP管內(nèi),在EP管內(nèi)依次加入氯仿及異丙醇,4℃環(huán)境下置于離心機(jī)離心15 min(12 000 r/min)后,棄去上清液,保留沉淀,待沉淀干燥后向管內(nèi)加入不含RNA 酶的水進(jìn)行溶解,保存于-80℃低溫冰箱。逆轉(zhuǎn)錄合成m RNA,加入反轉(zhuǎn)錄試劑充分混勻。PCR反應(yīng)按照Takara Prime Ex TaqTMⅡPCR 試劑盒說明書進(jìn)行操作,PCR 條件:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,60℃退火,40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)31 s,最后進(jìn)行溶解。PCR 引物由湖南艾科瑞生物工程有限公司提供,引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Tab.1 PCR sequence primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)中所有的計(jì)量資料以()表示,采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較。若方差齊符合正態(tài)分布,采用Levene’s進(jìn)行組間多重比較;若方差不齊,不符合正態(tài)分布,采用Dunnett-T3進(jìn)行組間多重比較。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組間的比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠形態(tài)學(xué)觀察(圖1)

圖1 各組大鼠術(shù)后1 d、3 d、7 d皮瓣形態(tài)觀察Fig.1 Observation of flap morphology on day 1,day 3,and day 7 after operation in each group

術(shù)后1 d:各組大鼠均存活,無死亡,麻醉劑效果逐漸消失,大鼠漸漸蘇醒,各組大鼠均未見進(jìn)食進(jìn)水,皮瓣皮溫較周圍皮膚溫度較低,皮瓣邊緣見淤血腫脹,傷口未愈合,無出血及滲出,未觀察到皮瓣明顯壞死,各組間大鼠形態(tài)無明顯異常。

術(shù)后3 d:各組大鼠全部蘇醒且恢復(fù)飲食,B組大鼠較A 組、C組、D 組、E組、F組大鼠活躍,且進(jìn)食進(jìn)水量較多,皮瓣邊緣未觀察到明顯的出血及滲出,各組大鼠腫脹較前均有消退,A 組和E 組大鼠皮瓣遠(yuǎn)端有少量壞死,其余各組大鼠觸壓皮瓣彈性良好,表面無黑色痂皮形成,判斷無皮瓣壞死現(xiàn)象。

術(shù)后7 d:各組大鼠活動(dòng)迅速,進(jìn)食、進(jìn)水量恢復(fù)正常,皮瓣存活部分與壞死部分界限清楚,皮瓣成活區(qū)域毛發(fā)的生長狀況良好,皮瓣色澤紅潤,皮溫正常,而壞死區(qū)域則見黑色痂皮形成,皮瓣皮膚失去彈性,皮溫低于周圍組織。A組皮瓣壞死面積最大,B組存活皮瓣面積最大,A組和E組大鼠皮瓣壞死面積明顯大于其他組,D組和F組大鼠皮瓣存活面積無明顯區(qū)別。

2.2 各組大鼠皮瓣存活率的比較

在術(shù)后1 d、3 d、7 d分別統(tǒng)計(jì)各組大鼠的皮瓣存活面積并計(jì)算皮瓣存活率(表2)。術(shù)后1 d,各組大鼠皮瓣存活面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。術(shù)后3 d,與A 組比較,B組及F組大鼠皮瓣存活率明顯較高,而E組大鼠皮瓣存活率明顯較低(P＜0.05);與B組相比,A組和E組大鼠皮瓣存活率明顯較低(P＜0.05)。術(shù)后7d,與A組相比,B組、C組、D組、F組大鼠皮瓣存活率均明顯較高(P＜0.05),但與E組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與B組相比,A 組、E 組大鼠皮瓣存活率均明顯較低(P＜0.05)。

表2 術(shù)后1 d、3 d、7 d 6組大鼠皮瓣平均存活率Tab.2 The average survival rate(%)of flaps in six groups 1,3 and 7 days after operation (%,n=30)

2.3 大鼠皮瓣HE染色的觀察結(jié)果(圖2)

圖2 各組大鼠術(shù)后1 h/24 h/7 d皮瓣組織HE染色切片示例圖(×200倍)Fig.2 Sample diagram of HE stained section of skin flap in each group 1 h/24 h/7 d after operation(×200 times)

術(shù)后1 h:各組大鼠皮瓣組織結(jié)構(gòu)排列整齊,細(xì)胞間有極少量炎性細(xì)胞存在,各組無明顯差異。

術(shù)后24 h:A組大鼠皮瓣組織排列紊亂,細(xì)胞核稀疏,可見明顯水腫,組織間可見較多炎性細(xì)胞浸潤;E組大鼠皮瓣組織輕度水腫,見極少量炎性細(xì)胞浸潤,其他皮瓣組織有輕微腫脹,但炎性細(xì)胞較A組明顯減少。

術(shù)后7 d:A組大鼠皮瓣組織細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞核稀疏,大量白細(xì)胞浸潤;B組大鼠皮瓣組織細(xì)胞呈單層排列,結(jié)構(gòu)整齊;C組、D組、F組大鼠皮瓣水腫程度較輕,細(xì)胞結(jié)構(gòu)較整齊,組織間隙可見少量炎癥細(xì)胞浸潤;E組大鼠可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列無順序,細(xì)胞核與周圍胞質(zhì)界限不清,細(xì)胞核可見部分破壞,細(xì)胞輕度水腫。

2.4 大鼠皮瓣TUNEL染色結(jié)果

TUNEL法染色結(jié)果如圖3和表3所示,B 組大鼠皮瓣組織結(jié)構(gòu)正常,核小體清晰、完整,僅有少量凋亡的細(xì)胞出現(xiàn),分布在正常的結(jié)構(gòu)周圍;C 組和D組、F組大鼠皮瓣組織整體結(jié)構(gòu)較完整、輕度水腫,細(xì)胞核清晰,少量凋亡細(xì)胞出現(xiàn);A 組與E 組皮瓣組織失去正常的組織結(jié)構(gòu),皮膚組織層次不清,大量凋亡的細(xì)胞出現(xiàn),染色質(zhì)濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質(zhì)分割、成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡狀態(tài)出現(xiàn)。

圖3 各組大鼠皮瓣組織TUNEL法染色結(jié)果Fig.3 TUNEL staining results of rat skin flap tissues in each group

表3 大鼠皮瓣組織內(nèi)細(xì)胞凋亡百分率Tab.3 Percentage of apoptosis in flap tissue of rats in each group (%)

2.5 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

術(shù)后1 h:與A 組相比,其他組大鼠皮瓣組織中p38MAPK(B、C、D、E、F組)、NF-κB(B、C、D、F組)的mRNA表達(dá)量降低明顯(P＜0.01,P＜0.05),PPARγ的m RNA 表達(dá)量B 組最高,相對(duì)于A組來說,C、D組提高明顯(P＜0.01,P＜0.05),E 組PPARγ的mRNA表達(dá)量低于A 組,但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與B組相比,其他組大鼠皮瓣組織中p38MAPK、NF-κB的mRNA 表達(dá)量均有所升高,其中p38MAPK的m RNA 表達(dá)量C、E 組提高比較明顯(P＜0.01,P＜0.05),而PPARγ 的mRNA 表達(dá)量明顯下降(P＜0.01,P＜0.05,圖4)。

術(shù)后24 h:與A 組相比,其他組大鼠皮瓣組織中p38MAPK、NF-κB 的mRNA表達(dá)量均低于A組,PPARγ的mRNA表達(dá)量B組最高,C組次之(P＜0.01,P＜0.05),E 組PPARγ的mRNA 表達(dá)量雖低于A組,但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與B組相比,其他組大鼠皮瓣組織中p38MAPK、NF-κB的mRNA表達(dá)量均有升高,其中p38MAPK 的表達(dá)A 組最高,E 組和C 組次之(P＜0.01,P＜0.05),D組、F組表達(dá)雖有所提高,但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,PPARγ的mRNA 表達(dá)量D、E、F組明顯下降(P＜0.01,圖4)。

術(shù)后7 d:A 組大鼠皮瓣組織中p38MAPK、NF-κB的mRNA表達(dá)量最高,B組PPARγ的mRNA 表達(dá)量最高。與A組相比,C組大鼠皮瓣組織中p38MAPK、NF-κB的mRNA表達(dá)被抑制(P＜0.01);當(dāng)加入特異性抑制劑SB203580、PDTC后,可觀察到D 組、F組大鼠皮瓣組織中p38MAPK、NF-κB的mRNA 表達(dá)進(jìn)一步被抑制。相較于A 組,C 組大鼠皮瓣組織中PPARγ的m RNA 表達(dá)有所升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)加入GW9662信號(hào)通路抑制劑后,E 組大鼠皮瓣組織中PPARγm RNA 的升高趨勢受到抑制。與B組相比,其他組大鼠皮瓣組織中p38MAPK、NF-κB的m RNA 表達(dá)量有所升高,其中p38MAPK 的表達(dá)A 組最高,E 組和C 組次之(P＜0.01,P＜0.05),D組、F組表達(dá)雖有所提高,但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;NF-κB的m RNA 表達(dá)E 組提高顯著,C 組次之(P＜0.01,P＜0.05),D 組雖有提高,但并不明顯;PPARγ 的m RNA 表達(dá)量其他組均明顯下降(P＜0.01,圖4)。

圖4 術(shù)后1 h/24 h/7 d各組大鼠皮瓣組織中P38MAPK、PPARγ、NF-κB的mRNA表達(dá)水平Fig.4 mRNA expression levels of P38MAPK,PPARγand NF-κB in rat flaps 1 h/24 h/7 d after operation

3 討 論

皮瓣缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion,I/R)廣泛存在于皮瓣移植術(shù)后,常被認(rèn)為是組織缺氧缺血-恢復(fù)血供一系列動(dòng)態(tài)變化過程,由于其損傷機(jī)制的復(fù)雜性及交互性,此類研究尚未取得突破性進(jìn)展,如何治愈或徹底預(yù)防皮瓣缺血再灌注損傷至今仍是困擾臨床醫(yī)生的一大難題。近年來,中醫(yī)藥在治療皮瓣缺血再灌注損傷方面取得了重大突破,某些具有活血化瘀功效的中藥制劑被證明亦能提高大鼠隨意皮瓣生存面積,促進(jìn)VEGF的表達(dá)[9],中醫(yī)活血化瘀法能夠促進(jìn)COPD、股骨頭壞死、腦缺血再灌注等疾病的血管新生和血管重塑[10-13]。課題組前期亦使用具有活血化瘀的血塞通注射大鼠隨意皮瓣模型,促進(jìn)VEGF的表達(dá)水平升高,可以減輕皮瓣移植術(shù)后水腫,改善靜脈淤血,促進(jìn)皮瓣成活[14]。消腫止痛合劑由甘肅省中醫(yī)院李盛華主任醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來,藥物組成為當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、生地、赤芍、三七、青皮、木香、澤蘭、甘草?？v觀全方,補(bǔ)血不留瘀,活血不傷正,共奏行氣散瘀,活血止痛,消腫散結(jié)之功[15-16]。雖然中醫(yī)藥對(duì)于皮瓣缺血再灌注損傷的治療作用已經(jīng)得到臨床認(rèn)可,但其具體作用機(jī)制尚不明確,因此,研究和分析中醫(yī)藥治療皮瓣缺血再灌注損傷的相關(guān)機(jī)制就具有非常重要的意義。

本研究選擇SB203580 特異性抑制劑靶向阻斷p38MAPK 信號(hào)通路的激活,SB203580 的主要作用機(jī)制是競爭性結(jié)合p38MAPK 在細(xì)胞中的ATP 結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)而抑制p38MAPK 通路的激活,SB203580通過靶向抑制p38MAPK 的磷酸化,并使其失去激酶活性。為了證實(shí)靶向阻斷NF-κB信號(hào)通路可減輕組織的炎癥反應(yīng),本研究造模前在大鼠腹腔注射NFκB信號(hào)通路抑制劑PDTC,術(shù)后觀察到大鼠皮瓣的存活率較模型對(duì)照組明顯提高,HE 染色結(jié)果顯示大鼠皮瓣組織內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)無破壞,相較于模型組大鼠,細(xì)胞水腫情況明顯較輕,細(xì)胞炎癥浸潤也明顯減少,這提示p38MAPK 信號(hào)通路及NF-κB信號(hào)通路在皮瓣缺血再灌注損傷中對(duì)炎癥因子的釋放均呈現(xiàn)正向調(diào)控作用,這兩條信號(hào)通路的抑制將有助于皮瓣壞死的治療及預(yù)防,這為將來尋找信號(hào)通路特異性阻斷藥物提供了可能性。本研究通過使用PPARγ 信號(hào)通路特異性阻斷劑GW9662來抑制PPARγ的活性,探討PPARγ信號(hào)通路在皮瓣缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),術(shù)后7 d,相較于假手術(shù)組,模型組大鼠細(xì)胞中PPARγmRNA 的表達(dá)比較顯著,消腫止痛合劑處理后PPARγm RNA 的表達(dá)量進(jìn)一步增加,然而,當(dāng)加入特異性阻斷劑GW9662 后,消腫止痛合劑引起的PPARγmRNA 的表達(dá)則被抑制。這說明PPARγ信號(hào)通路在被激活時(shí)可以有效抑制組織的炎性反應(yīng),在該信號(hào)通路被特異性阻斷后,本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PPARγ抑制劑組大鼠皮瓣存活率較p38MAPK 抑制劑組和NF-κB 抑制劑組明顯降低,這些證據(jù)均證實(shí)了PPARγ信號(hào)通路在皮瓣缺血再灌注損傷中對(duì)炎癥因子的釋放是呈現(xiàn)負(fù)向調(diào)控作用的。

本研究是對(duì)p38MAPK-PPARγ/NF-κB 信號(hào)通路進(jìn)行單獨(dú)靶向阻斷而進(jìn)行研究,并在中藥干預(yù)的基礎(chǔ)上觀察其m RNA 表達(dá)量的變化,是本研究的創(chuàng)新點(diǎn)。本研究雖已證實(shí)消腫止痛合劑可以減輕大鼠缺血模型的炎癥反應(yīng),減少凋亡細(xì)胞的生成,并且可以抑制p38MAPK-PPARγ/NF-κB 信號(hào)通路的激活,進(jìn)而促進(jìn)皮瓣的存活率,但具體作用靶點(diǎn)及相關(guān)機(jī)制仍未闡明,且國內(nèi)外關(guān)于中醫(yī)藥治療此類疾病的相關(guān)研究較少,研究質(zhì)量較低、研究層面表淺,缺乏一定的客觀性和標(biāo)準(zhǔn),沒有統(tǒng)一的臨床治療指南,缺乏大規(guī)模、質(zhì)量高的臨床研究。因此,中醫(yī)藥治療I/R 的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究,目前課題組基于中醫(yī)“祛瘀生新”理論研究消腫止痛合劑治療皮瓣缺血再灌注損傷中p38MAPK-PPARγ/NF-κB 信號(hào)通路作用機(jī)制及全基因表達(dá)譜分析研究已取得重大突破,相信隨著該研究的不斷深入,將有助于為I/R 及軟組織損傷等相關(guān)疾病的防治提供新的思路和方案。