楊 洪 王立豐 代龍軍 郭冰冰

（1. 中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所，?？?571101；2. 農業(yè)農村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，?？?571101；3. 省部共建國家重點實驗室培育基地—海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，?？?571101；4. 農業(yè)農村部儋州熱帶作物科學觀測實驗站，?？?571101）

橡膠是重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資，根據(jù)來源不同分為天然橡膠和合成橡膠。天然橡膠在彈性、耐磨性和延展性等方面具有合成橡膠不可替代的優(yōu)勢，在一些重要工業(yè)領域（如航空、航天和重型汽車等制造業(yè)）具有廣泛的應用。巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis，簡稱橡膠樹）是重要的熱帶經濟作物，其產生的膠乳是天然橡膠的主要來源。我國是天然橡膠消費大國，但是適宜種植橡膠樹的地區(qū)和土地面積卻十分有限，使得我國的天然橡膠消費不得不長期依賴進口。隨著社會經濟的不斷發(fā)展，我國對天然橡膠的需求量還在逐年增加，供需缺口還將進一步增加。目前，我國天然橡膠產業(yè)面臨植膠區(qū)域有限且種植趨于飽和、天然橡膠價格持續(xù)低迷等問題，已很難通過擴大種植面積來增加產量［1］。面對嚴峻的現(xiàn)實情況，大幅度提高橡膠樹單位面積產量是促進我國天然橡膠產業(yè)健康發(fā)展及緩解天然橡膠供需失衡壓力的最佳途徑。

死皮（tapping panel dryness，TPD）是一種橡膠樹所特有的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為橡膠樹產排膠過程割面部分或全部喪失排膠能力。與其他作物不同，橡膠樹的生產周期長達30 年［2］。死皮是影響橡膠樹高產穩(wěn)產的重要因素之一，也是世界天然橡膠產業(yè)面臨的共性問題。據(jù)統(tǒng)計，我國主要植膠區(qū)域死皮發(fā)生率高達24.71%，停割率為14.55%［3］。此外，隨著高產無性系（一般表現(xiàn)為耐割耐刺激能力差）和乙烯刺激采膠技術的推廣，死皮發(fā)生率和嚴重程度呈逐年上升趨勢［4-5］。死皮已成為橡膠樹單位面積產量提高的主要限制因子。死皮是一種多因素引起的復雜的生理綜合癥，至今對其發(fā)生發(fā)展規(guī)律的認知還十分有限。已有研究表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）代謝失衡是橡膠樹死皮發(fā)生的關鍵過程［6-10］。線粒體是細胞活動的“能量工廠”，同時也是ROS的重要產生部位。在植物細胞質基質和線粒體中，抗氧化酶和抗氧化代謝物共同調節(jié)細胞內ROS產生與清除平衡［11］。

目前，圍繞橡膠樹死皮的發(fā)生發(fā)展規(guī)律［3，12］、生理［13］、分子機制［14-16］及死皮防治［17-18］等多個方面已經進行了大量研究，而在樹皮細胞超微結構及抗氧化系統(tǒng)方面的研究較少。本文通過研究不同程度死皮橡膠樹樹皮線粒體超微結構及ROS相關基因表達量變化規(guī)律，從微觀角度探討其與橡膠樹死皮動態(tài)發(fā)生過程的關系，以期深化對橡膠樹死皮發(fā)生機理的理解，為大幅提高橡膠樹單位面積產量和制定有效的TPD 防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所有樣品均采自中國熱帶農業(yè)科學院試驗場紅洋隊開割10 a（種植于2003 年，開割于2010 年）的橡膠樹品系熱研73397，于2020 年8 月開始割膠，根據(jù)連續(xù)6 刀（常規(guī)割膠，S/2 d/3）的排膠情況確定死皮程度。

1.2 試驗方法

1.2.1 死皮等級確定

將所選橡膠樹分為健康、輕度死皮和重度死皮，分類標準如下：排膠正常且膠乳流速均勻的樹為健康樹（標記為H），死皮長度為2 cm至占割線總長度的1/4為輕度死皮（標記為T2），死皮長度介于割線總長度的1/2至3/4為重度死皮（標記為T4）。

1.2.2 電鏡樣品制備與超微結構觀察

將確定部位割膠耗皮用報紙接住后，立即將靠近形成層部位的韌皮組織切下，并在冰上將切下的組織切割成1 mm×1 mm 的小塊，然后迅速投入體積分數(shù)2%戊二醛固定液中固定，帶回實驗室用真空泵抽氣直至樣品沉底，室溫放置2 h進行前固定，之后用pH 為7.4 的磷酸緩沖液（PBS）漂洗3 次，每次15 min，再用1%的鋨酸進行后固定5 h，并用0.1 mol·L-1PBS（pH 為7.4）漂洗3 次，每次15 min；將固定好的樣品依次放入體積分數(shù)30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液進行逐級脫水，每次1 h；然后將樣品依次放入丙酮與環(huán)氧樹脂812包埋劑體積比為3∶1、1∶1、1∶3、0∶1的混合液中進行滲透處理，每次120 min，將滲透好的樣品插入包埋板后37 ℃烘箱過夜，再在60 ℃烤箱聚合48 h；最后用Leica 冷凍超薄切片機（UC7，德國）進行超薄切片，厚度為60～80 nm。切片再經醋酸鈾和枸櫞酸鉛各染色25 min 后，在透射電鏡（HT7700，日本）下觀察并拍照。

1.2.3 RNA提取及cDNA反轉錄

橡膠樹樹皮總RNA 采用RNA prep Pure Plant Kit（DP441，天根生化科技（北京）有限公司）試劑盒提取，提取步驟按試劑盒說明書操作。提取的總RNA 通過測定OD260和OD280進行質量分析和定量。cDNA 反轉錄采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa）進行。

1.2.4 qRT-PCR檢測

根據(jù)橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫［19］中獲得的ROS 相關基因序列，利用Primer Premier 6.0 軟件設計qRT-PCR引物。引物序列如表1所示。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequence used in this study

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel 2016 對基因表達數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 23 軟件t-test 工具對基因表達倍數(shù)進行差異顯著性分析，采用Origin 9.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 死皮發(fā)生過程樹皮線粒體超微結構的變化

健康樹樹皮線粒體（M）未見明顯腫脹，結構完整，大部分線粒體膜完整，嵴清晰（見圖1A）。輕度死皮樹線粒體（M）輕微腫脹，大多膜結構完整，其內基質局部略顯變淡，嵴減少（見圖1B）。

重度死皮樹樹皮線粒體（M）嚴重腫脹，大部分線粒體呈不規(guī)則形變大，膜內基質溶解，嵴消失、空泡變，部分嚴重者，膜破損，基質外溢（見圖1C）。

圖1 樹皮線粒體超微結構A.健康樹；B.輕度死皮樹；C.重度死皮樹；M.線粒體；Pb.質體小球；CW.細胞壁；RER.粗面內質網；V.液泡；Go.高爾基體Fig.1 Ultrastructure of mitochondrial of rubber tree bark A.Healthy tree；B.Mild TPD tree；C.Severe TPD tree；M.Mitochondrial；Pb.Plastoglobuli；CW.Cell wall；RER.Rough endoplasmic reticulum；V.Vacuole；Go.Golgi apparatus

2.2 死皮發(fā)生過程抗氧化酶基因的表達

為明確橡膠樹死皮發(fā)生過程ROS 產生與清除關鍵基因的表達模式，利用qRT-PCR 技術分析了過氧化物酶（peroxidase，HbPOD1～7）、過氧化氫酶（catalase，HbCAT）基因的表達模式（見圖2）。結果顯示，HbPOD1、HbPOD4、HbPOD5、HbPOD6和Hb-POD7基因在死皮樹樹皮中的表達量均顯著低于健康樹且死皮越嚴重其表達量越低。HbPOD2基因在輕度、重度死皮樹樹皮中表達均顯著高于健康樹，分別為健康樹表達量的15倍、12倍。HbPOD3基因在輕度死皮樹樹皮中的表達量最高，約為健康樹的2.6倍，而在重度死皮樹樹皮中的表達量與健康樹基本一致。HbCAT基因在樹皮中的表達隨著死皮的發(fā)生逐漸降低，其中在健康樹和輕度死皮樹中的表達量分別為重度死皮樹中的2.6倍、1.8倍（見圖2）。

圖2 抗氧化酶基因在橡膠樹死皮發(fā)生過程的表達A～G.HbPOD1-HbPOD7 基因表達；H.HbCAT 基因表達；死皮級別H，健康樹；死皮級別T2，輕度死皮樹；死皮級別T4，重度死皮樹；*和**分別表示死皮樹與健康樹差異顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）；下同F(xiàn)ig.2 Expression of antioxidant enzymatic genes during TPD process in H.brasiliensis A-G.The expression of HbPOD1-HbPOD7；H.The expression of HbCAT；TPD level H，Healthy tree；TPD level T2，mild TPD tree；TPD level T4，Severe TPD tree；* and ** indicate significan（tP＜0.05）and extremely significan（tP＜0.01）differences between TPD trees and healthy trees，respectively；The same as below

2.3 死皮發(fā)生過程抗氧化代謝物基因表達模式

通過熒光定量PCR 技術分析了重要抗氧化代謝物基因在橡膠樹死皮發(fā)生過程的表達量，含谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione S-transferase，HbGST1～4）基因4 個、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，HbPPO）、L-抗壞血酸氧化酶（L-ascorbate oxidase，HbAAO）基因各1個（見圖3）。結果顯示，HbGST1、HbGST2、HbPPO3個基因在死皮樹樹皮中的表達量高于健康樹，不同的是HbGST2和HbPPO在重度死皮樹的表達略低于輕度死皮樹，HbGST1的表達量隨著死皮嚴重程度升高；其余的3個基因（HbGST3、HbGST4、HbAAO）在死皮樹樹皮中的表達量均低于健康樹，其中Hb-GST3和HbAAO的表達量在重度死皮樹中表達量最低，HbGST4基因的表達量不受死皮程度影響。

圖3 抗氧化代謝物基因在橡膠樹死皮發(fā)生過程的表達A～D.HbGST1-HbGST4基因表達；E.HbPPO基因表達；F.HbAAO基因表達Fig.3 Expression of antioxidant metabolites genes during TPD process in H.brasiliensis A-D.The expression of HbGST1-HbGST4；E.The expression of HbPPO；F.The expression of HbAAO

3 討論

細胞及細胞器超微結構分析是研究植物異常生理活動的重要細胞學手段。盧亞莉等［20］利用光學顯微鏡技術研究了不同程度死皮樹樹皮中的乳管、篩管、石細胞和單寧等的形態(tài)結構的變化，其研究結果表明隨著死皮程度的增加乳管排列越加紊亂無規(guī)律，膨大乳管數(shù)增加，篩管直徑減小，石細胞和單寧細胞增多。光學顯微鏡下，三級樹正常排膠部位樹皮結構與健康樹基本一致［20］。線粒體是細胞中重要的細胞器，也是細胞新陳代謝的重要組成部分。在植物中，線粒體通過與光合作用、光呼吸和細胞質代謝緊密相連維持細胞內氧化還原平衡［21］。因此，線粒體結構的完整與細胞穩(wěn)態(tài)、正常生理狀態(tài)息息相關。本研究的電鏡結果顯示，死皮發(fā)生過程橡膠樹樹皮線粒體超微結構發(fā)生明顯變化（見圖1）。健康樹樹皮大部分線粒體膜完整，嵴清晰，無明顯損傷。當死皮發(fā)生時，固縮、變大、變長的線粒體基質開始溶解、嵴開始消失，這必將對三羧酸循環(huán)和生物氧化代謝產生影響，從而影響細胞內物質和能量代謝。隨著死皮程度的進一步加深，線粒體腫脹加深并呈不規(guī)則形變，膜內基質大部分溶解，嵴消失、空泡變，部分嚴重者，膜破損，基質外溢。

過度割膠和過度刺激引起的ROS產生與清除失衡是引發(fā)橡膠樹死皮的重要因素［14-15，22］。一方面過度割膠和過度刺激增強線粒體中呼吸代謝，從而導致ROS大量產生；另一方面，割膠后ROS清除相關物質隨著膠乳排出而含量極低，細胞ROS清除能量減弱，導致ROS 的大量累積［4］。生理生化參數(shù)測定顯示，死皮樹中NAD（P）H 氧化酶和過氧化物酶活性顯著提高，黃色體破裂指數(shù)和ROS水平升高，還原性硫醇和抗壞血酸等ROS 清除劑含量降低，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶活性降低［4，23］。本研究利用熒光定量PCR 技術分析了ROS 產生、清除關鍵酶基因HbPODs、Hb-CAT（見圖2）和ROS 清除相關抗氧化代謝物Hb-GSTs、HbPPO、HbAAO基因的表達（見圖3）。基因表達結果顯示并不是所有的過氧化物酶在死皮樹中高表達，僅有HbPOD2、HbPOD3在死皮樹中的表達量顯著高于健康樹，其他5 個POD基因死皮樹的表達量均低于健康樹，預示HbPODs基因家族具有不同的分工。許聞獻等［24］通過分析過氧化物酶的同工酶分析發(fā)現(xiàn)造成死皮的過度割膠和過度刺激是通過誘導一些主酶帶的活性增強從而導致過氧化物酶活性提高，并不是所有同工酶活性都增強。根據(jù)本研究的結果推測HbPOD2和HbPOD3可能是橡膠樹死皮發(fā)生過程中過氧化物酶活性增強的主效過氧化物酶，未來可作為開發(fā)割膠強度、刺激強度和死皮發(fā)生的“標志”基因的備選基因。死皮樹HbCAT基因的表達下調且下調程度與死皮嚴重程度呈正相關，這與郭秀麗等［13］的生理生化測定結果一致。谷胱甘肽-S-轉移酶是廣泛存在于動植物中的一種多基因編碼的多功能超家族蛋白酶，在清除生物和非生物脅迫產生的氧化損傷中起著重要的作用［25-26］。在植物中，GSTs 基因家族成員在25～60，根據(jù)序列一致性、基因結構和活性位點可分為6 類［26］。范玉潔等［27］克隆了首個橡膠樹GSTs 家族成員HbGSTU1，該基因的表達受逆境脅迫和激素誘導等因素的調控，并且在死皮樹膠乳中的表達量較健康樹高，且隨著死皮程度的增加出現(xiàn)遞增的趨勢。本研究共分析了4 個不同于HbGSTU1的橡膠樹GSTs 家族基因的表達模式，結果顯示HbGST1和HbGST2在死皮樹樹皮中的表達量高于健康樹，這與范玉潔等［27］的研究結果一致，而HbGST3和HbGST4的表達趨勢則正好相反（見圖3）。這些基因表達的差異可能是因為HbGST1、HbGST2與HbGSTU1屬于同一亞類，具有類似的生物學功能，而HbGST3、HbGST4屬于另一GSTs基因家族亞類，具有不同的生物學功能。PPO 是一種結構復雜的含銅氧化還原酶，也是橡膠粒子凝固不可或缺的組份［28］。本研究也發(fā)現(xiàn)HbPPO在死皮樹中上調表達（見圖3）?？箟难?谷胱甘肽循環(huán)（ASA-GSH）是清除ROS 的重要抗氧化途徑［29］。AAO 是植物中廣泛存在的多銅氧化酶，也是ASAGSH 循環(huán)系統(tǒng)中的關鍵酶之一［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，HbAAO在死皮樹中表達下調（見圖3），暗示HbAAOs參與橡膠樹死皮發(fā)生過程ROS清除。

橡膠樹死皮是一個持續(xù)的動態(tài)發(fā)生過程，樹皮細胞或細胞器結構的變化可能是其發(fā)生的起始。因此，本研究利用透射電鏡技術觀察了健康樹和不同程度死皮樹樹皮線粒體超微結構，并對ROS代謝相關基因的表達模式進行了分析。本研究發(fā)現(xiàn)線粒體等細胞器氧化損傷是橡膠樹死皮發(fā)生的關鍵過程，而ROS相關基因可作為下一步開發(fā)死皮發(fā)生、割膠和刺激強度監(jiān)測的潛在“標志”基因。