楊菊 劉芹 劉寶瑞 魏嘉

我國(guó)胃癌的發(fā)病率和死亡率均居于惡性腫瘤的前三位[1]。目前免疫治療主要包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑及免疫細(xì)胞治療兩大類。隨著免疫治療的發(fā)展，2021年CheckMate-649結(jié)果的發(fā)布，確立了晚期胃癌一線治療的新標(biāo)準(zhǔn)，PD-1抗體聯(lián)合化療實(shí)現(xiàn)了胃癌全人群的全面獲益，但患者的中位生存期仍只有14個(gè)月左右[2]，晚期胃癌仍面臨預(yù)期生存短、一線治療失敗后缺乏有效治療手段的挑戰(zhàn)。2021年ESMO發(fā)布了CLDN18.2靶向嵌合抗原受體T(Chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T)細(xì)胞后線(既往≥2線)治療胃癌的數(shù)據(jù)，客觀緩解率高達(dá)61.1%[3]。尋找腫瘤高度特異的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)CAR-T細(xì)胞、TCR-T細(xì)胞或腫瘤疫苗是改善胃癌患者預(yù)后的策略之一。癌睪抗原是在生理情況下選擇性地表達(dá)在免疫豁免器官的一系列蛋白，通常表達(dá)在生殖細(xì)胞及胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞，病理情況下在多種腫瘤中高表達(dá)[4-5]。在功能上，癌睪抗原能夠促進(jìn)腫瘤的增殖與侵襲，還具有免疫原性與表達(dá)的選擇性，是腫瘤免疫治療的潛在靶點(diǎn)。同時(shí)癌睪抗原與腫瘤突變負(fù)荷及CD4+/CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)密切相關(guān)，還能作為免疫治療療效的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)[6]。以癌睪抗原為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的免疫治療手段包括腫瘤疫苗、TCR-T細(xì)胞及CAR-T細(xì)胞治療，相關(guān)臨床試驗(yàn)正在開(kāi)展。

目前關(guān)于胃癌癌睪抗原的研究多是針對(duì)特定或部分基因的[7]，尚無(wú)研究系統(tǒng)性地分析癌睪抗原在胃癌中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后和免疫微環(huán)境的影響。本研究擬利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選胃癌正常組織與腫瘤組織的差異表達(dá)基因，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)CTdatabase，選取差異表達(dá)的癌睪抗原，分析其對(duì)胃癌預(yù)后和免疫微環(huán)境的影響，為胃癌的免疫治療與靶點(diǎn)的尋找提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

利用R軟件(版本4.0.2)，通過(guò)TCGAbiolinks包中的TCGAanalyze_DEA函，從TCGA(https：//portal.gdc.cancer.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)下載32例胃癌癌旁組織和375例胃癌腫瘤組織樣本的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，下載與之對(duì)應(yīng)的患者臨床信息以做預(yù)后分析。利用DESeq2數(shù)據(jù)包進(jìn)行差異表達(dá)分析，當(dāng)P<0.05且|LogFC|>1時(shí)則被定義為差異表達(dá)基因。

1.2 差異表達(dá)且誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的癌睪抗原的篩選

在數(shù)據(jù)庫(kù)CTdatabase中選取已有文獻(xiàn)證實(shí)的能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)(體液免疫或細(xì)胞免疫)的癌睪抗原，并與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌中的差異表達(dá)基因進(jìn)行比對(duì)，選取差異表達(dá)的能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的癌睪抗原。

1.3 差異表達(dá)的癌睪抗原在胃癌中的生存分析

因低表達(dá)基因難以作為治療靶點(diǎn)，故將上述在腫瘤組織中顯著高表達(dá)且具有功能的癌睪抗原結(jié)合患者臨床生存信息，通過(guò)Kaplan-Meier分析，篩選與胃癌患者預(yù)后相關(guān)的癌睪抗原。并利用Cox回歸模型進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)與患者生存的多因素及單因素分析。

1.4 免疫浸潤(rùn)分析

將上述篩選得到的基因表達(dá)矩陣輸入CIBERSORT分析系統(tǒng)，分析相關(guān)基因與腫瘤中的不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

本研究的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均使用R軟件(版本4.0.2)，使用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)比較組間生存曲線差異。P值多重檢驗(yàn)校正采用Benjamini&Hochberg(BH)方法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的差異表達(dá)癌睪抗原篩選

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，共篩選出5 514個(gè)差異表達(dá)基因(圖1)。CTdatabase中目前已納入癌睪抗原218個(gè)，其中能誘導(dǎo)體液免疫或者細(xì)胞免疫的癌睪抗原有94個(gè)，將其與胃癌差異表達(dá)基因進(jìn)行比對(duì)，共獲得33個(gè)具有誘導(dǎo)免疫反應(yīng)功能的差異表達(dá)癌睪抗原。

圖1 胃癌正常組織與腫瘤組織中的表達(dá)差異基因

ARMC3、CDCA1、CEP55、CSAG2、CT45A1、CTAG2、CTCFL、CXorf61(KK-LC-1)、DDX53、IGF2BP3、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA12、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEC1、MAGEC2、KIF2C、MPHOSPH1、PLAC1、PRAME、SAGE1、SEMG1、SPAG17、SSX1、TTK在胃癌腫瘤組織中較正常組織高表達(dá)，且在文獻(xiàn)中被證實(shí)具有誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力。與正常組織相比，BAGE2、CCDC110、SPAG4、SPAG8、IGSF11、MAGEB2在胃癌腫瘤組織中表達(dá)較低(圖2)。

圖2 有誘導(dǎo)免疫反應(yīng)功能且表達(dá)差異的癌睪抗原

2.2 高表達(dá)癌睪抗原與胃癌患者生存分析

將在腫瘤組織中高表達(dá)的癌睪抗原與胃癌患者的生存信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CEP55、MAGEA10、MAGEA12、MAGEA3、MAGEC1、PLAC1高表達(dá)與胃癌患者較短生存時(shí)間顯著相關(guān)(P<0.05)。MAGEA4、MAGEA6、SAGE1高表達(dá)胃癌患者有較短生存趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CXorf61(KK-LC-1)、KIF2C、MPHOSPH1的高表達(dá)與胃癌患者的較長(zhǎng)生存期顯著相關(guān)(P<0.05)(圖3)。利用Cox回歸模型對(duì)相關(guān)基因與患者生存進(jìn)行多因素分析，結(jié)果提示CEP55與患者較短生存顯著相關(guān)(HR=1.463，95%CI：1.007～2.126，P=0.046)(表1)。

圖3 高表達(dá)癌睪抗原與胃癌患者生存曲線

表1 相關(guān)基因與患者生存的Cox回歸分析

2.3 高表達(dá)癌睪抗原與胃癌腫瘤組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

以腫瘤組織的表達(dá)水平中位數(shù)為分界，高于等于此則定義為高表達(dá)，低于此則定義為低表達(dá)。腫瘤組織中高表達(dá)的癌睪抗原與胃癌組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的潛在關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)CEP55、MAGEA10、MAGEA12、MAGEA3、MAGEC1、PLAC1高表達(dá)與胃癌組織中較多的具有抗腫瘤功能的M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)(P<0.05)(圖4)。

圖4 胃癌組織中高表達(dá)癌睪抗原與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)系

3 討論

目前僅有部分癌睪抗原的功能得到了研究，本研究從胃癌與癌旁正常組織表達(dá)差異的基因中篩選出33種具有誘導(dǎo)免疫反應(yīng)功能的癌睪抗原，其中有27種癌睪抗原在腫瘤組織中高表達(dá)，而剩余6種在正常組織中高表達(dá)。本研究為免疫治療靶點(diǎn)的篩選提供了基礎(chǔ)。

以癌睪抗原為基礎(chǔ)的免疫治療模式包括腫瘤疫苗和過(guò)繼性T細(xì)胞回輸技術(shù)。腫瘤疫苗通過(guò)表達(dá)特異性的、具有免疫原性的腫瘤抗原，在細(xì)胞因子或者趨化因子等佐劑的輔助下，激活機(jī)體抗腫瘤免疫，從而殺傷腫瘤細(xì)胞[8]。癌睪抗原在惡性腫瘤中表達(dá)率高，基于癌睪抗原設(shè)計(jì)的腫瘤疫苗具有適用范圍廣、無(wú)需測(cè)序的特點(diǎn)，節(jié)省了時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本，比如MAGEA1、MAGEA3、NY-ESO-1等都有相關(guān)腫瘤疫苗的設(shè)計(jì)和臨床試驗(yàn)開(kāi)展。本研究發(fā)現(xiàn)MAGEA3在胃癌腫瘤組織中高表達(dá)且與較短的生存時(shí)間顯著相關(guān)?，F(xiàn)有研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)MAGEA3疫苗能夠在胃癌中誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，但目前尚無(wú)臨床試驗(yàn)開(kāi)展[9]。在黑色素瘤中開(kāi)展的關(guān)于MAGEA3疫苗的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT00086866)，入組的患者中能檢測(cè)到MAGEA3抗體及CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)[10]。但后續(xù)隨機(jī)對(duì)照的Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果均不理想[11-12]。與MAGEA3疫苗研究的結(jié)果相似，NY-ESO-1單抗原疫苗雖然也被證實(shí)能夠誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，但相關(guān)的Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT00199901)結(jié)果卻是陰性的。上述結(jié)果提示單一抗原的腫瘤疫苗往往難以轉(zhuǎn)化為臨床獲益，多種抗原覆蓋的疫苗設(shè)計(jì)有望成為解決該難題的策略之一。本研究發(fā)現(xiàn)多種癌睪抗原在胃癌中高表達(dá)且與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)，以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)多種抗原涵蓋的疫苗是否有望改善患者生存值得進(jìn)一步研究。

經(jīng)基因工程編輯的T細(xì)胞治療技術(shù)主要包括TCR-T細(xì)胞及CAR-T細(xì)胞治療。以MAGE-A家族抗原為靶點(diǎn)，已有多種相關(guān)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)布。一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)了靶向MAGEA3的TCR-T細(xì)胞，17例晚期惡性腫瘤患者接受治療后1例完全緩解，3例部分緩解[13]。以MAGEA4為靶點(diǎn)的TCR-T細(xì)胞在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中取得了顯著的效果。本研究發(fā)現(xiàn)MAGEA4在胃癌組織中高表達(dá)，且與不良預(yù)后有相關(guān)趨勢(shì)。與腫瘤疫苗的設(shè)計(jì)思路類似，TCR-T細(xì)胞設(shè)計(jì)也通過(guò)涵蓋多靶點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，這些靶點(diǎn)包括NY-ESO-1、MAGEA1、MAGEA4、PRAME、Survivin和SSX2等[6]。本研究也發(fā)現(xiàn)PRAME在胃癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，提示PRAME也可能成為胃癌免疫治療的潛在靶點(diǎn)。在急性髓系白血病中現(xiàn)已有靶向PRAME的CAR-T細(xì)胞設(shè)計(jì)。

本研究發(fā)現(xiàn)CEP55、MAGEA10、MAGEA12、MAGEA3、MAGEC1、PLAC1高表達(dá)與胃癌患者的較短生存顯著相關(guān)。多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)已證實(shí)CEP55在多個(gè)癌種中呈高表達(dá)且和患者預(yù)后較差相關(guān)。CEP55過(guò)表達(dá)與PI3K通路的活化、腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[14]。靶向MAGEA4的TCR-T細(xì)胞治療已初見(jiàn)成效，MAGEA10與MAGEA4的序列有較多的重疊之處，因此部分靶向MAGEA10的特異性免疫細(xì)胞臨床試驗(yàn)項(xiàng)目已暫停[15]。與本研究的發(fā)現(xiàn)相似，MAGEC1在結(jié)腸癌中也呈現(xiàn)高表達(dá)，并且與結(jié)腸癌患者的較短生存相關(guān)[16]。外周血中MAGEC1/PRAME蛋白的表達(dá)還能起到多發(fā)骨髓瘤疾病監(jiān)測(cè)的作用[17]。PLAC1的高表達(dá)與結(jié)腸癌、宮頸癌患者的較差預(yù)后相關(guān)，并且可以通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲[18-19]。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CEP55、MAGEA10、MAGEA12、MAGEA3、MAGEC1、PLAC1高表達(dá)還與腫瘤免疫微環(huán)境中具有抗腫瘤能力的M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)比例呈正相關(guān)?？鼓[瘤免疫反應(yīng)包括抗原釋放和遞呈、活化免疫細(xì)胞、免疫細(xì)胞歸巢殺傷腫瘤細(xì)胞等環(huán)節(jié)。巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中可以極化為兩種狀態(tài)：M1型能呈遞腫瘤抗原、募集和活化免疫細(xì)胞，表達(dá)iNOS、ROS及IL-12，發(fā)揮抗腫瘤作用；M2型能夠清除壞死組織、修復(fù)組織損傷、促進(jìn)血管生成和組織重構(gòu)，發(fā)揮腫瘤抑制作用[20]。上述6種癌睪抗原與腫瘤組織中的M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)，提示其免疫原性是后續(xù)免疫治療設(shè)計(jì)的潛在靶點(diǎn)。

本研究仍存在不足之處，未在我中心的胃癌腫瘤組織中進(jìn)一步驗(yàn)證上述基因的表達(dá)，尚無(wú)免疫反應(yīng)功能的驗(yàn)證，在后續(xù)的研究中將不斷完善，進(jìn)一步深化。綜上，本研究篩選出具有誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的在胃癌組織中高表達(dá)的癌睪抗原，并進(jìn)一步分析這些基因和胃癌患者生存的相關(guān)性。本研究為胃癌中免疫治療的靶點(diǎn)尋找提供了依據(jù)。