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        miR-K1-5p相關(guān)的G1/S期基因編碼的蛋白在卡波西肉瘤中的表達

        2023-01-11 13:08:10彭靖淇
        關(guān)鍵詞:波西肉瘤細(xì)胞周期

        張 靜,彭靖淇

        (1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院病理科,烏魯木齊 830000;2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院外科,烏魯木齊 830000)

        卡波西肉瘤主要是由卡波西肉瘤相關(guān)病毒(KSHV)感染內(nèi)皮細(xì)胞引起的血管源性惡性腫瘤[1]。miRNAs 是一種非編碼小分子RNA,通過結(jié)合靶基因的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)去降低或沉默靶基因的表達而發(fā)揮強大的調(diào)控作用。KSHV miRNA 也能通過復(fù)雜的機制誘導(dǎo)卡波西肉瘤的發(fā)生。課題組前期實驗中通過對卡波西肉瘤miRNA 差異表達譜的篩選,證實卡波西肉瘤中miR-K1-5p表達明顯上調(diào)[2],進一步的體外實驗發(fā)現(xiàn)在卡波西肉瘤細(xì)胞株中miR-K1-5p 可以促進G1/S 期轉(zhuǎn)換,但其中的機制并不清楚。因此,本文檢測miR-K1-5p 相關(guān)的G1/S 期基因編碼的蛋白在卡波西肉瘤中的表達,以期為進一步研究miR-K1-5p對卡波西肉瘤細(xì)胞周期的調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料來源

        收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院及市友誼醫(yī)院存檔的40 例卡波西肉瘤石蠟包埋塊,以新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院40 例存檔的血管瘤石蠟包埋塊做對照(經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實施,批件編號2019XE0133),由兩名高年資病理醫(yī)師獨立閱片后納入。卡波西肉瘤患者:男性35 例,女性5 例,年齡32~82 歲;血管瘤患者:男性24 例,女性16例,年齡1~80 歲。

        1.2 主要試劑

        免疫組化抗體均購自武漢博士德工程有限公司:細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶抑制劑4(CDKN4)、細(xì)胞周期蛋白A(CCNA)、細(xì)胞周期蛋白D2(CCND2)、周期素依賴性激酶2(CDK2)、周期素依賴性激酶4(CDK4)。

        1.3 篩選miR-K1-5p 的靶基因

        通過生物信息軟件miRDB 和TargetScan Custom 篩選miR-K1-5p 的靶基因。miRDB:www.mirdb.org;TargetScan: http://www.targetscan.org/vert_60/。

        1.4 確定miR-K1-5p 和靶基因的信號通路,分析通路上關(guān)鍵基因

        通過生物信息數(shù)據(jù)庫Gene Ontology(GO)、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析靶基因的信號通路及通路上的關(guān)鍵基因。

        1.5 免疫組化(IHC)檢測

        切片放置65 ℃烤箱2 h;抗原修復(fù),3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶;加入CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 一抗,4 ℃過夜;二抗孵育;DAB顯色復(fù)染,封片。

        1.6 結(jié)果判斷

        隨機選擇10 個400 倍(直徑0.05 cm)視野判讀結(jié)果。1)著色情況:無著色為0 分,淡黃色為1分,棕黃色為2 分,棕褐色為3 分。2)陽性細(xì)胞數(shù):1%~10%為1 分,11%~50%為2 分,51%~75%為3分,≥76%為4 分。兩者相加的和<3 分視為陰性表達,≥3 分視為陽性表達。CDKN4、CCNA、CCND2、CDK4 為腫瘤梭形細(xì)胞胞核著色;CDK2 以腫瘤梭形細(xì)胞胞漿著色為主,部分胞核著色。由兩名高年資病理醫(yī)師共同判讀結(jié)果。

        1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

        使用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗,相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 miR-K1-5p 的靶基因

        通過生物信息軟件篩選CDKN4 基因為miRK1-5p 的靶基因,結(jié)合位點如表1所示。

        表1 3'UTR of CDKN4 與miR-K1-5p 的結(jié)合位點

        2.2 miR-K1-5p 與靶基因的信號通路和通路上的關(guān)鍵基因

        通過生物信息數(shù)據(jù)庫GO 和KEGG 分析:miR-K1-5p 和靶基因CDKN4 參與細(xì)胞周期信號通路,通路下游的關(guān)鍵基因為CCNA、CCND2、CDK2、CDK4。

        2.3 CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤與血管瘤中的表達

        卡波西肉瘤與血管瘤中CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 的表達情況見圖1。CDKN4 在卡波西肉瘤中的陽性率低于血管瘤中的陽性率(P<0.05);CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤中的陽性率均高于血管瘤中的陽性率(P均<0.05),見表2。

        表2 免疫組化檢測CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤及血管瘤中的表達[例(%)]

        圖1 免疫組化檢測CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤及血管瘤中的表達

        2.4 CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 與卡波西肉瘤患者性別、年齡的關(guān)系

        不同性別、年齡卡波西肉瘤患者的CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 陽性表達率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P 均>0.05),見表3。

        表3 CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 與卡波西肉瘤患者性別、年齡的關(guān)系[例(%)]

        2.5 卡波西肉瘤中CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 表達的相關(guān)性分析

        在卡波西肉瘤患者中,CDKN4 的表達與CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 均呈負(fù)相關(guān),CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 的表達互為正相關(guān)關(guān)系(P 均<0.05),見表4。

        表4 卡波西肉瘤中CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 表達的相關(guān)性(rs 值)

        3 討論

        卡波西肉瘤是血管及梭形細(xì)胞增生伴侵襲特征的惡性間葉源性腫瘤[3],分為經(jīng)典型、艾滋病病毒(AIDS)相關(guān)型、非洲型及免疫抑制型。編碼miRNA 的KSHV 是引起卡波西肉瘤最主要的致瘤病毒。miRNA 作為一類特殊的調(diào)控分子已受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注[4-7],它們調(diào)控細(xì)胞的周期、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、侵襲等多種生物學(xué)行為,并廣泛參與基因表達及細(xì)胞通路轉(zhuǎn)導(dǎo)等[8],與腫瘤學(xué)、病毒學(xué)等領(lǐng)域密切相關(guān)[9-10]。KSHV miRNA 也可以通過沉默轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控宿主細(xì)胞的周期等不同途徑誘導(dǎo)卡波西肉瘤的發(fā)生。Wu 等[11]對卡波西肉瘤及瘤旁組織行RTq-PCR 檢測后,發(fā)現(xiàn)包括miR- K1-5p 在內(nèi)的13 個KSHV miRNA 在卡波西肉瘤中表達均上調(diào),推測KSHV miRNA 扮演促癌角色[12]。進一步的細(xì)胞功能實驗證實miRK1-5p 能夠縮短細(xì)胞周期,加速細(xì)胞增殖,推測miR-K1-5p 可能與細(xì)胞周期的調(diào)控密切相關(guān)。

        由于miRNA 通過影響靶基因的翻譯而發(fā)揮其生物學(xué)作用,因此研究miRNA 功能的核心是尋找靶基因。本研究通過基因軟件篩選CDKN4為miR-K1-5p 的靶基因,通過基因數(shù)據(jù)庫分析靶基因參與細(xì)胞周期信號通路,通路下游的關(guān)鍵基因為CCNA、CCND2、CDK2、CDK4,它們編碼的蛋白在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞周期有G1/S 期和G2/M 期兩個重要檢查點,從細(xì)胞周期進程來看,G1/S 期的檢查點比G2/M 期更重要。CDKN4 屬于細(xì)胞周期非特異性抑制蛋白,是G1期負(fù)性調(diào)控蛋白,通過與CCN-CDK 復(fù)合物結(jié)合并抑制其活性,發(fā)揮阻礙G1/S 期轉(zhuǎn)化和細(xì)胞增殖的作用,避免DNA 錯誤復(fù)制[13-15]。CCNA 在G1晚期表達,CCND2 在G1 期早期表達[16-17],CDK2和CDK4 是G1 期-S 期轉(zhuǎn)變的主要限速因子,形成CCNA/CDK2 及CCND2/CDK4 復(fù)合物后促進G1/ S轉(zhuǎn)化[18-19]。因此,CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2 和CDK4 是調(diào)控G1/S 期轉(zhuǎn)換的5 個重要蛋白,其表達異常可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

        本研究使用免疫組化的方法在卡波西肉瘤(血管瘤為對照組)中檢測CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2 和CDK4 的表達情況。血管瘤是血管源性的良性腫瘤,全身任何部位均可發(fā)生,大體上形成境界較清楚的藍-紫-紅色的斑點或結(jié)節(jié),光鏡下由大小不等的血管腔構(gòu)成;卡波西肉瘤是血管源性的惡性腫瘤/肉瘤,多發(fā)生在四肢,初為藍-紅色的斑片(斑點),后形成斑塊及結(jié)節(jié),光鏡下以梭形細(xì)胞增生及血管之間含有紅細(xì)胞的狹縫狀腔隙為特點。血管瘤與卡波西肉瘤是組織起源相同的良惡性腫瘤,大體形態(tài)及鏡下特征均有相似之處,具有良好的可比性。本研究發(fā)現(xiàn):與血管瘤(對照組)相比,CDKN4 在卡波西肉瘤中表達下調(diào);CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤中表達上調(diào)。在卡波西肉瘤中CDKN4 的表達與CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 均呈負(fù)相關(guān),CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 的表達互為正相關(guān),推測在卡波西肉瘤中miR-K1-5p 靶向CDKN4 使其表達明顯下調(diào),減弱了對CCNA/CDK2、CCND2/CDK4的抑制作用,引起其表達上調(diào)(CCNA 與CCND2的過度表達可導(dǎo)致CDK2 和CDK4 的激活),損傷G1/S 關(guān)卡,引起細(xì)胞增殖、周期紊亂,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。在卡波西肉瘤中,CDKN4、CCNA/CDK2、CCND2/CDK4 與患者的性別、年齡均無關(guān),可能與它們在卡波西肉瘤發(fā)生中功能的復(fù)雜性有關(guān)。

        綜上所述,卡波西肉瘤中,CDKN4、CCNA/CDK2、CCND2/CDK4 的異常表達可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。CDKN4 的表達下調(diào)和CCNA/CDK2、CCND2/CDK4 的過度表達可作為引起卡波西肉瘤細(xì)胞周期異常的生物學(xué)指標(biāo),其分子機制可能與CDKN4/CCN/CDK 通路有關(guān),而它們作為G1/S 期相關(guān)的重要蛋白,有望成為卡波西肉瘤的治療靶點。

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