谷長(zhǎng)維，胡博，2*，劉微

[1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130112；3.吉林省維民知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)，吉林 長(zhǎng)春 130000]

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV) 是一種α-冠狀病毒，可導(dǎo)致各年齡段豬暴發(fā)高度接觸性腸道疾病[1]。PEDV 自2013 年在美國(guó)中西部出現(xiàn)以來(lái)，已在美洲大部分地區(qū)流行，使養(yǎng)豬業(yè)出現(xiàn)了重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。流行區(qū)的控制措施是針對(duì)建立PEDV 母豬免疫力和控制PEDV感染。母源免疫在保護(hù)新生仔豬抵抗PEDV感染中起關(guān)鍵作用。商業(yè)性疫苗、肌內(nèi)注射給藥，只有在口服暴露于活的PEDV(反饋)后，才能夠增強(qiáng)PEDV 的免疫力，這是實(shí)現(xiàn)強(qiáng)烈、快速、持久刺激腸道黏膜免疫的唯一途徑[3]。多項(xiàng)PEDV 抗體試驗(yàn)，包括免疫熒光試驗(yàn)(immunological fluorescence assay，IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、病毒中和(virus neutralization，VN) 和熒光聚焦中和(fluorescence focus neutralization，F(xiàn)FN)[4]，特別是評(píng)估PEDV 中和抗體水平(VN、FFN) 為評(píng)估和預(yù)測(cè)豬群免疫力提供了有價(jià)值的工具[5]。VN 檢測(cè)試劑盒在常規(guī)使用中存在固有的弱點(diǎn)：檢測(cè)結(jié)果具有主觀性，因?yàn)榉磻?yīng)是由人評(píng)價(jià)的，檢測(cè)的重復(fù)性受到細(xì)胞增殖和病毒復(fù)制的運(yùn)行間變異的影響，并且涉及的生物過(guò)程通量較慢。PEDV FFN 試驗(yàn)是VN 試驗(yàn)的改良版，由試驗(yàn)人員讀取結(jié)果，并根據(jù)相對(duì)于對(duì)照樣本的熒光減少解釋響應(yīng)。具體而言，抗體滴度報(bào)告為最高稀釋度的倒數(shù)，導(dǎo)致熒光聚焦單位(fluorescence focus units，F(xiàn)FU)相對(duì)于病毒對(duì)照孔減少超過(guò)90%。FFN 不依賴(lài)于檢測(cè)病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE) 的事實(shí)意味著該檢測(cè)具有更短的周轉(zhuǎn)時(shí)間[6](即，可在20～24 h 內(nèi)讀取平板，而VN 為3 d)。盡管如此，F(xiàn)FN 保留了VN的一些缺點(diǎn)，包括直接觀察熒光染色的感染細(xì)胞是主觀的、勞動(dòng)密集型的和耗時(shí)的[6]。與其他方法相比，據(jù)報(bào)道成像細(xì)胞計(jì)數(shù)是檢測(cè)中和抗體(如水泡性口炎病毒和腺病毒)的一種客觀、快速、可重復(fù)、特異性和半自動(dòng)的方法。我們?cè)u(píng)估了基于成像細(xì)胞術(shù)的PEDV 高通量中和試驗(yàn)(high-throughput neutralization assay，HTNT)的性能。

1 材料和方法

1.1 材料

Vero 81 細(xì)胞(ATCC CCL-81；美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基(DMEM 培養(yǎng)基；美國(guó)MilliporeSigma 公司)，10%熱滅活胎牛血清[(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)；美國(guó)Atlas 生物制品公司]和1%青霉素-鏈霉素(美國(guó)Grand Island 生物制品集團(tuán)公司)。

1.2 方法

用從感染PEDV 的仔豬上采集的材料接種20 頭9 周齡豬，隨時(shí)間采集樣本，獲得已知PEDV 抗體狀態(tài)的血清樣本(n=159)。為驗(yàn)證其PEDV 陰性狀態(tài)，在接種后第4 天(days post inoculation，DPI) 采集所有豬的血清和口腔液體標(biāo)本，通過(guò)PEDV IgG ELISA 和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR(realtime-reverse transcription polymerase chain reaction，RT-rtPCR)進(jìn)行檢測(cè)。將約15 g 切碎的PEDV RT-rtPCR 陽(yáng)性腸道組織(田間樣本)與500 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4；美國(guó)Grand Island 生物制品集團(tuán)公司) 混合，制備注射豬的PEDV 接種物。DPI 0 時(shí)，使用噴霧器(美國(guó)Chapin公司)將接種物噴入每頭豬的鼻孔中5 s。通過(guò)PEDV RT-rtPCR 檢 測(cè)DPI -7、DPI 0 和DPI 7 采集的個(gè)體豬的糞便樣本，以確認(rèn)生產(chǎn)性感染。

在第-4、0、7、14、21、28、35 和42天，從頸靜脈或顱腔靜脈采集用于抗體檢測(cè)的血液樣本，并將血清儲(chǔ)存在-80 ℃的2 mL低溫試管(德國(guó)Greiner Bio-One 公司) 中直至檢測(cè)。從接種PEDV 的豬上采集血清樣本(n=159)，隨機(jī)排序，隨后通過(guò)HTNT 和FFN檢測(cè)PEDV 中和抗體。

在含2 μg/mL 甲苯磺?；鵏-苯丙氨酸氯甲基酮(tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone，TPCK)處理的胰蛋白酶的病毒接種培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM 培養(yǎng)基) 中10 倍連續(xù)稀釋(10-1～10-8) 病毒貯備液，然后向含融合Vero 81 細(xì)胞的96 孔板的5 個(gè)孔中加入100 μL 各稀釋液，進(jìn)行病毒滴定。不含病毒的病毒接種培養(yǎng)基用作陰性對(duì)照。將平板置于37 ℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中孵育5 d，或直至觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)。使用Spearman+K?rber 方法計(jì)算病毒滴度，并表示為50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)/mL[7]。

在PEDV HTNT 中使用透明平底、黑色聚苯乙烯、組織培養(yǎng)處理的96 孔板(美國(guó)Corning 生命科學(xué)公司)，以避免使用成像細(xì)胞儀(配備MiniMax 300 成像細(xì)胞儀的Spectra Max i3 多模式酶標(biāo)儀平臺(tái)；美國(guó)Molecular Devices 公 司) 用SoftMax Pro軟件(v.6.5，Molecular Devices)操作。在100 μL 細(xì)胞增殖培養(yǎng)基中，用Vero 81 細(xì)胞(5×104個(gè)/ 孔) 接種微孔，制備平板。將平板孵育48 h 或直至Vero 81 細(xì)胞≥90%融合。使用成像細(xì)胞儀估計(jì)融合率(%)，透射光暴露時(shí)間為5 ms，焦點(diǎn)調(diào)整為60 μm。拒絕孔不符合融合要求的平板。

每個(gè)試驗(yàn)平板(即陽(yáng)性對(duì)照、PEDV 抗體陽(yáng)性血清；陰性對(duì)照、PEDV 抗體陰性血清；病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照、病毒接種培養(yǎng)基)中均包括內(nèi)部對(duì)照(一式四份檢測(cè)；100 μL/孔)。PEDV 抗體陽(yáng)性和陰性血清對(duì)照來(lái)自PEDV 接種或陰性對(duì)照豬，檢測(cè)前，將所有血清樣本(包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照)在56 ℃下滅活30 min。將病毒接種培養(yǎng)基以1 ∶20 稀釋?zhuān)缓笥? ∶10 稀釋的PEDV 貯備病毒(3.16×105TCID50/mL)以1 ∶1稀釋?zhuān)? ∶40 稀釋樣本。

樣本在37 ℃下孵育1 h，然后將150 μL血清-病毒混合物轉(zhuǎn)移至96 孔HTNT 板中，該板含有已用清洗培養(yǎng)基(含1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基)預(yù)清洗3 次的融合Vero 81 細(xì)胞。將平板在37 ℃下孵育1.5 h，然后用清洗培養(yǎng)基清洗一次，并用病毒接種培養(yǎng)基清洗一次。

向各孔加入150 μL 病毒接種培養(yǎng)基，并將平板在37 ℃下孵育20～24 h。然后移除培養(yǎng)基，用100 μL 80%丙酮(4 ℃)固定細(xì)胞15 min，并風(fēng)干(22～25 ℃)。

用PBS(pH 7.4；美國(guó)Grand Island 生物制品集團(tuán)公司)清洗平板一次，并用1 ∶100稀釋的PEDV 核蛋白(N) 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC) 標(biāo)記的腹水(SD6-29 克?。幻绹?guó)Medgene Labs公司) 在37 ℃下染色1 h。用PBS 清洗平板4 次。在成像細(xì)胞儀上以541 nm 波長(zhǎng)讀取HTNT 板，單部位讀數(shù)，15～30 ms 曝光時(shí)間，20 μm 焦點(diǎn)。將響應(yīng)讀取為總熒光強(qiáng)度(total fluorescence intensity，TFI)，然后將其標(biāo)準(zhǔn)化為：

總熒光值(total fluorescence ratio，TFR)=100-樣本TFI 平均值×100÷陰性對(duì)照TFI 平均值

HTNT 平板需滿(mǎn)足特定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：抗體陽(yáng)性血清對(duì)照TFI=0.1～7.0，抗體陰性血清對(duì)照TFI ≥70，病毒對(duì)照TFI ≥100，病毒對(duì)照孔染色陽(yáng)性，細(xì)胞對(duì)照孔無(wú)陽(yáng)性染色。不符合這些標(biāo)準(zhǔn)的平板的結(jié)果舍棄。

HTNT 檢測(cè)的樣本(一式兩份) 使用FFN 程序檢測(cè)PEDV 中和抗體。簡(jiǎn)言之，熱滅活血清樣本在含TPCK 處理胰蛋白酶(1.5 μg/mL)的MEM中稀釋2 倍(1 ∶10～1 ∶1 280)。將血清樣本與細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的PEDV(100 FFU/100 μL)以1 ∶1 混合，37 ℃下孵育1 h。將混合物加入含Vero 81 細(xì)胞匯合單層的96 孔板中，37 ℃下孵育2 h。孵育后，用含有TPCK 處理的胰蛋白酶(1.5 μg/mL)的MEM 再次洗滌平板，孵育20～24 h。用80%丙酮(22～25 ℃)固定平板，用FITC 結(jié)合的單克隆抗體SD6-29 染色，并用熒光顯微鏡觀察。中和終點(diǎn)滴度定義為相對(duì)于對(duì)照組熒光聚焦減少90%的最高血清稀釋度。認(rèn)為中和終點(diǎn)滴度≥1 ∶20 的血清樣本為PEDV中和抗體陽(yáng)性。

2 結(jié)果

使用Fisher 精確檢驗(yàn)比較PEDV HTNT與FFN 陽(yáng)性血清的比例。FFN 和HTNT 檢測(cè)試劑的診斷靈敏度和特異性估計(jì)值是根據(jù)每種檢測(cè)試劑的一系列臨界值的受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析(SAS V.9.4)得出的，假設(shè)＜7 DPI 采集的血清樣本為陰性，≥14 DPI 采集的樣本為陽(yáng)性。

DPI -7 和DPI 0 采集的個(gè)體豬糞便樣本(n=20) 經(jīng)RT-rtPCR 檢測(cè)為PEDV陰性，而DPI 7 采集的接種物和豬糞便樣本(n=20) 為RT-rtPCR 陽(yáng)性。PEDV IgG ELISA 結(jié)果顯示，到DPI 14 時(shí)，所有豬均發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。接種后幾天，在豬中觀察到水樣腹瀉，但未觀察到其他臨床體征，所有豬均順利恢復(fù)。DPI 4～42之間采集的159 份血清樣本均經(jīng)HTNT 和FFN檢測(cè)(圖1)。在DPI 7 檢測(cè)到首次中和抗體應(yīng)答(HTNT 和FFN)。在DPI 21(HTNT 和FFN)達(dá)到峰值后，中和抗體濃度下降(HTNT)或保持穩(wěn)定(HTNT)至DPI 42。在一系列臨界值內(nèi)估計(jì)FFN 和HTNT 診斷靈敏度和特異性(表1)

使用≥1 ∶20，10 的FFN 臨界值，在DPI 0 觀察到1 個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果(表2)。此后，8/20頭(40%) 豬在DPI 7 時(shí)為FFN 陽(yáng)性，19/20頭(95%)在DPI 14 時(shí)為FFN 陽(yáng)性，20/20 頭(95%)在DPI 21 時(shí)為FFN 陽(yáng)性(表2)?？傮w而言，如估計(jì)值和重疊的95%置信區(qū)間所示，在觀察期間，試驗(yàn)性能幾乎相同(表1)。

3 討論

用于檢測(cè)中和抗體的基于成像細(xì)胞計(jì)數(shù)的系統(tǒng)能夠可視化和測(cè)量細(xì)胞、定量反應(yīng)以及捕獲和存儲(chǔ)數(shù)據(jù)或圖像。在HTNT PEDV 試驗(yàn)中，使用高通量成像細(xì)胞儀標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞融合、讀取反應(yīng)和評(píng)價(jià)平板對(duì)照?；诳陀^測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)化讀取方案和計(jì)算消除了試驗(yàn)過(guò)程中的人體主觀性和變異性，并將96 孔板的讀取時(shí)間縮短至＜4 min。因此，成像細(xì)胞計(jì)數(shù)可為檢測(cè)多種病原體的中和抗體提供更客觀、快速和半自動(dòng)的方法。