董寧寧，許琳琪，熊峰，閆博宇，李昆,3,＊，郭棟才,3

1化學(xué)生物傳感與計量學(xué)國家重點實驗室，長沙 410082

2湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長沙 410082

3化學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心(湖南大學(xué))，長沙 410082

1 引言

化學(xué)專業(yè)本科教育的中高年級，是讓學(xué)生在掌握基礎(chǔ)化學(xué)理論和實驗技能的基礎(chǔ)上接觸和理解科研方法的重要時期。在化學(xué)實驗教學(xué)中開設(shè)的研究型綜合實驗，應(yīng)成為連通學(xué)生基礎(chǔ)實驗技能提升和科研素養(yǎng)訓(xùn)練的橋梁。然而，目前我國高?；瘜W(xué)實驗教學(xué)仍較多地集中于各個化學(xué)二級學(xué)科的基礎(chǔ)實驗課程，雖有部分綜合性實驗，但依然存在一些問題。首先，綜合性實驗的數(shù)量較少，現(xiàn)存的部分綜合實驗僅是相關(guān)基礎(chǔ)實驗的整合，而能夠?qū)⒍鄠€化學(xué)分支學(xué)科融會貫通的實驗項目，仍有待進一步擴充。其次，新時期的化學(xué)教學(xué)對促進學(xué)生綜合創(chuàng)新素質(zhì)的培養(yǎng)提出了更高要求，提升學(xué)生對科學(xué)研究的理解和興趣是化學(xué)實驗教學(xué)的重要任務(wù)，系統(tǒng)的、探索性的、問題導(dǎo)向的實驗項目仍需開發(fā)。因此，巧妙地設(shè)計一些符合本科教學(xué)規(guī)律的新創(chuàng)實驗，從而使學(xué)生能動地發(fā)揮自己的創(chuàng)造力，利用自己掌握的基礎(chǔ)化學(xué)理論和基本實驗技能，完成一定的探索性課題；并了解和體驗完整的科研流程，認識相關(guān)學(xué)科的研究范式，掌握科學(xué)研究的方法論——這是在當(dāng)前化學(xué)實驗教學(xué)的實踐中亟需解決的關(guān)鍵問題。

基于以上思考，本文將科研前沿成果融入轉(zhuǎn)化到實驗教學(xué)中，對與碳化鈦介導(dǎo)原位還原的無標簽可視化銀離子檢測相關(guān)的研究重新進行了設(shè)計，通過反復(fù)調(diào)整和驗證，形成了一項涵蓋材料合成、物性表征和實際應(yīng)用在內(nèi)的一整套、全鏈條的探索性綜合創(chuàng)新實驗。這彌補了本科基礎(chǔ)實驗教學(xué)中各項內(nèi)容相割裂的弊端，從而有效地實現(xiàn)實驗教學(xué)內(nèi)容和教學(xué)方式的改革，提高實驗教學(xué)質(zhì)量。

銀是一種重金屬元素，其氧化會產(chǎn)生有毒的銀離子(Ag+)，對人體及生物有著巨大危害[1,2]。目前，已發(fā)展出多種檢測Ag+的技術(shù)，例如原子吸收/原子發(fā)射光譜、電感耦合等離子質(zhì)譜、熒光法、比色法和電化學(xué)方法等[3-5]。然而，上述大多數(shù)方法通常需要昂貴的大型儀器、復(fù)雜的實驗過程以及熟練的操作技巧。等離激元金屬(金、銀等)納米顆粒具有獨特的光學(xué)性質(zhì)，即由其局域表面等離激元共振引起的對特定波長光的吸收和散射。因其光譜易受到多種因素的影響，等離激元納米顆粒已經(jīng)被廣泛地用于金屬離子、小分子、DNA、蛋白質(zhì)和酶等的檢測之中[6-8]。因此，設(shè)計原位生成的等離激元納米顆粒作為比色傳感平臺，對于實現(xiàn)無標簽傳感策略具有重要意義。

碳化鈦(Ti3C2)是近年來發(fā)展的一類新型二維材料，具有良好的導(dǎo)電性和親水性，已在能源轉(zhuǎn)化與存儲、環(huán)境監(jiān)測與修復(fù)等領(lǐng)域有了廣泛的應(yīng)用。同時，Ti3C2表面具有氧、羥基等封端基團，這賦予了其優(yōu)異的還原性和對重金屬離子的強吸附能力。因此，在本實驗中，利用Ti3C2對Ag+的吸附作用以及Ti3C2將Ag+原位還原的機制，可生成銀納米顆粒(Ag NPs)，其獨特的光學(xué)性質(zhì)使得對Ag+進行無標簽、可視化的檢測成為可能。

這一探索性綜合創(chuàng)新實驗結(jié)合了實驗教學(xué)和科研探索的特點，涉及到無機材料化學(xué)、儀器分析和物理化學(xué)等課程的相關(guān)理論知識，涵蓋了部分基礎(chǔ)化學(xué)實驗操作，也應(yīng)用了譜圖解析、數(shù)據(jù)處理和圖像處理等技術(shù)。在本實驗項目16個學(xué)時的教學(xué)實踐中，能夠使學(xué)生熟悉科學(xué)研究中一個完整課題的探索過程，學(xué)會用掌握的理論知識分析和解釋實驗現(xiàn)象與結(jié)果，體驗到科研成果在生產(chǎn)生活實際中的應(yīng)用，并通過分組完成實驗提高團隊協(xié)作的能力。有助于利用化學(xué)實驗教學(xué)促進學(xué)生對學(xué)科知識體系的融會貫通，也為學(xué)生畢業(yè)后在相關(guān)領(lǐng)域?qū)W術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的工作中展現(xiàn)良好科學(xué)素養(yǎng)打下堅實基礎(chǔ)。

2 實驗?zāi)康?/h2>

(1) 理解貴金屬納米顆粒的光學(xué)性質(zhì)及在光譜分析法中的應(yīng)用。

(2) 熟悉Ti3C2二維材料的制備與表面修飾方法，掌握相關(guān)設(shè)備的基本操作。

(3) 理解紫外-可見分光光度計的結(jié)構(gòu)和原理，學(xué)會儀器使用方法和數(shù)據(jù)處理方式。

(4) 掌握標準加入法的使用和回收率的計算。

3 實驗原理

基于Ti3C2納米片構(gòu)建用于Ag+檢測的無標簽、可視化納米等離激元傳感平臺。在該方法中，不需要預(yù)先合成比色探針，而是利用Ti3C2納米片的還原性原位生成Ag NPs，產(chǎn)生納米等離激元光學(xué)信號的輸出。首先，將碳鋁鈦粉末在HF中進行刻蝕，經(jīng)過離心、洗滌和超聲等處理后得到Ti3C2納米片。而后，利用聚丙烯酸(PAA)修飾Ti3C2納米片，改善其對金屬離子的親和力與穩(wěn)定性。最后，通過Ag+在納米片上的原位還原形成Ag NPs，使溶液產(chǎn)生從灰色到棕褐色的顏色變化，從而以比色法檢測Ag+。

反應(yīng)后樣品溶液體系的紫外-可見吸收光譜中在波長450 nm的位置有最大的消光強度，表明了Ag NPs的產(chǎn)生。同時，根據(jù)朗伯-比爾定律(A=εbc)建立吸光度與濃度的關(guān)系。其中A為吸光度；ε為摩爾吸光系數(shù)，表示濃度為1 mol·L-1、介質(zhì)厚度為1 cm的吸光物質(zhì)對光的吸收能力；b為介質(zhì)厚度，單位是cm；c為溶液濃度，單位是mol·L-1。

以已知不同濃度的Ag+反應(yīng)后得到一系列樣品溶液，測定這些溶液體系在450 nm的吸光度，即可通過擬合建立定量Ag+濃度的工作曲線，并確定其線性范圍及檢測限。檢測限的計算為LOD = 3σ/S，其中LOD為檢測限，σ為空白樣品信號的標準偏差，而S是標準曲線的斜率。此外，通過添加回收實驗，利用標準加入法，可以測定未知樣中Ag+濃度。

同樣地，將溶液的吸光度轉(zhuǎn)換為從反應(yīng)后溶液體系數(shù)碼照片中的樣品顏色提取出的RGB三原色值，也有同樣的正比例關(guān)系，即V=kbc，其中V為樣品照片提取出的RGB值，k表示含有濃度為1 mol·L-1、介質(zhì)厚度為1 cm的吸光物質(zhì)對應(yīng)的RGB值。研究表明本實驗中應(yīng)采取藍色通道的Blue值[9]。因此，在實際操作中，只需要處理樣品的照片就可以獲得較為準確的結(jié)果。

Ag+的氧化性和相應(yīng)還原產(chǎn)物Ag NPs的光學(xué)特性，使該方法對Ag+的檢測具有良好的特異性，這將以可能與Ag+共存于真實水樣中的干擾離子來測試驗證。

4 試劑與設(shè)備

4.1 實驗試劑

本實驗所用試劑見表1。

表1 主要實驗試劑

4.2 實驗設(shè)備

燒杯(100 mL)、離心管(1 mL、50 mL)、移液器(10 μL、100 μL、1000 μL)、透析袋(10 kDa)。本實驗所用其他儀器見表2。

表2 主要實驗儀器

5 實驗步驟

5.1 Ti3C2納米片的合成、表征與修飾

將1.5 g LiF緩慢添加到20 mL 9 mol·L-1HCl中，攪拌直到LiF完全溶解。在10 min內(nèi)分多次緩慢加入2.0 g Ti3AlC2粉末。將反應(yīng)體系保持在35 °C并攪拌24 h以確保對Al的刻蝕。以5000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min后在室溫下用超純水洗滌沉淀，重復(fù)3-5次，至pH達到5.0-6.0。將所得固體再次分散在30 mL超純水中并振搖30 min，然后以3500 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min。保留上清液以去除未分層的Ti3C2。測定紫外-可見吸收光譜。將懸浮液儲存在4 °C冰箱。

分別用紫外光譜、紅外光譜、透射電子顯微術(shù)、X射線衍射等對Ti3C2進行表征。紫外、紅外光譜學(xué)生可以學(xué)生自己操作，透射電子顯微術(shù)、X射線衍射可由學(xué)生負責(zé)樣品制備，教師負責(zé)測試。

利用聚丙烯酸(PAA)對Ti3C2納米片進行表面改性。將PAA (MW= 3000)和Ti3C2納米片的混合物(1 : 7，V/V)在N2氣氛下超聲處理5 h，得到PAA修飾的Ti3C2納米片(稱為Ti3C2-PAA)。以5000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min，保留上清液，并將其透析(保留分子量為10 kDa) 24 h以除去過量的PAA。將最終獲得的Ti3C2-PAA儲存在4 °C冰箱。

5.2 檢測限的測定

(1) Ti3C2與Ag+的反應(yīng)。

將超純水、Ti3C2-PAA (120 μg·mL-1)和相應(yīng)的Ag+溶液(表3)混合，總體積保持在1 mL。震蕩搖勻1 min，放入預(yù)熱好的50 °C恒溫水槽反應(yīng)40 min。

表3 Ti3C2納米片與不同濃度Ag+溶液的反應(yīng)體系

(2) 紫外-可見分光光度分析。

測定每個樣品溶液的紫外-可見吸收光譜。記錄450 nm的吸光度數(shù)據(jù)，將各樣品的吸光度對Ag+濃度線性擬合，從而建立標準曲線，并計算Ag+的檢測限。

(3) 數(shù)碼照片分析。

將上述各樣品溶液置于相同厚度的比色皿內(nèi)，使用智能手機等設(shè)備在微型攝影棚內(nèi)拍攝照片。拍攝時相機采用手動曝光模式，曝光參數(shù)及攝影棚的光照參數(shù)均保持一致。用圖片RGB分析程序提取各樣品圖像上Blue通道的數(shù)據(jù)，并作Blue值-濃度標準曲線。

5.3 傳感體系的特異性

以Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Zn2+、Ni2+、Cd2+和Fe3+等九種金屬離子為干擾離子，在上述體系中加入其硝酸鹽考察此檢測方法對Ag+的特異性。(1) 單一離子實驗：在1 mL體系中，向120 μg·mL-1的Ti3C2-PAA分別加入200 μmol·L-1的Ag+或干擾離子；(2) 共存離子實驗：在1 mL體系中，向120 μg·mL-1的Ti3C2-PAA溶液中加入200 μmol·L-1的Ag+后，再加入200 μmol·L-1干擾離子。在50 °C下恒溫反應(yīng)40 min，用紫外光譜儀測試各組樣品。

5.4 實際水樣中Ag+的檢測

為了評估該比色檢測系統(tǒng)對實際水樣中Ag+的檢測能力，選用自來水作為真實水樣代替超純水進行測試。在標準添加回收實驗中，將濃度范圍為0-300 μmol·L-1的Ag+標樣添加到真實樣品中，再使用上述檢測方法進行分析。

6 實驗結(jié)果討論與教學(xué)意義

6.1 Ti3C2納米片的表征

Ti3C2納米片溶液為黑色，紫外-可見光譜顯示400-1000 nm之間存在寬吸收(圖1)。根據(jù)本實驗中Ti3C2在775 nm處的吸光度為0.45，可計算出Ti3C2納米片(ε775nm= 27.5 L·g-1·cm-1)的濃度。使用PAA對Ti3C2納米片改性后，紫外-可見光譜無明顯變化。紅外光譜顯示667 cm-1和466 cm-1處存在Ti-O和Ti-C的特征峰，同時在1181 cm-1存在較明顯的C-O伸縮振動峰。

圖1 Ti2C3在用PAA修飾前后的紫外-可見吸收光譜

6.2 Ag+的檢測限

從反應(yīng)后體系的紫外-可見光譜(圖2a)中可以看出，Ag NPs在450 nm處的局域表面等離激元共振特征峰逐漸增強，這對應(yīng)于溶液的顏色從淺灰色到棕褐色的變化。需要指出的是，原來的淺灰色來自稀釋的Ti3C2-PAA溶液，棕褐色是Ti3C2-PAA的淺灰色和生成的Ag NPs特征性黃色的混合。依據(jù)450 nm處吸光度隨Ag+濃度增加的改變，可以繪制Ag+離子檢測的標準曲線(圖2b)?？梢园l(fā)現(xiàn)，在Ag+濃度5-300 μmol·L-1范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系(R2= 0.999)，并且計算出檢測限為0.912 μmol·L-1。

為了驗證這種比色方法在便攜式傳感中的潛力，由手機拍攝最終反應(yīng)溶液的照片(圖2c)?？赏ㄟ^圖片RGB分析程序提取照片中各樣品的藍色(Blue)通道數(shù)值。將Blue值與Ag+濃度作圖，繪制標準曲線(圖2d)。其線性范圍為5-100 μmol·L-1，檢測限為0.772 μmol·L-1，這與使用精密儀器的分析結(jié)果大致相當(dāng)。

圖2 (a) 加入不同濃度Ag+后各反應(yīng)體系的紫外-可見吸收光譜；(b) 450 nm的吸光度與Ag+濃度的關(guān)系；(c) 加入不同濃度Ag+后各反應(yīng)體系的數(shù)碼照片；(d) 數(shù)碼照片中各樣品的色彩提取出的Blue通道數(shù)值與Ag+濃度的關(guān)系

學(xué)生需要在理解實驗原理及反應(yīng)過程的基礎(chǔ)上，使用朗伯-比爾定律來建立待測物濃度和體系吸光度的關(guān)系，這在實際應(yīng)用中加強了學(xué)生對朗伯-比爾定律的掌握。用智能手機解析樣品的測試結(jié)果，不僅增加了實驗趣味性，更能促進學(xué)生思考其中蘊含的光學(xué)分析基本原理。在對吸收光譜的分析方法中，紫外-可見分光光度法的優(yōu)點是精確度高，數(shù)碼攝影RGB分析的優(yōu)點是便捷而成本低。另外，通過這一研究實例，使學(xué)生掌握分析化學(xué)研究中確定線性范圍和計算檢測限的處理方法。

6.3 對Ag+的檢測特異性

在碳化鈦溶液中分別加入Ag+或其他干擾離子后進行反應(yīng)。結(jié)果表明，加入Ag+的體系中吸光度較高，而加入其他金屬離子后的吸光度很低，與空白對照樣品基本一致(圖3a)。同時，在相應(yīng)的數(shù)碼照片中可以看到樣品之間存在明顯的色差(圖3b)。這表明此傳感策略具有很高的選擇性。

圖3 單獨加入金屬離子的選擇性測試

Ag+與干擾離子共存時的競爭性試驗結(jié)果如圖4所示。在Ag+及不同金屬離子混合體系中，450 nm處的吸收非常接近(圖4a)，照片中不同體系的顏色基本相同(圖4b)。應(yīng)注意，其中含F(xiàn)e3+的樣品的吸光度略有下降，這可能是由于Fe3+具有相對較強的氧化性所致。以上結(jié)果表明，此方法具有良好的特異性，其他金屬離子的存在不會對Ag+的檢測的產(chǎn)生干擾。

圖4 Ag+與干擾離子共存時的選擇性測試

在典型的納米傳感分析研究中，一種傳感策略對檢測目標物的特異性與靈敏度同等重要，都是評價分析方法優(yōu)劣的重要指標。本部分實驗內(nèi)容意在以該領(lǐng)域的科研課題為例，傳授給學(xué)生分析化學(xué)的研究范式。而在實驗時，可以要求學(xué)生自行探索，選取合理干擾離子的種類并設(shè)計實驗體系，從而熟練其測定方法。

6.4 檢測實際樣品中Ag+

在一系列真實水樣中，隨著Ag+濃度的增加，樣品發(fā)生了明顯的顏色變化，紫外光譜中450 nm處吸光度顯著增加。實際樣品中Ag+的回收率在96%至105%之間(表4)。這說明該檢測體系可以實現(xiàn)實際水樣中Ag+的高靈敏檢測。

表4 檢測自來水樣品中加入的Ag+標準樣

選取真實樣品進行測試是驗證一種新型分析方法是否具有實際使用意義的基本方式。在本實驗中，學(xué)生由此可以進一步掌握標準加入法和添加回收實驗的處理思路和應(yīng)用場景，從而體會化學(xué)研究方法論如何指導(dǎo)化學(xué)科學(xué)研究過程，牢固確立理論聯(lián)系實際原則，學(xué)以致用。

7 實驗安排與注意事項

本實驗涉及到無機納米材料的制備與修飾、多種表征手段的使用、分析方法的建立與拓展應(yīng)用等環(huán)節(jié)，建議以綜合實驗或?qū)I(yè)高級實驗的形式在本科三年級開設(shè)。在上課前要求學(xué)生預(yù)習(xí)，了解實驗原理并完成資料調(diào)研與閱讀。課堂上的實驗過程以小組為單位進行，2人一組合作完成。建議總學(xué)時為16小時，其中：(1) Ti3C2納米片的合成，4小時；(2) 納米材料的表面修飾與表征，4小時；(3) Ag+溶液配制、反應(yīng)，以及靈敏度、選擇性等分析化學(xué)測試，6小時；(4) 實際未知樣品的測定，2小時。需要指出的是，在本實驗的材料制備環(huán)節(jié)中，部分樣品處理過程需要較長時間，總計16個學(xué)時可以靈活安排，分次完成。

本實驗過程中要注意以下事項：硝酸銀見光易分解，應(yīng)用錫紙包裹避光，現(xiàn)配現(xiàn)用；氟化鋰有毒，吸入或與皮膚接觸時有毒害，操作時應(yīng)佩戴口罩及手套。

8 實施效果

該實驗是在充分調(diào)研目前化學(xué)實驗教學(xué)的迫切需要的基礎(chǔ)上，選取了切合本科教學(xué)實際的科研前沿成果，將分析化學(xué)的新方法、新技術(shù)融入到本科綜合實驗的教學(xué)內(nèi)容之中。通過反復(fù)驗證和改進優(yōu)化，提出了完善的、重現(xiàn)性好的、適宜本科教學(xué)的研究型綜合實驗設(shè)計。本實驗所需試劑相對廉價且易于從國內(nèi)試劑提供商購得，開展成本較低。以一個教學(xué)班級30人計，15組實驗所需試劑的成本在1000元人民幣以內(nèi)。該實驗內(nèi)容已經(jīng)于近一年在本校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目中進行了多次嘗試，實驗復(fù)現(xiàn)性高，取得了良好的效果。

在理論講解中，學(xué)生通過查閱文獻，可以理解和掌握二維無機材料合成與性質(zhì)、貴金屬納米顆粒的光學(xué)特性及在光譜分析中的應(yīng)用等相關(guān)理論知識。在實驗操作中，不僅將無機材料的合成以及常用設(shè)備的基本操作有機結(jié)合，還將分析儀器的使用和數(shù)據(jù)處理的方法等科研過程呈現(xiàn)給學(xué)生，同時在整個實驗過程中引入了實驗條件優(yōu)化與數(shù)據(jù)分析等環(huán)節(jié)。如上內(nèi)容在整個實驗項目中相互配合，使學(xué)生在獲得實驗技能訓(xùn)練的同時，掌握納米傳感分析領(lǐng)域的科學(xué)研究方法，有利于培養(yǎng)學(xué)生的綜合實驗?zāi)芰Γ嵘龑W(xué)生的探索精神和創(chuàng)新思維。而且，該實驗設(shè)計最終應(yīng)用于生活中真實樣品的測試，體現(xiàn)了科研工作在生產(chǎn)生活中的現(xiàn)實意義。在實驗課程的教學(xué)中融入思政元素，能夠讓學(xué)生扎牢科學(xué)研究應(yīng)服務(wù)于社會和國家需要的深刻意識，激發(fā)他們從事科研工作的熱情，樹立正確的價值觀。

9 結(jié)語

本文介紹了一個研究型綜合實驗，集材料合成、表征、分析方法建立與應(yīng)用于一體，為學(xué)生舉例呈現(xiàn)了科研工作的全過程。特別是其中使用到智能手機處理結(jié)果，有助于學(xué)生理解光學(xué)分析基本原理，激發(fā)其對科學(xué)探索的興趣。另外，實驗最后用于檢測實際樣品中的Ag+，貼近生活，增強趣味，能夠有效啟發(fā)學(xué)生思考科學(xué)研究的意義。