彭堅(jiān)強(qiáng)，陳學(xué)軍，吳興富*，焦芳嬋，馮智宇，楊大海，張誼寒，劉天彥，楊林明

(1 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650021； 2 云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000；3 云南省煙草公司曲靖市公司，云南 曲靖 655000)

煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物，利用雄性不育系配制雜交種已得到廣泛應(yīng)用，不育系雜交種種植面積占全國(guó)煙草面積的50%以上[1]。我國(guó)煙葉主產(chǎn)區(qū)主栽品種所用的不育系胞質(zhì)，均來(lái)源于野生種Nicotianasuaveolen(以(sua)S表示，下同)。近年來(lái)，通過(guò)細(xì)胞融合并輔助以流式細(xì)胞術(shù)篩選等手段，獲得了源自N.glauca(以(gla)S表示，下同)等材料的不育胞質(zhì)[2-4]。不同來(lái)源的煙草不育胞質(zhì)，其配合力、敗育特點(diǎn)及胞質(zhì)效應(yīng)不同。開展煙草不同來(lái)源胞質(zhì)雄性不育系生化特性的機(jī)理研究，對(duì)不同來(lái)源胞質(zhì)雄性不育系雜交種的應(yīng)用尤為重要。煙草細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(CMS)是煙草遺傳育種的重要材料，對(duì)不育機(jī)理的研究主要集中在細(xì)胞膜系統(tǒng)和能量代謝關(guān)鍵酶活性的比較方面。細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷或破壞時(shí)，細(xì)胞的生物學(xué)功能將受到影響甚至喪失[5]。前人研究認(rèn)為，超氧化物歧化酶(SOD)的主要功能是清除生物體內(nèi)的超氧離子基團(tuán)，使生物體內(nèi)過(guò)多的氧轉(zhuǎn)變成為H2O2，過(guò)氧化物酶(POD)能清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的有毒H2O2。作為生物體內(nèi)主要的活性氧防御酶，SOD和POD協(xié)同維持體內(nèi)的活性氧代謝平衡，保護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)[6-7]。

關(guān)于(gla)S與(sua)S兩種來(lái)源的不育系與其保持系，其主要生育期葉片中POD及SOD酶活性變化特點(diǎn)，以及盛花期葉片及花蕾POD、SOD酶活性、ATP含量等鮮有報(bào)道。本文研究了(gla)S、(sua)S及其保持系MF K326主要生育期POD酶和SOD酶活性和盛花期POD酶、SOD酶活性以及ATP和ADP含量，為進(jìn)一步探討煙草胞質(zhì)不育系機(jī)理，多途徑挖掘和創(chuàng)制雄性不育新胞質(zhì)源及在育種上的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

Nta(gla)S K326(以(gla)S表示，下同)胞質(zhì)是經(jīng)體細(xì)胞雜交并以K326為父本回交10代獲得的不育系胞質(zhì)[3]，Nta(sua)S K326胞質(zhì)(以(sua)S表示，下同)和保持系K326(以MF K326表示，下同)由中國(guó)煙草育種研究(南方)中心提供。

1.2 取樣方法

在煙株成苗期、團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期及盛花期取供試材料中部葉片進(jìn)行POD活性及SOD活性的測(cè)定。在盛花期，取花蕾及中部葉片進(jìn)行POD、SOD活性及ATP、ADP含量測(cè)定。

1.3 POD及SOD活性測(cè)定

用索萊寶公司的檢測(cè)試劑盒測(cè)定POD及SOD的活性，測(cè)定方法分別為愈創(chuàng)木酚法和黃嘌呤氧化酶法。

1.4 ATP及ADP含量測(cè)定

稱取2 g樣品迅速放入液氮中研磨成粉末，盡量研磨細(xì)一點(diǎn)。加入10 mL 0.6 mol/L的HClO4到磨細(xì)的樣品中，混勻后置于冰上1 min。將上述混合液在4 ℃，6 000×g離心10 min。吸取上清液(約6 mL)，用1 mol/L的KOH中和其pH至6.5～6.8，上清液置于冰上30 min，以將形成的高氯酸鉀沉淀下來(lái)。用濾紙將沉淀物過(guò)濾掉，然后再用0.25 μm的濾膜過(guò)濾1次。 此步驟可選擇在4 ℃，6 000×g離心5 min代替。最終得到約8 mL的過(guò)濾液(離心液)，將其貯存在-30 ℃用于測(cè)定分析[8]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用DPS方差分析軟件和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種質(zhì)源胞質(zhì)不育系及保持系主要生育期POD及SOD活性

測(cè)定結(jié)果表明(表1)，在煙葉主要生育期，供試材料SOD活性呈先增強(qiáng)后降低趨勢(shì)，團(tuán)棵期活性最強(qiáng)。數(shù)據(jù)分析表明，成苗期、團(tuán)棵期供試材料3者間無(wú)顯著差異；旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期、盛花期(gla)S、(sua)S與MF K326存在顯著差異。POD活性呈現(xiàn)升—降—升的趨勢(shì)，煙株團(tuán)棵期活性最強(qiáng)。數(shù)據(jù)分析表明，成苗期(gla)S同MF K326無(wú)顯著差異，(sua)S同MF K326存在顯著差異；團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期(gla)S、(sua)S與MF K326存在顯著差異，(gla)S與(sua)S間也存在顯著差異；盛花期(gla)S、(sua)S與MF K326存在顯著差異。

表1 兩種質(zhì)源胞質(zhì)不育系及保持系主要生育期POD及SOD活性

2.2 盛花期葉片及花蕾ATP、ADP含量及POD、SOD活性

2.2.1 ATP及ADP含量

由圖1可知，花蕾組織中，(gla)S的ATP+ADP總量?jī)H比MF K326的減少2.86%，而(sua)S的ATP+ADP總量比MF K326的減少20.86%。葉片組織中，(gla)S的ATP+ADP總量比MF K326的減少35.03%，而(sua)S的ATP+ADP總量比MF K326的減少74.52%?；ɡ俳M織中，MF K326的ATP含量是其ADP的2.02倍，(gla)S的ATP含量是其ADP含量的1.19倍，(sua)S的為1.39倍。葉片組織中，MF K326的ATP含量是其ADP的1.72倍，(gla)S的ATP含量是其ADP含量的1.27倍，(sua)S的為1.56倍。盛花期(gla)S的葉片及花蕾組織中，其ATP及ADP含量均高于(sua)S不育系胞質(zhì)。

圖1 兩種質(zhì)源不育系胞質(zhì)及其保持系花蕾與葉片中ATP及ADP含量Fig.1 ATP and ADP measurements in leaf and floral buds from (gla)S，(sua)S and MF K326

2.2.2 POD及SOD活性比較

由圖2可知，盛花期葉片樣品的MF K326的POD活性顯著高于(gla)S和(sua)S，(gla)S和(sua)S間無(wú)顯著差異；花蕾中，MF K326的POD活性顯著高于(gla)S和(sua)S，(gla)S和(sua)S間無(wú)顯著差異。

圖2 盛花期POD活性比較Fig.2 Enzyme enzyme activity of SOD at the flowering stage

SOD酶活性測(cè)定結(jié)果表明(圖3)，盛花期葉片樣品的SOD活性MF K326、(gla)S、(sua)S三者無(wú)顯著差異；花蕾中MF K326的SOD活性顯著高于(gla)S和(sua)S，(gla)S和(sua)S無(wú)顯著差異。

圖3 盛花期SOD活性比較Fig.3 Enzyme enzyme activity of SOD at the flowering stage

3 討論

ATP是促進(jìn)植物細(xì)胞內(nèi)各物質(zhì)合成的直接能源，ATP含量降低，植物體內(nèi)各種生物大分子合成會(huì)受阻或減少。玉米、高粱、水稻等作物中報(bào)道，ATP含量在不育系中顯著的降低。Bergman[9]研究了煙草Nta(rep)S不育系與其保持系花蕾組織ATP與ADP的含量，發(fā)現(xiàn)不育系的ATP與ADP的含量顯著低于保持系。本研究對(duì)兩種質(zhì)源不育系盛花期的葉片與花蕾ATP與ADP含量測(cè)定結(jié)果表明，保持系葉片及花蕾的ATP含量顯著高于供試的兩種不育系胞質(zhì)，說(shuō)明在供試兩種不育系的花器官生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中由于ATP含量下降，可能會(huì)使煙株體內(nèi)生物大分子合成受阻或減少，這也可能是導(dǎo)致供試兩種不育系花粉敗育的一個(gè)原因。

POD是一種具有多種生理功能的酶，可以氧化自由基吲哚乙酸和催化多種反應(yīng)等。發(fā)育正常的植株，其體內(nèi)POD酶活性維持一定水平以去除活性氧，使植物體內(nèi)的POD與活性氧維持一定的平衡[10]。SOD能夠清除植物體內(nèi)的超氧自由基，是植物重要的抗氧化物保護(hù)酶。本研究對(duì)主要生育期葉片POD和SOD酶活性測(cè)定表明，MF K326與(gla)S、(sua)S的POD及SOD酶活性均在團(tuán)棵期達(dá)到最高值；在全生育期，MF K326的POD及SOD酶活性也均高于兩種不育胞質(zhì)。盛花期葉片與花蕾組織中POD及SOD酶活性測(cè)定結(jié)果表明，葉片及花蕾組織MF K326的POD及SOD酶活性也高于(gla)S及(sua)S不育胞質(zhì)。本研究表明，供試兩種不育胞質(zhì)POD酶活性降低，可能會(huì)使煙株體內(nèi)的POD與活性氧失去平衡，而SOD酶活性的降低可能會(huì)使植物體內(nèi)產(chǎn)生的超氧自由基不能及時(shí)清除，酶活性的改變可能會(huì)引起膜質(zhì)不穩(wěn)定從而出現(xiàn)不育。這在煙草(sua)S不育系花蕾[11-12]、小麥[5]、水稻[13]、玉米[14]等作物不育系研究中均有報(bào)道。另外，本研究對(duì)(gla)S和(sua)S花柱比較發(fā)現(xiàn)，(gla)S的花柱和保持系一樣，柱頭為兩瓣，而(sua)S則以3瓣和4瓣為主，花柱有畸形等。這種現(xiàn)象是否與(gla)S胞質(zhì)較高的ATP含量、SOD酶活性高于(sua)S等有關(guān)，尚待下一步開展基于基因組學(xué)、代謝組學(xué)為基礎(chǔ)的相關(guān)研究予以闡明。

4 結(jié)論

煙草兩種質(zhì)源胞質(zhì)雄性不育系同保持系之間在盛花期POD、SOD酶活性及ATP、ADP含量發(fā)生明顯變化，MF K326的POD及SOD酶活性均顯著高于(gla)S及(sua)S，ATP、ADP含量顯著高于(gla)S及(sua)S。盛花期是種子形成的關(guān)鍵時(shí)期，酶活性的降低和ATP、ADP含量下降是導(dǎo)致(gla)S及(sua)S不育的重要因素。本研究為進(jìn)一步開展胞質(zhì)不育系機(jī)理研究及雜種優(yōu)勢(shì)利用提供了基礎(chǔ)。