王宿潔,宋丹丹,李煜,孟平平,朱金輝,朱禮彥,黃瑾*
(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 832000;2 杭州師范大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,浙江 杭州 310036)
Neuritin(又稱(chēng)可塑性候選相關(guān)基因15,CPG15)是Nedivi等人首次發(fā)現(xiàn)的一種新的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[1-2]。研究表明,Neuritin在神經(jīng)發(fā)育、損傷修復(fù)、學(xué)習(xí)認(rèn)知等方面均具有很大的作用[3-6]。Neuritin能夠促進(jìn)突觸素的聚集、突觸發(fā)生以及成熟[7-8],促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)與分支[9-10],保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免于凋亡[11-12]。Neuritin還能促進(jìn)細(xì)胞的遷移[13]。目前在學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知方面的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn):Neuritin既可產(chǎn)生抗抑郁的作用[14];又可以影響學(xué)習(xí)能力[15]和修復(fù)認(rèn)知功能[16-17]。
本課題組率先在國(guó)內(nèi)開(kāi)展了重組人Neuritin蛋白(recombinant human Neuritin,rhNeuritin)的功能研究,研究發(fā)現(xiàn)rhNeuritin蛋白能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移,并誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化,還會(huì)影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老、凋亡、增殖和遷移;該重組蛋白能夠挽救受損中樞神經(jīng)細(xì)胞[18],維持神經(jīng)元的存活、抑制凋亡,提高殘存神經(jīng)軸突的再生能力和可塑性,加速急性脊髓損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù),本課題組明確了rhNeuritin蛋白對(duì)中樞神經(jīng)損傷后再生修復(fù)的有效性。
本課題組用于檢測(cè)rhNeuritin蛋白活性的方法有兩種,一種是雞胚背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)組織培養(yǎng)檢測(cè)法[19],另一種是通過(guò)未分化的PC12細(xì)胞突起的生長(zhǎng)狀況檢測(cè)法[20]。這兩種方法雖然都具有直觀、準(zhǔn)確地反映rhNeuritin蛋白生物學(xué)活性的優(yōu)點(diǎn),但是這兩種方法也有許多不足之處。
首先DRG的取材不易,這導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)的可操作性很差,其次由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存?zhèn)€體差異,從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性也很差。當(dāng)通過(guò)未分化的PC12細(xì)胞突起的生長(zhǎng)狀況檢測(cè)rhNeuritin蛋白的生物學(xué)活性時(shí),未分化的PC12細(xì)胞的培養(yǎng)條件嚴(yán)苛,實(shí)驗(yàn)結(jié)果易受外界培養(yǎng)條件的干擾,不易控制,從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可控性;其次PC12細(xì)胞的培養(yǎng)周期長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)受到時(shí)間上的制約。基于上述的兩種方法都有所局限,我們?cè)噲D尋找一種短時(shí)高效的從細(xì)胞水平反應(yīng)rhNeuritin蛋白對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能作用的新方法來(lái)檢測(cè)rhNeuritin蛋白的生物學(xué)活性。
1.1.1 細(xì)胞
小鼠海馬神經(jīng)元(Hippocampal neuronal cell line,HT22)(復(fù)祥生物)
1.1.2 蛋白
重組人Neuritin蛋白(recombinant human Neuritin,rhNeuritin)(課題組利用酵母表達(dá)系統(tǒng)制備,疏水層析法純化,SDS-PAGE電泳檢驗(yàn)純度為99.9%)
腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)(Abcom公司)
1.1.3 實(shí)驗(yàn)器械
倒置顯微鏡(Nikon 公司);CO2培養(yǎng)箱(Thermo 公司);高壓蒸汽滅菌器 (日本SANYO Labo Autoclave 公司);DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);低速離心機(jī)(江東儀器);生物安全柜(Thermo 公司);冰箱(中國(guó)海爾集團(tuán));液氮罐(Thermo 公司);移液器(德國(guó)Eppendorf 公司);Handeld Automated Cell Counter (Millipore公司);分光吸收讀板機(jī)(Molecular Devices 公司)。
1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑
胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)(以色列Biological Industries 公司);RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone 公司);胰酶細(xì)胞消化液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Promega Substrate Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent(美國(guó)Promega 公司);20×PBS緩沖液(上海生工生物工程股份有限公司)。
1.2.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)HT22細(xì)胞的影響
HT22細(xì)胞,培養(yǎng)條件在37 ℃ 5%CO2條件下,使用含10% FBS的1640培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT22細(xì)胞平均接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,約為1×104個(gè)細(xì)胞/孔,3孔/組,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。上述接種HT22細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)基,重新加入無(wú)血清的1640培養(yǎng)基,于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后將培養(yǎng)基換成分別含有0%、0.2%、0.4%、0.6% FBS的1640培養(yǎng)基于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),每隔48 h換1次上述培養(yǎng)基,每隔24 h利用倒置顯微鏡觀察不同濃度FBS培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)后,利用Promega Substrate Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent試劑盒檢測(cè)HT22細(xì)胞的存活率,其公式為(實(shí)驗(yàn)組的OD值-空白組OD值)/(陰性對(duì)照組的OD值-空白組OD值),比較5 d內(nèi)不同濃度 FBS對(duì)HT22細(xì)胞存活的影響,并篩選出僅維持HT22細(xì)胞存活的FBS的濃度。
1.2.2 rhNeuritin蛋白作用于HT22細(xì)胞的檢測(cè)時(shí)間
接種HT22細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板于37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后,棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)液,重新加入無(wú)血清的1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。之后棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)基,重新加入含有1 000 ng·mL-1的rhNeuritin蛋白的維持培養(yǎng)液,含有1 000 ng·mL-1陽(yáng)性對(duì)照的BDNF蛋白的維持培養(yǎng)液,以及含有上述蛋白同體積陰性對(duì)照PBS的維持培養(yǎng)液,每隔48 h換1次上述培養(yǎng)液。每隔24 h利用倒置顯微鏡觀察含有rhNeuritin蛋白和BDNF蛋白維持培養(yǎng)液的細(xì)胞狀態(tài)后,利用Promega Substrate Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent試劑盒檢測(cè)HT22細(xì)胞的存活率。比較4 d內(nèi)rhNeuritin蛋白和BDNF蛋白對(duì)于HT22細(xì)胞存活的影響并篩選出rhNeuritin蛋白對(duì)HT22細(xì)胞作用的檢測(cè)時(shí)間。
1.2.3 rhNeuritin蛋白對(duì)HT22細(xì)胞存活的影響
接種HT22細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板于37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后,棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)液,重新加入無(wú)血清的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)液,重新加入分別含有0、7.8、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000 ng·mL-1的rhNeuritin蛋白的維持培養(yǎng)液,含有500 ng·mL-1的BDNF蛋白的維持培養(yǎng)液,以及含有上述蛋白同體積PBS的維持培養(yǎng)液。每隔48 h換1次上述培養(yǎng)液,每隔24 h利用倒置顯微鏡觀察上述細(xì)胞狀態(tài)后,利用Promega Substrate Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent試劑盒檢測(cè)HT22細(xì)胞的存活率,比較3 d內(nèi)不同濃度rhNeuritin對(duì)HT22細(xì)胞存活的影響。
1.2.4 不同濃度的rhNeuritin蛋白與HT22細(xì)胞存活的量效關(guān)系研究
根據(jù)上述11組濃度的rhNeuritin蛋白作用于HT22細(xì)胞72 h,其對(duì)HT22細(xì)胞存活影響的量化結(jié)果,擬合rhNeuritin蛋白與HT22細(xì)胞的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn),并計(jì)算出rhNeuritin蛋白(標(biāo)準(zhǔn)品)對(duì)HT22細(xì)胞存活的EC50值,同時(shí)摸索rhNeuritin蛋白與HT22細(xì)胞存活呈正比例函數(shù)關(guān)系的濃度范圍,確定rhNeuritin蛋白的檢測(cè)線(xiàn)。新制備2批rhNeuritin蛋白作為測(cè)試品進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn),在檢測(cè)限范圍內(nèi),以EC50標(biāo)準(zhǔn)品為一個(gè)活性單位,比較測(cè)試品與標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白活性。
1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
所有實(shí)驗(yàn)計(jì)量數(shù)據(jù)都以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,運(yùn)用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖,用**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1,表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
0% FBS培養(yǎng)HT22細(xì)胞,在1~5 d內(nèi),隨著時(shí)間的推移,細(xì)胞突起回縮,細(xì)胞變圓,細(xì)胞皺縮,細(xì)胞活力越來(lái)越差,HT22細(xì)胞的存活率在逐漸降低(圖1A、B),(**,P<0.01); 0.2% FBS培養(yǎng)HT22細(xì)胞,在第2天,HT22細(xì)胞突起增多,HT22細(xì)胞的存活率達(dá)到最高,之后隨著時(shí)間的推移,細(xì)胞突起回縮,細(xì)胞變圓,細(xì)胞皺縮,HT22細(xì)胞的存活率降低(圖1A、圖1B),(**,P<0.01);0.4% 、0.6% FBS培養(yǎng)HT22細(xì)胞,在1~3 d內(nèi)隨時(shí)間推移,細(xì)胞突起增多,能夠建立細(xì)胞間的聯(lián)系,符合細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)(排除細(xì)胞接觸抑制),細(xì)胞活力也隨之增高,HT22細(xì)胞的存活率在第3天達(dá)到最高,之后隨著時(shí)間的推移,細(xì)胞突起回縮,細(xì)胞變圓,細(xì)胞逐漸皺縮,HT22細(xì)胞的存活率在緩慢降低(圖1A、圖1B)(**,P<0.01)。由于0.4% FBS和0.6% FBS培養(yǎng)條件下的HT22細(xì)胞的狀態(tài)差別不大,最終選擇0.4% FBS作為本次實(shí)驗(yàn)HT22細(xì)胞維持培養(yǎng)條件。
維持培養(yǎng)液濃度為0.4% FBS,以市售的BDNF(Abcam公司)標(biāo)定的有效濃度(500~1 500 ng·mL-1)為參考,用1 000 ng·mL-1rhNeuritin蛋白處理HT22細(xì)胞,檢測(cè)96 h內(nèi)HT22細(xì)胞存活狀況。發(fā)現(xiàn)在干預(yù)的72~96 h,rhNeuritin組HT22細(xì)胞的存活率高于對(duì)照組,BDNF組HT22細(xì)胞的存活率也高于對(duì)照組(**,P<0.01),見(jiàn)圖2。因此選擇最早檢測(cè)到rhNeuritin蛋白有效作用72 h作為最佳檢測(cè)時(shí)間。
A:依次為0% FBS、0.2% FBS、0.4% FBS、0.6% FBS +1640培養(yǎng)HT22細(xì)胞5 d內(nèi)倒置顯微鏡下的細(xì)胞狀態(tài)圖;B:5 d內(nèi)不同濃度的FBS培養(yǎng)HT22細(xì)胞的細(xì)胞存活狀況的量化圖(n=3,** P<0.01, vs同一天內(nèi)0% FBS+1640培養(yǎng)HT22細(xì)胞的細(xì)胞存活率)。圖1 5 d內(nèi)不同濃度FBS對(duì)HT22細(xì)胞的存活的影響
A:0.4% FBS+1 640+1 000 ng·mL-1 rhNeuritin培養(yǎng)HT22細(xì)胞72 h和96 h倒置顯微鏡下的細(xì)胞狀態(tài)圖;B:0.4% FBS+1 640+1 000 ng·mL-1 rhNeuritin培養(yǎng)HT22細(xì)胞72 h的細(xì)胞存活狀況的量化圖(n=3,** P<0.01 vs 0.4% FBS+1640+PBS培養(yǎng)HT22細(xì)胞72 h的細(xì)胞存活率);0.4%FBS+1 640+1 000 ng·mL-1 rhNeuritin培養(yǎng)HT22細(xì)胞 96 h的細(xì)胞存活狀況的量化圖(n=3,** P<0.01 vs 0.4% FBS+1640+PBS培養(yǎng)HT22細(xì)胞96 h的細(xì)胞存活率)。圖2 rhNeuritin對(duì)HT22細(xì)胞分別作用72 h和96 h對(duì)細(xì)胞存活的影響
分別給予HT22細(xì)胞(0~4 000 ng·mL-1)11組濃度梯度的rhNeuritin蛋白培養(yǎng)72 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HT22細(xì)胞的存活率隨著rhNeuritin蛋白濃度的增加而升高,rhNeuritin蛋白的濃度為1 000 ng·mL-1時(shí),HT22細(xì)胞的存活率達(dá)到最高,之后即使增加rhNeuritin蛋白的濃度,HT22細(xì)胞的存活率也不再增加,進(jìn)入平臺(tái)期(圖3)。
根據(jù)(0~4 000 ng·mL-1)11組濃度梯度的rhNeuritin蛋白干預(yù)HT22細(xì)胞72 h后測(cè)得的細(xì)胞OD值計(jì)算出HT22細(xì)胞的存活率(表1,表2),同時(shí)擬合rhNeuritin蛋白濃度與HT22細(xì)胞存活之間的量效曲線(xiàn)(圖4),并計(jì)算出rhNeuritin蛋白(標(biāo)準(zhǔn)品)對(duì)HT22細(xì)胞存活的EC50值為85.111 6 ng·mL-1。
表1 不同濃度的rhNeuritin蛋白(標(biāo)準(zhǔn)品)分別作用于HT22細(xì)胞72 h后的OD值
表2 不同濃度的rhNeuritin蛋白(標(biāo)準(zhǔn)品)分別作用于HT22細(xì)胞72 h后的細(xì)胞存活率
圖4 標(biāo)準(zhǔn)品的rhNeuritin蛋白與HT22細(xì)胞存活的擬合曲線(xiàn)
之后我們又新制備了兩批rhNeuritin蛋白作為測(cè)試品重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),根據(jù)測(cè)得的細(xì)胞OD值計(jì)算HT22細(xì)胞的存活率(表3,表4),同時(shí)計(jì)算出測(cè)試品1的EC50值為89.229 6 ng·mL-1,測(cè)試品2的EC50為86.451 3 ng·mL-1(圖5,圖6),與85.111 6 ng·mL-1(EC50值標(biāo)準(zhǔn)品)差值分別為4.8%和1.6%,二者均小于5%,相距較小,重復(fù)性較好。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試品的rhNeuritin蛋白的濃度在62.5~1 000 ng·mL-1的范圍內(nèi),rhNeuritin蛋白的濃度與HT22細(xì)胞的存活呈正比例函數(shù)關(guān)系,即Y=0.013 5X+115.42 (R2=0.908 3),Y1= 0.015 1X+115.86 (R2=0.943 2),Y2=0.014 6X+117.32 (R2=0.901 7),X代表rhNeuritin蛋白的濃度,Y表示HT22細(xì)胞的存活率(圖7,圖8,圖9)。
表3 不同濃度的rhNeuritin蛋白(測(cè)試品)分別作用于HT22細(xì)胞72 h后的OD值
表4 不同濃度的rhNeuritin蛋白(測(cè)試品)分別作用于HT22細(xì)胞72 h后的細(xì)胞存活率
圖5 測(cè)試品1 的rhNeuritin蛋白與HT22細(xì)胞存活的擬合曲線(xiàn)
圖7 檢測(cè)限內(nèi)HT22細(xì)胞存活與rhNeuritin蛋白(標(biāo)準(zhǔn)品)濃度的量效關(guān)系曲線(xiàn)
圖8 檢測(cè)限內(nèi)HT22細(xì)胞存活與rhNeuritin蛋白(測(cè)試品1)濃度的量效關(guān)系
圖9 檢測(cè)線(xiàn)內(nèi)HT22細(xì)胞存活與rhNeuritin蛋白(測(cè)試品2)濃度的量效關(guān)系
擬定標(biāo)準(zhǔn)品的EC50(85.111 6 ng·mL-1)為一個(gè)活性單位,在62.5~1 000 ng·mL-1的檢測(cè)限范圍時(shí),標(biāo)準(zhǔn)品rhNeuritin蛋白濃度與HT22細(xì)胞的存活率呈正比例函數(shù)關(guān)系,計(jì)算得到此時(shí)的細(xì)胞存活率為116.57%;在62.5~1 000 ng·mL-1的檢測(cè)限范圍時(shí),標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試品的rhNeuritin蛋白濃度與HT22細(xì)胞的存活率呈正比例函數(shù)關(guān)系,本研究選擇500 ng·mL-1作為干預(yù)濃度,實(shí)驗(yàn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)品的細(xì)胞存活率為124.38%,此濃度時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品的活性單位為1.067;實(shí)驗(yàn)測(cè)得此濃度時(shí)測(cè)試品1的細(xì)胞存活率為125.21%,測(cè)試品2的細(xì)胞存活率為126.80%。由于測(cè)試品與標(biāo)準(zhǔn)品的存活率之比即為二者的活性單位之比,那么500 ng·mL-1時(shí)測(cè)試品1的活性單位為1.074,測(cè)試品2的活性單位為1.088。通過(guò)劑量效應(yīng)關(guān)系計(jì)算獲得的500 ng·mL-1時(shí)測(cè)試品1的活性單位為1.059、測(cè)試品2的活性單位為1.069,實(shí)際測(cè)得與計(jì)算獲得的500 ng·mL-1時(shí)測(cè)試品1的活性單位的誤差為1.4%、測(cè)試品2的活性單位的誤差為1.7%,實(shí)際測(cè)得與計(jì)算獲得的測(cè)試品1和測(cè)試品2的活性單位的誤差均小于2%,證明該方法準(zhǔn)確性很好。
目前缺乏針對(duì)重組人Neuritin蛋白生物學(xué)活性的量化評(píng)價(jià)方法,本研究按照藥典要求,建立了一種定量評(píng)價(jià)rhNeuritin蛋白生物學(xué)活性的高效易行的新方法。
首先是細(xì)胞系的選擇和培養(yǎng)條件的確定。眾所周知Neuritin在神經(jīng)可塑性方面發(fā)揮重要作用的,特別是在學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的海馬區(qū)域,因此,根據(jù)rhNeuritin的功能特點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)選定小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞為受試細(xì)胞,以細(xì)胞的存活率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。接著我們對(duì)HT22細(xì)胞的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)液的FBS含量進(jìn)行了摸索,確定了維持培養(yǎng)液中FBS濃度為0.4%。
其次,針對(duì)該重組蛋白的檢測(cè)要求,進(jìn)行了檢測(cè)時(shí)間及檢測(cè)限的探索,最終建立了針對(duì)rhNeuritin蛋白生物學(xué)活性的評(píng)價(jià)體系。研究發(fā)現(xiàn)HT22細(xì)胞在維持培養(yǎng)后,給予Neuritin蛋白觀察72 h,在62.5~1 000 ng·mL-1的檢測(cè)限范圍內(nèi),rhNeuritin蛋白與HT22細(xì)胞的存活率存在劑量效應(yīng)關(guān)系,此法可作為rhNeuritin蛋白生物學(xué)活性的定性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
為了進(jìn)一步定量檢測(cè)rhNeuritin蛋白活性,設(shè)置了(0~4 000 ng·mL-1)11組濃度梯度,根據(jù)rhNeuritin蛋白與HT22細(xì)胞存活率的擬合曲線(xiàn)(圖4),我們繪制了標(biāo)準(zhǔn)品的量效關(guān)系曲線(xiàn)(圖7),在檢測(cè)限范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)品rhNeuritin蛋白與HT22細(xì)胞的存活率之間呈正比例函數(shù)關(guān)系,且R2為0.098 3,將標(biāo)準(zhǔn)品的EC50(85.111 6 ng·mL-1)擬訂為一個(gè)活性單位。
為了驗(yàn)證該方法的重復(fù)性,我們分別建立了2批測(cè)試品rhNeuritin蛋白與HT22細(xì)胞存活的擬合曲線(xiàn)(圖5,圖6),并繪制了相應(yīng)的量效關(guān)系曲線(xiàn)(圖8,圖9),兩組測(cè)試品重組人Neuritin蛋白的量效關(guān)系曲線(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品呈現(xiàn)相同趨勢(shì),3者R2均大于0.9,說(shuō)明該方法的重復(fù)性很好。由于測(cè)試品與標(biāo)準(zhǔn)品的活性單位之比即為它們的細(xì)胞存活率之比,由擬訂的標(biāo)準(zhǔn)品蛋白的活性單位,即可計(jì)算得測(cè)試品蛋白在EC50的活性單位。
為了證實(shí)該方法的準(zhǔn)確性,選取檢測(cè)限范圍內(nèi)500 ng·mL-1,實(shí)際檢測(cè)2批測(cè)試品的細(xì)胞存活率,進(jìn)而推算出二者的活性單位分別為1.074 1和1.087 8,而通過(guò)量效關(guān)系計(jì)算獲得的測(cè)試品1的活性單位1.058 7、測(cè)試品2的活性單位1.069 1。500 ng·mL-1時(shí)實(shí)際測(cè)得的活性單位與通過(guò)量效關(guān)系計(jì)算的活性單位相比,測(cè)試品1誤差為1.4%、測(cè)試品2的誤差為1.7%,均小于2%,證明該方法準(zhǔn)確性較好。
綜上所述,本研究通過(guò)rhNeuritin蛋白對(duì)HT22細(xì)胞存活的影響,建立了rhNeuritin蛋白與HT22細(xì)胞的量效關(guān)系曲線(xiàn),并擬定了rhNeuritin蛋白的活性單位,為進(jìn)一步快速高效地評(píng)價(jià)rhNeuritin蛋白的生物學(xué)活性提供了新方法。與本課題組之前使用的rhNeuritin蛋白活性檢測(cè)方法——雞胚背根神經(jīng)節(jié)法相比,該方法不僅具有重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)周期短的優(yōu)點(diǎn),還實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同批次的rhNeuritin蛋白的生物學(xué)活性的定量檢測(cè),并制定了明確的活性單位。