康曉彤，趙博

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240)

1982年表達(dá)蛋白于病毒的表面被首次提出，Smith[1-2]于3年后將這一理念付諸實(shí)踐，引出噬菌體展示技術(shù)(Phage display technology, PDT)這一概念，將外源基因表達(dá)的多肽展示在噬菌體的表面，后來Gregory P. Winter等利用該技術(shù)將抗體片段展示在噬菌體表面[3]，使有關(guān)噬菌體領(lǐng)域迅速發(fā)展。

噬菌體展示技術(shù)是一種基于噬菌體表面展示的目標(biāo)多肽或蛋白進(jìn)行篩選的體外選擇系統(tǒng)。其基本原理是將包含目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入噬菌體內(nèi)，表達(dá)在噬菌體的表面，根據(jù)特異性結(jié)合能力的強(qiáng)弱篩選出與靶分子親和力高的目標(biāo)多肽[4-6]。采用噬菌體展示技術(shù)，基因組允許插入外源DNA序列長度達(dá)12 000 bp[7]。噬菌體展示技術(shù)通常通過各種展示文庫來篩選特異性探針[8]、研究抗原表位[9]、發(fā)現(xiàn)新型生物標(biāo)志物[10]、生產(chǎn)高效低價疫苗[11]、研究DNA結(jié)合蛋白及蛋白質(zhì)定向改造[12]等。本實(shí)驗(yàn)將編碼整個抗體結(jié)合域的基因(以單鏈可變片段scFv形式)融合到基因III，以活性片段scFv形式表達(dá)，與完整抗體相比在組織穿透力方面都有明顯優(yōu)勢，這種方法促進(jìn)了在噬菌體病毒粒子外表面上足夠水平的抗體展示，從而可選擇識別抗原的噬菌體。

在本研究中提供了1種用于構(gòu)建噬菌體抗體庫的模型質(zhì)粒，以及應(yīng)用該質(zhì)粒建立的模型篩選方法。在目的基因下游添加牛凝血酶(thrombin)特異性酶切位點(diǎn)，通過PCR引物擴(kuò)增已有的抗BCMA(人源化的抗5666B細(xì)胞成熟抗原(B-cell maturation antigen))的單克隆抗體的scFv，將擴(kuò)增的PCR片段克隆到pComb3H噬菌粒中，得到目標(biāo)質(zhì)粒pComb3H-BCMA-scFv。利用噬菌體表面展示BCMA-scFv建立噬菌體篩選模型，評估創(chuàng)新篩選方法的可行性，通過SDS-PAGE及Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證牛凝血酶特異性洗脫效果，利用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))及噬菌體滴度檢測特異性洗脫后單鏈抗體的結(jié)合活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在構(gòu)建噬菌體抗體庫的噬菌粒載體上添加牛凝血酶特異性酶切位點(diǎn)的篩選方法，可以減少篩選輪次高效篩選出特異性噬菌體抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株E.coliXL1-Blue，SS3220與噬菌粒載體pComb3H為本實(shí)驗(yàn)室儲存，輔助噬菌粒M13KO7于Invitrogen公司購買。TaqDNA Polymerase于Toyobo公司購買，T4 DNA Ligase于Thermo Fisher Scientific公司購買，限制性內(nèi)切酶SacⅠ、SpeⅠ、KpnI于New England Biolabs公司購買。離心柱型質(zhì)粒小提試劑盒、通用型DNA回收試劑盒于天根公司購買，鼠源單抗anti-Flag、anti-M13于abcam公司購買，羊抗鼠單抗HRP goat-anti-mouse于CST公司購買，牛凝血酶Thrombin于翌盛生物科技有限公司購買，鏈霉親和素96孔板于Thermo Fisher Scientific公司購買，TMB顯色液于雷根公司購買，PCR引物合成、基因片段合成以及基因測序?yàn)镚ENEWIZ公司。TBS緩沖液(0.02 mol·L-1Tris HCl，0.15 mol·L-1NaCl，pH 約7.5)，TBS-T緩沖液(0.05 mol·L-1Tris Base，0.15 mol·L-1NaCl，0.05%Tween，0.05%Triton X-100，pH約7.5)及其它試劑均在本實(shí)驗(yàn)室配置。

1.2 噬菌體抗體庫模型質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1 以BCMA-scFv基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR基因擴(kuò)增

在BCMA-scFv(抗BCMA的單鏈抗體)基因后添加Flag小肽，作為后期Western Blot及ELISA驗(yàn)證的抗體標(biāo)簽，上游酶切位點(diǎn)SacI，下游SpeI酶切位點(diǎn)后添加牛凝血酶最適切割位點(diǎn)LVPRGS，設(shè)計(jì)抗體基因的上下游引物(表1)。以BCMA-scFv基因的質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)PCR體系為50 μL：引物濃度10 μmol·L-1，1 μL質(zhì)粒，1 μL引物(上)，1 μL引物(下)，25 μLTaqMix，22 μL dd H2O。程序如下：94 ℃反應(yīng)3 min預(yù)變形，94 ℃繼續(xù)反應(yīng)30 s，65 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)1 min，變形、退火、延伸過程進(jìn)行30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃反應(yīng)5 min，4 ℃暫存，得到BCMA-scFv的PCR產(chǎn)物。

表1 PCR引物及測序引物信息

1.2.2 樣品凝膠電泳

全部樣品上樣電泳(根據(jù)DNA分子量大小，配置1.2%瓊脂糖凝膠)，110 V，30 min。跑膠完成后，將凝膠置于凝膠成像儀中紫外下觀察，拍照觀察后，切取對應(yīng)位置(約800 bp)的PCR片段，使用天根通用型DNA回收試劑盒回收純化，使用微量分光光度計(jì)測定回收濃度。

1.2.3 連接轉(zhuǎn)化測序單克隆

將BCMA-scFv基因進(jìn)行SacⅠ和SpeⅠ酶切處理，連接在同樣酶切位點(diǎn)的pComb3H載體上。30 μL酶切體系如下：800 ng BCMA-scFv PCR片段/1 μg pComb3H，1 μLSacI，1 μLSpeI，5 μL 10X buffer ，加dd H2O補(bǔ)齊至30 μL。將體系置于37 ℃溫水中4 h，酶切結(jié)束后將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，濃度為1%，將跑完的凝膠置于紫外成像儀下從凝膠中切取對應(yīng)位置的載體片段，使用天根通用型DNA回收試劑盒回收純化。利用T4 DNA Ligase對Insert和Vector進(jìn)行連接，設(shè)計(jì)連接體系為10 μL：7 μL BCMA-scFv酶切片段，1.5 μL pComb3H酶切片段，1 μL 10× T4 buffer，0.5 μL T4 ligase。混勻后室溫反應(yīng)1 h，將酶連產(chǎn)物3 μL通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)化至DH5α細(xì)胞中，放于冰上30 min，42 ℃熱激90秒，然后冰敷2 min，迅速加入SOC復(fù)蘇培養(yǎng)基1 mL，放于37 ℃小搖床上培養(yǎng)1 h，將400 μL復(fù)蘇液均勻涂布在含有氨芐抗生素的LB平板上，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)約12 h；第2天，從平板上挑取單克隆于搖菌小試管中接種，培養(yǎng)基為5 mL含有100 mg·mL-1氨芐抗生素的LB液體，于37 ℃小搖床220 rpm培養(yǎng)12 h；第3天，質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提，于GENEWIZ公司進(jìn)行測序。然后比對模板序列和測序結(jié)果，確定目標(biāo)序列是否成功構(gòu)建，得到質(zhì)粒pComb3H-BCMA-scFv。

1.3 噬菌體表面展示BCMA-scFv

取2 μL測序正確的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至被輔助噬菌體(helper phage)感染的50 μL SS320感受態(tài)細(xì)胞中，加1 mL預(yù)熱SOC復(fù)蘇，于37 ℃小搖床培養(yǎng)1 h，將全部復(fù)蘇液移至2YT培養(yǎng)基，培養(yǎng)基包含氨芐和卡那雙重抗性，放于37 ℃大搖床中250 r·min-1培養(yǎng)12 h；第2天，離心收集上清，5 000 r·min-110 min，于上清中加入20%的PEG-NaCl試劑，冰上靜置至少30 min，經(jīng)9 000 r·min-1離心20 min后，收集噬菌體沉淀，加入少量TBS溶液溶解沉淀，收集后4 ℃高速離心10 min，移上清于EP管中，棄細(xì)菌沉淀。取1 mL事先培養(yǎng)至OD600=0.6的XL1-Blue菌液，接種1 μL噬菌體溶液，37 ℃小搖床中250 r·min-1培養(yǎng)1 h，將10 μL菌液以10倍梯度進(jìn)行稀釋，在瓊脂平板上點(diǎn)板，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)約12 h，取出平板后計(jì)數(shù)菌落數(shù)來確定噬菌體滴度。

1.4 驗(yàn)證牛凝血酶洗脫效果

1.4.1 SDS-PAGE檢測thrombin酶切噬菌體表面展示的BCMA-scFv

用酶切單位依次增加的牛凝血酶量0 U,2 U,4 U,6 U,8 U分別酶切100 μL表面展示BCMA-scFv的噬菌體，37 ℃水浴酶切2 h。酶切后，取40 μL樣品加入10 μL 5×蛋白上樣緩沖液，于金屬浴99 ℃加熱10 min使蛋白變性。根據(jù)目的蛋白及牛凝血酶蛋白大小，樣品取40 μL使用8%～16%的梯度膠進(jìn)行上樣，以上層濃縮膠80 V，20 min，下層分離膠120 V，90 min進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染料染色半小時，過夜脫色，隔日觀看酶切蛋白情況。

1.4.2 Western Blot檢測thrombin酶切噬菌體表面展示的BCMA-scFv

Western Blot實(shí)驗(yàn)前，酶單位依次增加的每種樣品取35 μL上樣，以90 V ,90 min的條件進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白膠濃度為12%。電泳結(jié)束，將SDS-PAGE膠小心從玻璃板上切下，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜。將夾子在盛有轉(zhuǎn)膜液的水槽中打開，兩側(cè)的海綿墊上分別鋪2層濾紙，在水中打濕，按照“黑膠白膜”的方式將SDS-PAGE膠和0.45 μm的NC膜貼合在濾紙上，轉(zhuǎn)膜液沒過膠和膜，保證NC膜可以完全覆蓋膠上的Marker及樣品條帶，并用楔子趕走膠與膜之間的氣泡。將夾子夾緊后隨轉(zhuǎn)膜液一起倒入電泳槽中，并將整個電泳槽插入冰中，保證轉(zhuǎn)膜過程中的持續(xù)低溫狀態(tài)。調(diào)節(jié)電壓100 V轉(zhuǎn)膜80 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜浸入麗春紅溶液中幾分鐘，清洗幾次后觀察膜上的條帶狀況，然后將麗春紅洗凈后將膜完全浸于5%脫脂牛奶中常溫封閉1 h。封閉結(jié)束后，洗去NC膜上殘留的牛奶，將膜置于含有Rabbit-HA一抗的塑封袋中，去除干凈塑封袋中的氣泡，4 ℃過夜孵育。隔日將NC膜置于1×TNET溶液中，洗膜3次，每次15 min。洗膜充分后，將膜置于含有R800熒光二抗的塑封袋中，避光孵育1 h。用上述方法洗去未結(jié)合的二抗，最后利用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜觀察結(jié)果。

1.4.3 包被BCMA抗原通過ELISA和測試洗脫噬菌體滴度檢測牛凝血酶洗脫效果

在鏈霉親和素孔板中加入生物素化的BCMA抗原，于室溫下孵育1 h，TBS溶液進(jìn)行洗滌除去多余的抗原，用3%BSA/TBS溶液封閉未結(jié)合部位1.5 h，棄去封閉液后加入適量的噬菌體溶液，于37 ℃恒溫箱中孵育1 h，TBS-T溶液洗滌去掉多余的噬菌體。在各實(shí)驗(yàn)孔中分別加入牛凝血酶單位依次增加0 U,2 U,4 U,6 U,8 U的洗脫液，TBS稀釋至每孔100 μL，于37 ℃恒溫箱中孵育2 h，收集與抗原結(jié)合的噬菌體，每100 μL洗脫液感染1 mL OD600=0.6的XL1-blue細(xì)胞，測試洗脫噬菌體滴度，同時將100倍稀釋的鼠源anti-M13抗體加入洗脫后的孔板內(nèi)，稀釋液為TBS-T試劑，于37 ℃恒溫箱中孵育1 h，TBS-T溶液洗滌除去多余的抗體，加入現(xiàn)用現(xiàn)配的TMB顯色液，于室溫下避光孵育15 min，用2 mol·L-1H2SO4溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取OD450數(shù)值。

1.4.4 包被anti-Flag抗體通過ELISA和測試洗脫噬菌體滴度檢測牛凝血酶洗脫效果

在實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)加入1000倍稀釋的鼠源anti-Flag抗體，稀釋液為TBS試劑，室溫下孵育1 h，TBS溶液洗滌除去多余的抗原，用3%BSA/TBS溶液封閉未結(jié)合部位1.5 h，棄去封閉液后加入適量稀釋為1×、10×、100×的噬菌體溶液，稀釋液為TBS-T試劑，37 ℃恒溫箱孵育1 h，用TBS溶液和TBS-T溶液洗滌30次，盡可能除去未結(jié)合的噬菌體。在各實(shí)驗(yàn)孔中分別加入牛凝血酶單位依次增加0 U,2 U,4 U,6 U,8 U的洗脫液，TBS稀釋至每孔100 μL，于37 ℃恒溫箱中孵育2 h，收集與抗原結(jié)合的噬菌體，每100 μL洗脫液感染1 mL OD600=0.6的XL1-blue細(xì)胞，測試洗脫噬菌體滴度，同時thrombin洗脫后將100倍稀釋的鼠源anti-M13抗體加入洗脫后的孔板內(nèi)，稀釋液為TBS-T試劑，于37 ℃恒溫箱中孵育1 h，TBS-T溶液洗滌多余的抗體，加入現(xiàn)配的TMB顯色液，于室溫下避光孵育15 min，用2 mol·L-1H2SO4溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取OD450數(shù)值。

1.4.5 通過模型篩選分析牛凝血酶特異性洗脫效果

我們建立一種模型篩選方法，目的是從展示B7-H3-scFv(抗B7-H3的單鏈抗體，與BCMA無作用)的噬菌體混合物中富集展示BCMA-scFv的目標(biāo)噬菌體，通過篩選輪次和目標(biāo)噬菌體富集度評估篩選方法可行性。

1.4.5.1 B7-H3-scFv質(zhì)粒構(gòu)建

將B7-H3-scFv基因進(jìn)行SacⅠ和KpnⅠ酶切處理，連接在同樣酶切位點(diǎn)的pComb3H載體上，通過T4 DNA Ligase進(jìn)行連接反應(yīng)，經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中。其余與1.2中噬菌體抗體庫模型質(zhì)粒構(gòu)建過程一致，保留正確的目的基因質(zhì)粒。后挑選測序正確的質(zhì)粒進(jìn)行噬菌體制備。

1.4.5.2 模型篩選

在鏈霉親和素孔板中加入300 μL BSA-TBS封閉液，封閉酶標(biāo)孔中非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫下放置于水平搖床振搖2 h。棄去封閉液，在封閉處理過的孔板內(nèi)加入生物素化的BCMA抗原，對照管中加入等量抗原包被液，于室溫徐徐振搖1 h，TBS及TBS-T溶液先后洗滌酶標(biāo)孔10次，以除凈未結(jié)合的生物素化抗原。在展示B7-H3抗體的噬菌體溶液中分別混入稀釋比例為1∶100,1∶1 000,1∶10 000的BCMA-scFv噬菌體，將噬菌體溶液混合后加入孔板內(nèi)，結(jié)合1 h，先后用TBS溶液和TBS-T溶液洗滌30次，以除凈多余的噬菌體。洗滌后，每孔加入100 μL 2 U酶切單位的牛凝血酶洗脫特異性結(jié)合噬菌體，37 ℃酶切2 h。將篩選組全部篩選后噬菌體溶液(洗脫液)合并，取1 mL事先培養(yǎng)至OD600=0.6的XL1-Blue菌液，接種1 μL噬菌體溶液，于37 ℃小搖床中250 r·min-1培養(yǎng)1 h，將10 μL菌液以10倍梯度進(jìn)行稀釋，在瓊脂平板上進(jìn)行點(diǎn)板，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)約12 h，取出平板后計(jì)數(shù)菌落數(shù)來確定第一輪篩選后能與抗原結(jié)合的噬菌體的滴度。

隨著篩選的進(jìn)行，可以通過減少鏈霉親和素管內(nèi)包被的抗原含量、減少抗原抗體結(jié)合時間以及降低噬菌體加入量等方式使得篩選條件更加嚴(yán)苛，達(dá)到尋找最優(yōu)親和力抗體的目的。根據(jù)每輪篩選富集度來判定是否需要繼續(xù)篩選。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建新的質(zhì)粒并通過SDS-PAGE和Western Blot檢測噬菌體表面展示的BCMA-scFv

將雙酶切處理的BCMA-scFv Insert產(chǎn)物連接至相同酶切位點(diǎn)的pComb3H載體上，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖1A)，載體和插入片段的條帶大小均符合預(yù)期。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化生長后，挑取多個單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測序，通過與模板序列比對，成功構(gòu)建目標(biāo)序列pComb3H-BCMA-scFv，制備BCMA-scFv噬菌體。用酶切單位依次增加的牛凝血酶量0 U,2 U,4 U,6 U,8 U分別酶切100 μL表面展示BCMA-scFv的噬菌體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western Blot(圖1B、圖1C)，目標(biāo)蛋白條帶大小符合預(yù)期，隨著酶切單位增加，目標(biāo)蛋白濃度增加，酶切效果越好。

A:載體和插入片段的DNA凝膠電泳圖；B:SDS-PAGE檢測thrombin酶切噬菌體展示的BCMA-scFv; C:Western Blot檢測thrombin酶切噬菌體展示的BCMA-scFv。圖1 質(zhì)粒的構(gòu)建及噬菌體展示的BCMA-scFv檢測圖

2.2 包被BCMA抗原通過ELISA和測試洗脫噬菌體滴度檢測牛凝血酶洗脫效果

用鏈霉親和素孔板包被生物素化的BCMA抗原，按照ELISA的檢測方法，在實(shí)驗(yàn)孔加入0 U,2 U,4 U,6 U,8 U不同牛凝血酶單位的洗脫液，測試洗脫液的噬菌體滴度(圖2A)，同時加入TMB顯色液后顯色于450 nm處讀取吸光度(圖2B)。如圖2A、圖2B所示，在包被BCMA抗原條件下，使用thrombin酶切洗脫的洗脫噬菌體滴度約是不使用thrombin酶切噬菌體滴度的10倍以上，具有顯著性差異，按照節(jié)約試劑和效果最佳的原則，確定thrombin酶切單位2 U為最適用量。通過對噬菌體溶液進(jìn)行梯度稀釋來改變噬菌體濃度，對稀釋后的噬菌體溶液進(jìn)行ELISA檢測，thrombin酶切洗脫后，檢測洗脫液的噬菌體滴度和TMB顯色后的OD450值(圖2C、圖2D)。實(shí)驗(yàn)組與對照組的噬菌體滴度相差10倍即為出現(xiàn)顯著性差異，由圖2C中可以看到，實(shí)驗(yàn)組的噬菌體滴度均與對照組具有顯著差異，說明牛凝血酶可特異性洗脫表面展示BCMA-scFv的噬菌體，效果良好。

A：包被BCMA抗原通過ELISA確定該條件下最適酶切用量；B：包被BCMA抗原通過測試噬菌體滴度確定該條件下最適酶切用量；C：包被BCMA抗原通過ELISA檢測thrombin洗脫效果；D：包被BCMA抗原通過測試噬菌體滴度檢測thrombin洗脫效果。圖2 包被BCMA抗原后，不同條件下檢測thrombin酶切的噬菌體滴度和OD450

2.3 包被anti-Flag抗體通過ELISA和測試洗脫噬菌體滴度檢測牛凝血酶洗脫效果

包被鼠源anti-Flag單抗，加入梯度稀釋的噬菌體溶液，反應(yīng)后在各實(shí)驗(yàn)孔中分別加入牛凝血酶單位依次增加0 U,2 U,4 U,6 U,8 U的洗脫液，按照ELISA的檢測方法，先測定洗脫液的噬菌體滴度，然后加入TMB顯色液顯色后于450 nm處讀取吸光度(圖3A、圖3D)。在包被anti-Flag抗體條件下，使用thrombin酶切洗脫的洗脫噬菌體滴度約是不使用thrombin酶切噬菌體滴度的100倍(10倍以上)，具有顯著性差異，按照節(jié)約試劑和效果最佳的原則，確定thrombin酶切單位2 U為最適用量。將噬菌體溶液梯度稀釋，thrombin酶切洗脫后，實(shí)驗(yàn)組的噬菌體滴度均是對照組的1 000倍以上(出現(xiàn)10倍差距即為顯著性差異)，具有顯著差異，說明牛凝血酶可特異性洗脫表面展示BCMA-scFv的噬菌體，效果良好。

A:包被anti-Flag抗體通過ELISA確定該條件下最適酶切用量；B:包被anti-Flag抗體通過測試噬菌體滴度確定該條件下最適酶切用量；C:包被anti-Flag抗體通過ELISA檢測thrombin洗脫效果；D:包被anti-Flag抗體通過測試噬菌體滴度檢測thrombin洗脫效果。圖3 包被anti-flag抗體后，不同條件下檢測thrombin酶切的噬菌體滴度和OD450

2.4 通過模型篩選分析牛凝血酶特異性洗脫效果

將相同酶切位點(diǎn)的B7-H3-scFv基因與載體pComb3H連接到一起，載體和插入序列的條帶大小如圖4A所示，用得到的測序正確的pComb3H-B7-H3-scFv基因制備噬菌體。用鏈霉親和素酶標(biāo)板包被BCMA抗原，在B7-H3-scFv噬菌體溶液中混入梯度稀釋的BCMA-scFv噬菌體，并按照ELISA的檢測方法，每孔加入2 U單位的牛凝血酶洗脫特異性結(jié)合的噬菌體，收集的洗脫液感染XL1-Blue菌液，測定噬菌體的滴度，確定從混合噬菌體溶液中篩選出特異性結(jié)合BCMA的噬菌體的篩選輪數(shù)和效果。圖4B所示為在一輪模型篩選后，與對照組相比，從展示B7-H3-scFv的噬菌體混合物中富集展示BCMA-scFv噬菌體高達(dá)2 000倍。分別從3組篩選組中挑選單克隆測序，經(jīng)過序列的分析和對比后發(fā)現(xiàn)目標(biāo)BCMA-scFv出現(xiàn)比例分別為100%，83.3%，16.7%與篩選富集度相符(圖4C)。這些結(jié)果表明，在用于構(gòu)建噬菌體抗體庫的質(zhì)粒上添加thrombin酶切位點(diǎn)，篩選過程采用特異性洗脫的方法，可以增加目標(biāo)噬菌體的富集度，提高篩選目標(biāo)特異性抗體的效率。

A:模型篩選pComb3H-B7-H3-scFv質(zhì)粒構(gòu)建圖；B:不同混合比例下表面展示BCMA-scFv的目標(biāo)噬菌體富集度；C:不同混合比例下目標(biāo)BCMA-scFv比例。圖4 模型篩選分析牛凝血酶特異性洗脫的效果圖

3 討論

噬菌體展示技術(shù)自1985年被創(chuàng)建至今已日趨完善，2018年由于該技術(shù)在抗體藥物領(lǐng)域的貢獻(xiàn)，該技術(shù)的發(fā)明人被授予諾貝爾化學(xué)獎，更推動了噬菌體技術(shù)的發(fā)展。噬菌體篩選技術(shù)不僅能篩選出高親和力和特異性結(jié)合的單克隆抗體，也能篩選出不同形式的抗體，如scFv[13]，F(xiàn)ab[14]等，應(yīng)用價值極高。

各種不同的抗體基因所表達(dá)的多肽展示在噬菌體上，即可構(gòu)建為噬菌體抗體庫。若要在抗體庫中篩選出特異性結(jié)合強(qiáng)的抗體，要先選擇恰當(dāng)?shù)妮d體。本實(shí)驗(yàn)中使用噬菌粒載體，可避免融合蛋白的多價展示，實(shí)現(xiàn)更高的轉(zhuǎn)化效率[15]，主要包括3個關(guān)鍵要素(i)用于選擇和繁殖質(zhì)粒的抗生素標(biāo)記(ii)編碼scFv-G3P融合蛋白的基因(iii)滾環(huán)擴(kuò)增和產(chǎn)生能夠包裝成噬菌體的(+)DNA鏈所需的M13染色體區(qū)域(噬菌體復(fù)制起點(diǎn))。其次要選擇合適的篩選方法，并根據(jù)每一輪篩選的結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。利用該技術(shù)，可以快速獲得親和力高的抗體。但是，篩選所用的相應(yīng)抗原是細(xì)胞表面上抗原復(fù)合物或分子的一部分，包含不同的表位，噬菌體展示篩選通常僅產(chǎn)生針對抗原線性表位的抗體片段，為了富集和分離特異性抗體，通常需要多輪選擇。最高親和力結(jié)合的抗體片段或噬菌體在篩選過程中具有生長優(yōu)勢，因此，抗弱表位的抗體表位很少被選擇，會導(dǎo)致篩選輪次中潛在結(jié)合物的多樣性喪失，阻礙對親和力較低的抗體的選擇[16]。其次感染后，來自輔助噬菌體的野生型G3P蛋白與編碼scFv-G3P融合蛋白的噬菌粒競爭并入噬菌體，90%的噬菌體群體不顯示任何融合蛋白，并且?guī)в腥诤系鞍椎慕^大多數(shù)噬菌體顆粒僅包含一個拷貝[17]，這大大增加了篩選過程中非特異性結(jié)合的噬菌體數(shù)量，使得篩選輪次增加，篩選效率降低，難度加大。

因此，利用噬菌體展示技術(shù)如何快速高效并有效的篩選出目標(biāo)抗體是我們一直努力的目標(biāo)。在這里，我們提出了一種應(yīng)用于噬菌體抗體庫篩選的質(zhì)粒構(gòu)建新方法，目的是使噬菌體展示篩選效率提高，同時采用該質(zhì)粒建立1種模型篩選方法。在融合噬菌粒scFv-PIII間引入牛凝血酶(thrombin)酶切位點(diǎn)，通過蛋白水解裂解，從而導(dǎo)致非特異性洗脫噬菌體的背景下降。該方法的創(chuàng)新在于：1、相對于強(qiáng)酸強(qiáng)堿非特異性洗脫方式，該方法洗脫液更溫和、對大腸桿菌無害。雖然噬菌體在處于相當(dāng)極端的環(huán)境中后仍然具有感染性，但采用酸堿中和非特異性洗脫的方式，對于噬菌體感染能力仍有不確定影響，該方法能夠避免削弱噬菌體感染能力；2、降低每輪篩選過程中野生型噬菌體背景。牛凝血酶作用于scFv-PIII結(jié)合位點(diǎn)，不同于非特異性洗脫方式作用于抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)，野生型噬菌體依然結(jié)合于鏈霉親和素板，而洗脫液中含有篩選出的特異性噬菌體；3、構(gòu)建的噬菌體抗體庫模型篩選質(zhì)?？梢宰鳛閷?shí)施單鏈抗體體外親和力成熟模板，提高人源化單鏈抗體(scFv)親和力。同時，我們采用該質(zhì)粒建立1種模型篩選方法，目的是從表面展示抗B7-H3單鏈抗體的噬菌體混合物中高效篩選目標(biāo)噬菌體，減少篩選輪次僅一輪即可高效富集，得到目標(biāo)抗體，篩選方法優(yōu)越。新的抗體庫和篩選方法構(gòu)建成功后，可以以此為基礎(chǔ)高效篩選多種抗原的特異性抗體。