周婷婷，楊林，韓小強(qiáng)，田沁怡，陳閱新

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003)

新疆是我國(guó)乃至世界上最重要的棉花生產(chǎn)基地，棉花也是新疆經(jīng)濟(jì)發(fā)展的戰(zhàn)略核心。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年新疆棉花種植面積約250.19萬(wàn)hm2，棉花總產(chǎn)達(dá)到516.1萬(wàn)t，占全國(guó)棉花產(chǎn)量的87.33%[1]。然而，隨著對(duì)勞動(dòng)力需求的提升和勞動(dòng)力成本的增加，棉花價(jià)格優(yōu)勢(shì)逐漸縮減。因此，發(fā)展機(jī)采棉成為降低新疆植棉成本的主要舉措。隨著新疆棉區(qū)機(jī)采棉的大力推廣，棉花機(jī)械化收獲技術(shù)快速發(fā)展，棉花標(biāo)準(zhǔn)化和機(jī)械化生產(chǎn)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)效益十分顯著，有效的解決了新疆棉區(qū)勞動(dòng)力供需問(wèn)題，促進(jìn)了棉花發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施[2]。

棉花機(jī)械采收的前提是脫葉劑的使用，在棉花吐絮期使用化學(xué)脫葉劑，能夠使棉花葉片提前脫落，加快棉鈴成熟[3]。脫葉劑的合理使用能夠加速棉花葉片脫落，提高機(jī)采棉的采摘效率[4]。當(dāng)前新疆棉區(qū)普遍使用的脫葉劑為噻苯隆與敵草隆復(fù)配的制劑。噻苯隆屬于雜環(huán)芳香脲類化合物，影響棉花脫落酸、生長(zhǎng)素和乙烯三者之間的平衡，促進(jìn)棉花葉柄離層的形成，使棉花葉片提前脫落，避免采收時(shí)增加棉花雜質(zhì)[5]。敵草隆是一種除草劑，其與噻苯隆復(fù)配，能夠加快棉花葉片焦枯，提高低溫條件下脫葉效果[6]。然而，作為有機(jī)氯農(nóng)藥，敵草隆在土壤中半衰期大于300 d，并且具有較強(qiáng)的生物富集作用，會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重污染[7]。

棉花葉片的自然脫落是棉花植株體內(nèi)激素平衡發(fā)生變化的結(jié)果。在衰老的葉片中，乙烯和脫落酸含量增加，生長(zhǎng)素含量下降，使葉片離層兩端激素濃度梯度消失，從而對(duì)乙烯更加敏感，最終導(dǎo)致葉片脫落[8]。噴施脫葉劑后能夠促進(jìn)棉花內(nèi)源脫落酸和乙烯的生成，有利于棉花葉片脫落，并且脫葉效果與脫落酸含量呈正相關(guān)[9]。外源噴施乙烯或乙烯利也能促進(jìn)棉花脫葉，并且未展開的幼葉對(duì)乙烯更敏感[8]。XU等[10]研究發(fā)現(xiàn)噻苯隆和乙烯處理棉花后，促進(jìn)了葉片離層的形成，細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶(Cytokinin oxidase/dehydrogenase,CKXs)在棉花葉片離層中上調(diào)表達(dá)，細(xì)胞分裂素響應(yīng)抑制因子(Cytokinin response regulatory factors，ARRs)的表達(dá)量下降，且細(xì)胞分裂素和乙烯信號(hào)之間相互作用是調(diào)控棉花葉片脫落的關(guān)鍵。ARRs是細(xì)胞分裂素的負(fù)調(diào)控因子，影響細(xì)胞分裂素的合成。廖寶鵬等[11]研究發(fā)現(xiàn)在棉花不同部位主莖葉涂抹噻苯隆會(huì)使乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因和乙烯合成相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)。乙酰輔酶A合成酶(acetyl-CoA synthetase,ACS)是乙烯合成過(guò)程中重要的酶，直接參與乙烯合成，從而影響乙烯含量水平，調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和衰老[12]。乙烯受體基因?qū)ζ鞴倜撀溆兄匾淖饔茫⑶野l(fā)現(xiàn)乙烯利能夠促進(jìn)其表達(dá)[13]。DU等[14]研究發(fā)現(xiàn)植物毒素冠菌素也可用于棉花脫葉，并通過(guò)調(diào)解水解酶的活性和參與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)棉花脫葉。

萘酮戊酸(natenpac)是一類新型脫落酸類似物，具有更加簡(jiǎn)捷的合成路線和多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)活性，是一類對(duì)ABA受體PYLs具有很好選擇性的ABA類激動(dòng)劑(圖1)[15]。在前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)萘酮戊酸具有促進(jìn)棉花葉片脫落的作用[16]。因此，為了深入研究萘酮戊酸對(duì)棉花脫葉的的影響，開發(fā)環(huán)保型棉花脫葉劑，本研究以北疆機(jī)采棉主栽品種新陸早64為供試作物，采用萘酮戊酸單劑處理吐絮期棉花，以噻苯隆·敵草隆復(fù)配制劑(新疆棉區(qū)常規(guī)使用的脫葉劑)和清水處理作為對(duì)照，通過(guò)對(duì)脫葉率、內(nèi)源激素含量、離層形態(tài)學(xué)研究、葉柄斷裂強(qiáng)度和轉(zhuǎn)錄組等指標(biāo)的測(cè)定，研究萘酮戊酸對(duì)棉花脫葉的誘導(dǎo)，以探明萘酮戊酸對(duì)棉花脫葉的作用機(jī)制，為萘酮戊酸作為棉花脫葉劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

圖1 萘酮戊酸結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地基本概況

小區(qū)試驗(yàn)在新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第八師石河子市北泉鎮(zhèn)三分場(chǎng)二連(44°23′21″N，85°58′48″E)進(jìn)行。試驗(yàn)田采用中等水平施肥，前茬作物為棉花，已連續(xù)多年種植。供試棉花品種為新陸早64號(hào)；采用機(jī)采棉種植模式，一膜6行，行距66+10 cm，寬窄行常規(guī)播種模式；2019年4月15日播種，4月22日第1次進(jìn)水，并于7月8日打頂；種植密度約為19.5萬(wàn)株·hm-2，全生育期采用膜下滴灌。待棉花長(zhǎng)到吐絮期(吐絮率約40%)，使用背負(fù)式電動(dòng)噴霧器(3WBD-20，臺(tái)州市凱峰塑鋼有限公司)均勻噴施萘酮戊酸單劑(N)、噻苯隆·敵草隆復(fù)配制劑(TD, 文中簡(jiǎn)寫為噻苯·敵草隆)和清水(W)(表1)。小區(qū)采用隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)處理4個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積約為67 m2。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2 供試脫葉劑

1%萘酮戊酸可溶性粉劑(SP)，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)；360 g·L-1噻苯隆·180 g·L-1敵草隆懸浮劑(SC)，拜耳股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 棉花脫葉率的調(diào)查

每重復(fù)隨機(jī)選取3個(gè)采樣點(diǎn)，采樣點(diǎn)之間棉花長(zhǎng)勢(shì)、水肥、管理情況等一致，具有代表性。每點(diǎn)選取10株連續(xù)棉株進(jìn)行隨機(jī)標(biāo)記計(jì)數(shù)，調(diào)查同一標(biāo)記棉株上施藥前、施藥后1 d、3 d、6 d、9 d后的棉株葉片數(shù)，用公式計(jì)算棉花葉片脫落率。

(1)

1.3.2 棉花葉柄離層斷裂強(qiáng)度的測(cè)量

分別于施藥后1 d、3 d、6 d使用數(shù)顯式推拉力計(jì)(SF-100，艾普計(jì)量?jī)x器有限公司)測(cè)量棉花葉柄離層斷裂強(qiáng)度并記錄[14]。

1.3.3 棉株植物激素的測(cè)定

分別于施藥后1 d、2 d、3 d采取各處理的棉花葉柄樣品，采集好的樣品立即放入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室后放入-80 ℃冰箱(TSE4000V，賽默飛世爾科技有限公司)保存，根據(jù)PlantIAA、PlantCTK、PlantABA ELISA KIT(上海語(yǔ)純生物科技有限公司)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行植物激素含量測(cè)定。

1.3.4 葉柄離層形態(tài)學(xué)研究

棉花葉柄離層形態(tài)學(xué)研究采用XU等[10]的試驗(yàn)方法，略有改動(dòng)。分別于施藥前、施藥后1 d、3 d、6 d、9 d采集各處理的棉花葉柄，9 d采集的是棉株上未脫落的葉柄。

1.3.5 棉花葉柄轉(zhuǎn)錄組樣品處理

分別于施藥后1 d、2 d、3 d采取各處理的棉花葉柄樣品，采集好的樣品立即放入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室后放入-80 ℃冰箱保存，將27個(gè)樣品(3個(gè)處理，每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)1 d、2 d、3 d)送至Novogene進(jìn)行RNA測(cè)序(RNA-Seq)。在構(gòu)建文庫(kù)之前，在1%瓊脂糖凝膠上檢測(cè)RNA的完整性和是否存在DNA污染，再使用分光光度計(jì)初步檢測(cè)RNA濃度和純度，最后使用Agilent 2100(安捷倫科技有限公司)精確檢測(cè)RNA完整性。普通真核轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的構(gòu)建是采用磁珠富集方法，從檢測(cè)合格的樣品總RNA中純化出帶有polyA尾的mRNA，隨后將RNA打斷成250-300 bp的短片段，以片段化的RNA為反轉(zhuǎn)錄模板，使用隨機(jī)寡核苷酸為引物合成cDNA的第1條鏈，隨后在DNA polymerase體系下，以dNTPs為原料合成第2條鏈，對(duì)純化后的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，用AMpure XP beads篩選200 bp左右的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化PCR產(chǎn)物，最終獲得文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，先將文庫(kù)稀釋至1.5 ng·μL-1，再用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)符合預(yù)期的文庫(kù)使用qRT-PCR進(jìn)行濃度準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。文庫(kù)檢測(cè)合格后，在Illumina Hiseq平臺(tái)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，每端各測(cè)150 bp，最終獲得了150 bp～150 bp的成對(duì)末端讀數(shù)。所有的讀數(shù)都與棉花基因組比對(duì)(G.hirsutumTM-1)[17]。所鑒定基因的映射測(cè)序讀數(shù)用于基因表達(dá)分析，其基因表達(dá)水平是基于FPKM(每千堿基轉(zhuǎn)錄序列中每百萬(wàn)個(gè)堿基測(cè)序的預(yù)期片段數(shù))計(jì)算。使用DESeq-R軟件包進(jìn)行差異分析表達(dá)，校正后Padj<0.05的基因被認(rèn)為是顯著差異表達(dá)的基因。使用GOSeq-R軟件包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體(GO)富集分析，校正后的Padj<0.05的被認(rèn)為是顯著富集的。所有的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEG)通過(guò)KOBAS軟件進(jìn)行KEGG通路差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)富集。

1.3.6 差異基因?qū)崟r(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析

使用Novogene測(cè)序時(shí)所用的RNA；利用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMIX(天根生化科技(北京)有限公司)試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后使用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green) (天根生化科技(北京)有限公司)試劑盒和7500 Real Time PCR System(Life Technologies)系統(tǒng)對(duì)差異基因的表達(dá)量進(jìn)行qPCR測(cè)定。從RNA-Seq中選擇同源性較高的基因，使用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并通過(guò)生工生物工程股份有限公司合成引物，所用引物見表2，以GhUBQ7(DQ116441)為內(nèi)參基因計(jì)算表達(dá)并使其標(biāo)準(zhǔn)化[18]，將處理前的基因表達(dá)水平設(shè)為1，將標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)水平與空白對(duì)照進(jìn)行比較，獲得各基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用Origin 2018和SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)比較均值的One-Way ANOVA(單因素方差分析)方式，選擇LSD(Least-Significant Difference，最小顯著性差異法)，將置信區(qū)間設(shè)置為95%，當(dāng)代表顯著性的P<0.05時(shí)，表示兩組間存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 萘酮戊酸對(duì)棉花脫葉率和葉柄斷裂強(qiáng)度的影響

萘酮戊酸施藥后3 d、6 d、9 d的脫葉率均顯著高于空白對(duì)照，但低于噻苯·敵草隆處理(圖2A)。施藥后9 d，萘酮戊酸處理后的脫葉率達(dá)到35.46%，噻苯·敵草隆處理后的脫葉率為78.29%，均顯著優(yōu)于空白對(duì)照處理。葉柄斷裂強(qiáng)度與棉花葉片的脫落有著密切關(guān)系。萘酮戊酸、噻苯·敵草隆處理后的棉花葉柄的斷裂強(qiáng)度明顯低于空白對(duì)照處理(圖2B)。隨著處理時(shí)間的變化，噻苯·敵草隆處理后的棉花葉柄斷裂強(qiáng)度最小，其次是萘酮戊酸。施藥后1 d、3 d、6 d，萘酮戊酸處理后的葉柄斷裂強(qiáng)度分別為10.94 N、9.61 N、9.56 N，低于空白對(duì)照處理后的斷裂強(qiáng)度(13.26 N(1 d)、11.89 N(3 d)、11.28 N(6 d))，但是高于噻苯·敵草隆處理后的棉花葉柄斷裂強(qiáng)度(10.64 N(1 d)、6.07 N(3 d)、4.07 N(6 d))。由此可見，外源施用萘酮戊酸能夠顯著降低棉花葉柄的斷裂強(qiáng)度，有利于葉片的脫落，具有促進(jìn)棉花葉片脫落的功能，但脫葉效果弱于噻苯·敵草隆處理。

A：脫葉率；B：葉柄斷裂強(qiáng)度；柱狀圖上方不同字母則表示差異顯著(P<0.05)。圖2 萘酮戊酸對(duì)棉花斷裂強(qiáng)度和脫葉率的影響

2.2 萘酮戊酸對(duì)棉花葉柄植物激素含量和葉柄離層形態(tài)學(xué)的影響

萘酮戊酸和噻苯·敵草隆處理后棉花葉柄處植物激素含量變化見圖3。

萘酮戊酸處理后，棉花葉柄內(nèi)源脫落酸含量逐漸升高，顯著高于空白處理，其含量分別為10.74 ng·mL-1(1 d)、12.11 ng·mL-1(2 d)、12.34 ng·mL-1(3 d)，但低于噻苯·敵草隆處理后的脫落酸含量。各處理的棉花內(nèi)源生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素含量均逐漸降低，其中生長(zhǎng)素含量與空白對(duì)照相比差異不顯著，細(xì)胞分裂素含量顯著低于空白對(duì)照處理，其含量分別為8.16 ng·mL-1(1 d)、7.49 ng·mL-1(2 d)、7.26 ng·mL-1(3 d)，但高于噻苯·敵草隆處理后的細(xì)胞分裂素含量。這表明萘酮戊酸處理可以促進(jìn)脫落酸的生成，降低生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素含量，從而促進(jìn)離層的形成。

A：生長(zhǎng)素含量；B：細(xì)胞分裂素含量；C：脫落酸含量；柱狀圖上方不同字母則表示差異顯著(P<0.05)。圖3 萘酮戊酸對(duì)棉花葉柄內(nèi)源激素含量的影響

萘酮戊酸對(duì)棉花葉柄離層形態(tài)學(xué)的影響見圖4。萘酮戊酸處理后6 d，棉花葉柄處開始向內(nèi)凹陷，可觀察到離層的形成；而噻苯·敵草隆處理后3 d葉柄離層處開始向內(nèi)凹陷，在6 d時(shí)，離層處明顯斷裂，在9 d時(shí)斷裂程度愈加明顯；空白對(duì)照處理后9 d僅能觀察到棉花葉柄處輕微凹陷。這表明萘酮戊酸處理棉花后，可以加速葉片離層的形成，但效果弱于噻苯·敵草隆處理。

9 d采集的樣品為棉花上未脫落的葉柄，比例尺為200 μm。圖4 萘酮戊酸對(duì)棉花葉柄離層的影響

2.3 萘酮戊酸對(duì)棉花葉柄離區(qū)的轉(zhuǎn)錄組分析

萘酮戊酸處理后在棉花離層表達(dá)了8萬(wàn)多個(gè)基因，其中萘酮戊酸處理后檢測(cè)到6 352個(gè)差異基因，噻苯·敵草隆處理后檢測(cè)到26 446個(gè)差異基因。萘酮戊酸處理后，差異基因數(shù)量逐漸增加，但處理后的第2 d差異基因數(shù)量下降(圖5A)。噻苯·敵草隆處理后，差異基因數(shù)量每天逐漸增加，在第3 d時(shí)急劇增加(圖5B)。萘酮戊酸和空白對(duì)照相比，處理后1 d、2 d、3 d共表達(dá)40個(gè)差異基因，處理后1 d僅表達(dá)1 041個(gè)差異基因，處理后2 d僅表達(dá)244個(gè)差異基因，處理后3 d表達(dá)的差異基因數(shù)迅速增加到3 846個(gè)(圖5C)。噻苯·敵草隆處理與空白對(duì)照處理相比，處理后1 d、2 d、3 d共表達(dá)3 265個(gè)差異基因，處理后1 d表達(dá)1 134個(gè)差異基因，處理后2 d表達(dá)1 519個(gè)差異基因，處理后3 d表達(dá)的差異基因達(dá)到12 873個(gè)(圖5 D)。萘酮戊酸和噻苯·敵草隆相比，萘酮戊酸處理后，在1 d獨(dú)立表達(dá)278個(gè)差異基因，3 d獨(dú)立表達(dá)1 522個(gè)差異基因；噻苯·敵草隆處理后1 d獨(dú)立表達(dá)1 061個(gè)差異基因，3 d獨(dú)立表達(dá)15 406個(gè)差異基因(圖5E)。

A：萘酮戊酸處理后的差異表達(dá)基因數(shù)；B：噻苯·敵草隆處理后的差異表達(dá)基因數(shù)；C：萘酮戊酸處理后不同時(shí)間的差異基因數(shù)量韋恩圖；D：噻苯·敵草隆處理后不同時(shí)間的差異基因數(shù)量韋恩圖；E：萘酮戊酸處理與噻苯·敵草隆處理后1 d和3 d的差異表達(dá)基因數(shù)量交叉比較；N-1 d為萘酮戊酸處理后1 d；N-2 d為萘酮戊酸處理后2 d；N-3 d為萘酮戊酸處理后3 d；TD-1 d為噻苯·敵草隆處理后1 d；TD-2 d為噻苯·敵草隆處理后2 d；TD-3 d為噻苯·敵草隆處理后3 d；W-1 d為空白對(duì)照處理后1 d；W-2 d為空白對(duì)照處理后2 d；W-3 d為空白對(duì)照處理后3 d。圖5 棉花葉柄離層差異基因的變化

基因本體論(GO)分類主要用于識(shí)別脫葉過(guò)程中生物學(xué)過(guò)程較活躍的功能類別，一般包括3個(gè)主要部分：生物過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)。萘酮戊酸和噻苯·敵草隆相比，差異基因的生物過(guò)程相差較大。萘酮戊酸處理棉花后的GO主要富集在1 d和3 d(圖6)，在生物過(guò)程中靠前的是生物過(guò)程(biological process)和代謝過(guò)程(metabolic process)；富集到細(xì)胞組分的差異表達(dá)基因較少；在分子功能中靠前的是催化活性(catalytic activity)和結(jié)合(binding)功能。噻苯·敵草隆處理棉花后的GO主要富集在1 d和3 d(圖7)，生物過(guò)程中靠前的是生物過(guò)程(biological process)、代謝過(guò)程(metabolic process)、細(xì)胞代謝過(guò)程(cellular metabolic process)、有機(jī)物代謝過(guò)程(organic substance metabolic process)、初級(jí)代謝過(guò)程(primary metabolic process)；在細(xì)胞分類組分中靠前的是細(xì)胞(cell)和細(xì)胞組分(cell part)；在分子功能中靠前的是催化活性(catalytic activity)和氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)。

通過(guò)KEGG通路分析以探索對(duì)萘酮戊酸和噻苯·敵草隆有反應(yīng)的差異基因的生物學(xué)通路。萘酮戊酸和噻苯·敵草隆處理后的不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)了不同的KEGG通路，但兩者之間有些途徑是相似的，例如玉米素的生物合成(zeatin biosynthesis)、丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)、類黃酮生物合成(flavonoid biosynthesis)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction)、次生代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites) (圖8)。萘酮戊酸處理后的KEGG途徑3天均有表達(dá)，而噻苯·敵草隆處理后的KEGG通路只要集中在1 d和2 d，在3 d時(shí)有少數(shù)的KEGG通路。通過(guò)GO功能富集和KEGG通路分析，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和一些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于萘酮戊酸引起棉花脫葉有重要的作用。

N1為萘酮戊酸處理后1 d；N2為萘酮戊酸處理后2 d；N3為萘酮戊酸處理后3 d。圖6 萘酮戊酸處理棉花后的葉柄離區(qū)GO(基因本體論)富集

TD1為噻苯·敵草隆處理后1 d；TD2為噻苯·敵草隆處理后2 d；TD3為噻苯·敵草隆處理后3 d。圖7 噻苯·敵草隆處理棉花后的葉柄離區(qū)GO(基因本體論)富集

N1為萘酮戊酸處理后1 d；N2為萘酮戊酸處理后2 d；N3為萘酮戊酸處理后3 d；TD1為噻苯·敵草隆處理后1 d；TD2為噻苯·敵草隆處理后2 d；TD3為噻苯·敵草隆處理后3 d。圖8 KEGG途徑分析

2.4 細(xì)胞分裂素和乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與脫葉

KEGG通路分析表明，幾個(gè)細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶(CKX)基因可能在萘酮戊酸和噻苯·敵草隆處理棉花后在脫葉中有著重要的作用。通過(guò)qRT-PCR顯示，4個(gè)GhCKX基因均差異表達(dá)，并且隨著時(shí)間的推移其表達(dá)逐漸上調(diào)，其中萘酮戊酸處理后3 d的基因表達(dá)倍數(shù)均在1.3以上，噻苯·敵草隆處理后3 d的基因表達(dá)倍數(shù)在2.3 以上，GhCKXs基因表達(dá)均上調(diào)(圖9)，相應(yīng)的細(xì)胞分裂素含量水平降低。細(xì)胞分裂素反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(ARRs)主要參與細(xì)胞分裂素在植物體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，qRT-PCR結(jié)果顯示，ARRs表達(dá)呈下降趨勢(shì)，在3 d時(shí)，萘酮戊酸處理后的基因表達(dá)倍數(shù)均在1.0以下，噻苯·敵草隆處理后的基因表達(dá)倍數(shù)均在0.4以下，噻苯·敵草隆處理后的基因表達(dá)量高于萘酮戊酸處理，不同處理之間相對(duì)表達(dá)量有所差異，但表達(dá)趨勢(shì)一致。以上結(jié)果表明，萘酮戊酸和噻苯·敵草隆處理后促進(jìn)細(xì)胞分裂素降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞分裂素含量水平降低，這一研究結(jié)果與XU等的研究結(jié)果相似[10]。

A：GhCKXs和ARRs對(duì)應(yīng)于RNA-Seq數(shù)據(jù)的表達(dá)模式；B—E：CKXs基因相對(duì)表達(dá)量；F—H：ARRS基因相對(duì)表達(dá)量。圖9 棉花葉柄離層GhCKXs和ARRs的表達(dá)驗(yàn)證

A：乙烯相關(guān)基因?qū)?yīng)于RNA-Seq數(shù)據(jù)的表達(dá)模式；B：EIN3基因相對(duì)表達(dá)量；C：EIN4基因相對(duì)表達(dá)量；D：ACO3基因相對(duì)表達(dá)量；E：ACS基因相對(duì)表達(dá)量；F：ERF2基因相對(duì)表達(dá)量；G：ETR1基因相對(duì)表達(dá)量。圖10 棉花葉柄離層乙烯相關(guān)基因的表達(dá)驗(yàn)證

萘酮戊酸和噻苯·敵草隆處理后，乙烯合成關(guān)鍵基因、乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、乙烯傳感基因均差異表達(dá)(圖10)。通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，萘酮戊酸和噻苯·敵草隆處理后，ACC氧化酶(ACO3)和ACS表達(dá)上調(diào)，其中萘酮戊酸處理后3 d的基因表達(dá)倍數(shù)到達(dá)1.3以上，噻苯·敵草隆處理后的基因表達(dá)倍數(shù)在2.2以上；萘酮戊酸處理后乙烯受體基因(EIN3、EIN4)和一些乙烯響應(yīng)基因(ETR1、ERF2)的表達(dá)不斷上調(diào)，表達(dá)倍數(shù)均在1.3以上，噻苯·敵草隆處理后基因表達(dá)倍數(shù)在2.2以上。這表明萘酮戊酸處理后增強(qiáng)了乙烯信號(hào)在棉花體內(nèi)的傳導(dǎo)，從而誘導(dǎo)脫葉。

2.5 赤霉素和茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與脫葉

赤霉素受體GIDs是一種可溶性蛋白，在植物中與GAs結(jié)合并將信號(hào)傳遞。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示萘酮戊酸處理后3 dGID1-1和GID1-2基因表達(dá)倍數(shù)均在1.8左右(圖11)，高于噻苯·敵草隆處理(基因表達(dá)倍數(shù)均在1.3左右)。JAZs(茉莉酸響應(yīng)因子)是茉莉酸信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)JAZ10上調(diào)表達(dá)，其中噻苯·敵草隆處理后基因表達(dá)倍數(shù)為3.1，明顯高于萘酮戊酸處理(基因表達(dá)倍數(shù)為1.9)；這可能與下游轉(zhuǎn)錄因子MYC2結(jié)合共同激活茉莉酸下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。結(jié)果表明，萘酮戊酸處理后可能激活下游泛素介導(dǎo)的蛋白水解，從而調(diào)控細(xì)胞周期，誘導(dǎo)葉片衰老。

A：茉莉酸和赤霉素相關(guān)基因?qū)?yīng)于RNA-Seq數(shù)據(jù)的表達(dá)模式；B：GID1-1基因相對(duì)表達(dá)量；C：GID1-2基因相對(duì)表達(dá)量；D：JAZ10基因相對(duì)表達(dá)量。圖11 棉花葉柄離層赤霉素和茉莉酸相關(guān)基因的表達(dá)驗(yàn)證

3 討論與結(jié)論

研究表明，噴施脫葉劑后能夠促進(jìn)棉花葉片乙烯和脫落酸的生成，促進(jìn)棉花葉柄離層形成[19]。萘酮戊酸處理能夠顯著降低棉花葉柄斷裂強(qiáng)度，提高棉花脫葉率，并促進(jìn)葉柄離層形成和葉柄內(nèi)源脫落酸的生成，降低細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素含量，但是效果略差于噻苯·敵草隆處理。高麗麗等[9]研究發(fā)現(xiàn)噻苯隆能夠加速開啟棉花葉片的衰老程序，施藥后棉花葉片內(nèi)源脫落酸含量上升，生長(zhǎng)素則逐漸降低。

植物激素及其類似物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用越來(lái)越重要。冠菌素(coronatine, COR)是一種引起黃化病的非寄主特異性植物毒素，是茉莉酸的結(jié)構(gòu)類似物，在某些作物中引起葉片和/或果實(shí)脫落。DU等[14]研究發(fā)現(xiàn)冠菌素能夠降低棉花葉柄斷裂強(qiáng)度，促進(jìn)棉花葉片的脫落，且具有不同于噻苯隆調(diào)節(jié)棉花脫葉的作用方式。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，萘酮戊酸處理后檢測(cè)到6 352個(gè)差異表達(dá)基因，且大多數(shù)基因與“代謝過(guò)程”、“生物過(guò)程” “植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”和“次生代謝產(chǎn)物的生物合成”相關(guān)。

GAN等和MOYOYUKI等研究發(fā)現(xiàn)CKXs基因是一種將細(xì)胞分裂素降解成非活性產(chǎn)物的酶，并且使細(xì)胞分裂素失去活性，從而降低植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量[20-21]。萘酮戊酸處理棉花后CKXs上調(diào)表達(dá)，細(xì)胞分裂素含量降低，同時(shí)ARRs下調(diào)表達(dá)。這一研究結(jié)果與XU等[10]的研究結(jié)果相似，使用脫葉劑后降解細(xì)胞分裂素，并且使細(xì)胞分裂素失去活性。廖寶鵬等[11]研究發(fā)現(xiàn)在棉花不同部位主莖葉涂抹噻苯隆會(huì)使乙烯合成相關(guān)基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)。劉長(zhǎng)英等[13]發(fā)現(xiàn)乙烯利可以促進(jìn)EINs的表達(dá)，在成熟果實(shí)中表達(dá)量高于未成熟的幼果。也有研究發(fā)現(xiàn)乙烯合成抑制劑可以延遲番茄葉柄的脫落，乙烯受體基因ETR1和ETR2對(duì)器官脫落有著重要的作用[22]。ACO3是乙烯合成關(guān)鍵基因，萘酮戊酸處理后棉花葉柄中乙烯合成相關(guān)基因以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)乙烯的合成以及在植株體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外一些赤霉素相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)，茉莉酸相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)。孫凱文[23]研究發(fā)現(xiàn)外源脫落酸處理擬南芥后JAZ1上調(diào)表達(dá)，本研究中萘酮戊酸處理后JAZ10上調(diào)表達(dá)。

綜上所述，外源使用萘酮戊酸能夠明顯促進(jìn)棉花葉柄離層的形成，降低葉柄斷裂強(qiáng)度，從而促進(jìn)棉花脫葉，提高棉花的脫葉率，且在激素信號(hào)調(diào)控上具有與新疆棉區(qū)常規(guī)使用的噻苯·敵草隆相似的機(jī)理。雖然萘酮戊酸具有促進(jìn)棉花脫葉的效果，但在各項(xiàng)指標(biāo)上均弱于噻苯·敵草隆復(fù)配制劑。這表明萘酮戊酸在棉花脫葉上的使用，還需要深入研究其與其他脫葉劑產(chǎn)品的復(fù)配篩選及相關(guān)機(jī)理。