劉苗苗，劉輝輝，賀麗亞，彭麗麗，崔玉潔，王 霞，張洪珍

(1. 河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051；2. 河北省血液中心，河北 石家莊 050004)

宮頸癌是女性常見的癌種之一，人乳頭瘤病毒感染與其發(fā)生有關，機制可能與T細胞對人乳頭瘤病毒感染的抑制作用降低有關[1]。雖然人乳頭瘤病毒疫苗已在宮頸癌預防方面獲得了一定的成效，但宮頸癌的發(fā)病率及病死率仍呈上升趨勢。手術是治療早期宮頸癌的主要方法，但仍有很大比例的患者會發(fā)生局部或遠處復發(fā)，對于晚期宮頸癌患者主要采用放療和化療，這些治療方法收效甚微。免疫檢查點抑制劑是宮頸癌的潛在治療藥物，其中程序性死亡受體1(programmed death 1,PD-1)抑制劑中的Pembrolizumab已經(jīng)FDA批準用于宮頸癌的治療[2]，其他免疫檢查點抑制劑正在進行多項臨床試驗中。若發(fā)現(xiàn)T細胞上額外的免疫抑制受體，將會為宮頸癌患者的治療帶來更多的選擇。T細胞免疫球蛋白黏液素3(T-cell immunoglobulin mucin-3,TIM-3)作為T細胞上的抑制性受體于2002年首次被發(fā)現(xiàn)，其是一類表達于活化的T細胞表面的抑制性分子,能引起癌癥感染過程中T細胞的衰竭[3]。而PD-1是早期發(fā)現(xiàn)的耗竭T細胞的標志物，兩者共表達抑制T細胞分泌干擾素-γ(IFN-γ)的能力更強，兩者在腫瘤微環(huán)境中免疫抑制環(huán)境的形成中起著重要的作用[4]。目前研究認為，抗PD-1免疫治療發(fā)生耐藥的原因是發(fā)生免疫逃逸，主要機制可能是選擇性激活了TIM-3，因此TIM-3抑制劑的出現(xiàn)是PD-1抑制劑出現(xiàn)耐藥后患者治療的重要補充[5]。本研究探討了PD-1、TIM-3在宮頸癌組織中的表達情況及二者之間和患者臨床病理特征的關系，旨在進一步明確PD-1、TIM-3在宮頸癌發(fā)病中的作用，為免疫檢查點抑制劑在宮頸癌中的合理應用提供證據(jù)支持。

習近平總書記指出,我國生態(tài)環(huán)境質(zhì)量持續(xù)好轉(zhuǎn),出現(xiàn)了穩(wěn)中向好態(tài)勢,但成效并不穩(wěn)固。經(jīng)濟新常態(tài)(增速上的放緩)某種程度上為環(huán)保工作創(chuàng)造了重要的“窗口期”;市場出現(xiàn)飽和(產(chǎn)能過剩)為我們在環(huán)境保護上提出較高要求和標準創(chuàng)造了條件;財力增長、技術進步和經(jīng)驗積累使我們有能力和條件解決生態(tài)環(huán)境問題。[注]莊貴陽、薄凡:《厚植生態(tài)文明 耕耘美麗中國——“形勢與政策”專題講稿》,《時事報告·大學生版》(增刊),2018年8月,第86-99頁。

1 資料與方法

1.1納入標準 經(jīng)病理診斷明確的初治宮頸癌患者；經(jīng)腔鏡下廣泛性子宮切除術+雙側(cè)附件切除+盆腔、腹主動脈旁淋巴結(jié)切除術的手術治療者，且未接受術前新輔助放化療；臨床分期Ⅰ～ⅡA1期；治療前均已完善血液學指標檢查、影像評估，臨床資料完整；可隨訪到患者無進展生存期、總生存期。

1.2排除標準 病理診斷不明確或合并其他腫瘤者；非人乳頭瘤病毒感染患者；采用其他術式治療者；有甲亢、糖尿病、心臟病及類風濕免疫性疾病等重大疾病者。

1.3一般資料 收集2016年1月1日—6月30日在河北省人民醫(yī)院初治的45例早期宮頸癌患者術后病理標本及臨床資料，根據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織(WHO)子宮頸腫瘤組織學分類進行病理學診斷，根據(jù)2015年FIGO分期進行腫瘤分期。治療結(jié)束后通過門診復查、電話或短信隨訪等形式進行隨訪，隨訪內(nèi)容包括患者的一般情況及復發(fā)進展狀況、生存結(jié)局等，隨訪截止時間為2020年4月1日。無病生存時間定義為從患者接受治療至腫瘤復發(fā)的時間，隨訪生存時間定義為患者從治療開始到死亡或最后一次隨訪的時間。本研究已通過河北省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核[(2019)科研倫審第(33)號]。

2.4影響患者預后的單因素分析 單因素分析顯示患者的腫瘤分化程度、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PD-1和TIM-3陽性表達情況與患者的無病生存期有明顯相關性(P均<0.05)，患者的年齡、腫瘤分化程度、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PD-1和TIM-3陽性表達情況與患者的隨訪生存時間有明顯相關性(P均<0.05)。見表2。

就業(yè)關系到國計民生，直接影響社會穩(wěn)定。中國由于經(jīng)濟結(jié)構調(diào)整，面臨較大的就業(yè)壓力。而旅游業(yè)是一個勞動密集型產(chǎn)業(yè)，在緩解就業(yè)壓力方面起著重要作用。在旅游就業(yè)中，由于旅游非正規(guī)就業(yè)對教育和技能水平的要求不高，因此在吸收城鎮(zhèn)失業(yè)人口和農(nóng)村剩余勞動力方面發(fā)揮著重要的作用，而在旅游非正規(guī)就業(yè)中，存在著一種規(guī)模較大但又經(jīng)常被人們忽視的就業(yè)類型——自我就業(yè)。

1.5宮頸癌組織中PD-1和TIM-3表達檢測

2.5COX風險比例回歸模型多因素分析 對單因素分析有統(tǒng)計學意義的指標進行多因素分析，顯示分化程度是患者無病生存期和隨訪生存時間的獨立影響因素(P=0.029，P=0.047)，是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PD-1和TIM-3是否陽性與患者的無病生存期和隨訪生存時間均無明顯相關性(P均>0.05)。見表3及表4。

1.5.2檢測方法 宮頸癌組織標本均4 μm厚連續(xù)切片，按常規(guī)方法融蠟、脫蠟、水化，枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復，自然冷卻至室溫，用PBS洗片3 min×3次；將切片浸于3%H2O2中，37 ℃孵育20 min，避光保存，PBS洗片3次，各5 min；一抗孵育：在切片中分別加入稀釋好的鼠抗人PD-1單克隆抗體(1∶100)、兔抗人TIM-3多克隆抗體(1∶100)，置于4 ℃冰箱過夜；二抗孵育：切片從冰箱取出，室溫放置60 min，PBS洗片5 min×3次，加入二抗(被生物素標記)，37 ℃孵育30 min；再次用PBS清洗切片5 min×3次，加適量DAB配液，根據(jù)顯色程度，適時用蒸餾水阻斷顯色；蘇木精復染；再脫水，滴適量中性樹膠在切片上，輕壓蓋玻片，排出氣泡。每張切片隨機挑選5個高倍鏡視野(×400)觀察細胞染色情況。

2.2不同TIM-3組和PD-1組患者臨床病理特征間的關系 TIM-3陽性組和TIM-3陰性組比較、PD-1陽性組與PD-1陰性組比較，腫瘤分化程度、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，年齡、是否絕經(jīng)、病理類型、人乳頭瘤病毒感染類型、臨床分期、體質(zhì)指數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。不同組間患者臨床病理特征的比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，使用Graphpad 8.0.2繪制生存率曲線，采用log-rank檢驗進行預后單因素分析,采用COX風險比例回歸模型進行預后多因素分析，相關性分析應用Pearson檢驗。取α=0.05為檢驗水準，雙側(cè)P值，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1PD-1、TIM-3在宮頸癌組織中的表達情況宮頸癌組織中PD-1蛋白陽性表達率為73.3%(33/45),TIM-3蛋白陽性表達率為64.4%(29/45)。PD-1陽性表達主要定位于宮頸癌細胞和間質(zhì)淋巴細胞的細胞質(zhì)和細胞膜；在鱗狀細胞癌和腺癌中的表達位置并不完全一致,PD-1蛋白主要表達于腺癌腫瘤細胞膜, 而在鱗狀細胞癌中表達于腫瘤細胞胞質(zhì)和胞核。TIM-3蛋白主要表達于宮頸癌細胞的胞質(zhì)中，表現(xiàn)為棕褐色著色，少數(shù)細胞胞核也可見著色。見圖1。

1.4研究方法 采集患者的一般資料，主要包括年齡(年齡分組以患者的年齡的平均值為界)、體質(zhì)指數(shù)(體質(zhì)指數(shù)<18 kg/m2為體重過低，18 kg/m2≤體質(zhì)指數(shù)<24 kg/m2為體重正常，24 kg/m2≤體質(zhì)指數(shù)<28 kg/m2為超重，體質(zhì)指數(shù)≥28 kg/m2為肥胖)、病理類型、分化程度、臨床分期、人乳頭瘤病毒感染情況、絕經(jīng)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。采用免疫組織化學法檢測宮頸癌組織樣本中PD-1和TIM-3的表達情況，按照PD-1和TIM-3表達情況分為PD-1陽性組、PD-1陰性組、TIM-3陽性組、TIM-3陰性組，比較各組臨床病理特征及隨訪1～4年的生存率，對預后影響因素進行單因素和多因素分析，對PD-1和TIM-3的關系及各因素與二者的關系進行相關性分析。

1.5.3陽性判定標準 PD-1判定標準:參考Meng等[6]研究進行陽性結(jié)果的判定，細胞染色強度分為4個等級：細胞周圍、邊緣或其中有大量著色(強陽性)得分為3分； 細胞周圍、邊緣或其中中等著色(中度陽性)得分為2分；細胞周圍、邊緣或其中少量著色(弱陽性)得分為1分；細胞周圍、邊緣或其中沒有著色，或者只是腫瘤細胞自身被染色(陰性)得分為0分。陽性細胞率=陰性區(qū)域的百分比×0+弱陽性區(qū)域的百分比×1+中度陽性區(qū)域的百分比×2+強陽性區(qū)域的百分比×3。TIM-3判定標準:參考Cao等[7]研究進行陽性結(jié)果的判定，以染色強度結(jié)合染色陽性細胞數(shù)所占百分比進行綜合評分。細胞染色強度分為無色(0)、弱(1)、中(2)、強(3)4個等級，陽性細胞所占的百分比稱為表達分數(shù)。表達分數(shù)與強度得分相乘即為綜合評分，評分范圍0～3分，0～1分為TIM-3陰性表達，否則為陽性表達。以上所有結(jié)果均由2位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師在雙盲的情況下統(tǒng)計所得。

圖1 PD-1和TIM-3在宮頸癌組織中陽性表達情況(免疫組化染色，×400)

2.6PD-1和TIM-3的相關性及各因素與二者的相關性 PD-1和TIM-3表達呈正相關(r=0.497，P=0.001)；PD-1和TIM-3與腫瘤分化程度均呈正相關(r=0.400，P=0.006；r=0.396，P=0.007)，與是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈負相關(r=-0.312，P=0.037；r=-0.035，P=0.017)。見表5。

在城市水環(huán)境的治理工作中，基礎內(nèi)容為在源頭進行合理的治理，確保河流源頭的污染源被有效控制，從而確保源頭水資源的質(zhì)量。在河流源頭的污染等問題得到控制后，城市河流的凈化功能與基礎處理功能等會逐漸恢復，不會繼續(xù)影響河流的水環(huán)境，而河流生態(tài)結(jié)構的破壞因素也能得到有效控制。在源頭治理工作中，主要工作內(nèi)容為控制水體污染負荷及濃度，確保匯往城市河流的水的各項指標符合相關標準。

為了更直觀的看出地殼的變化，結(jié)合前人的研究結(jié)果，繪制了研究區(qū)域的等值線圖。由圖8可見，處于青藏高原的東南端以及云貴高原處川西和云南地區(qū)的地殼厚度較大，并且自西向東逐漸減小，到了四川盆地處以及重慶榮昌地區(qū)接近于最小值，再向東延伸，地殼厚度又開始有所增大[15]。

1.5.1主要儀器和試劑 烤箱、金屬架、微量加樣器、濕盒、計時器、攪拌器、灰盒、通風廚、冰箱、電磁爐、EP管、高壓鍋、蓋玻片、滴管、電子顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)、全自動數(shù)字切片掃描儀均來源于河北省人民醫(yī)院病理科。 兔抗人TIM-3多克隆抗體(英國ABcam公司),鼠抗人PD-1單克隆抗體(英國ABcam公司),免疫組化SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司),DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司),枸櫞酸緩沖液(北京中杉金橋生物技術有限公司，pH值6.0)，封閉血清(北京中杉金橋生物技術有限公司)，二甲苯、中性樹膠、梯度乙醇、3%過氧化氫(H2O2)、蒸餾水、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、蘇木精、氨水、鹽酸(HCl)。

2.3不同PD-1組和TIM-3組患者預后比較本研究45例宮頸癌患者中位無病生存期為36個月，中位隨訪生存時間為46個月。PD-1陰性組與PD-1陽性組的無病生存期的1年、2年、3年、4年的生存率分別為100%，100%，91.67%，66.67%和100%，81.82%，42.42%，21.21%；PD-1陰性組與陽性組的4年隨訪生存時間的生存率分別為100%，100%，100%，66.67%和100%，100%，87.88%，27.27%。通過log-rank檢驗，PD-1陰性組的中位無病生存期、中位隨訪生存時間均明顯長于PD-1陽性組(P=0.048 4，P=0.045 0)；TIM-3陰性組與TIM-3陽性組的無病生存期的1年、2年、3年、4年的生存率分別為100%，100%，87.5%，50%和96.55%，79.31%，34.03%，24.14%；TIM-3陰性組與陽性組的4年隨訪生存時間的生存率分別為100%，100%，100%，62.5%和100%，100%，86.21%，24.14%。通過log-rank檢驗，TIM-3陰性組的中位無病生存期、中位的隨訪生存時間均明顯長于TIM-3陽性組(P=0.016 0，P=0.016 6)。生存率曲線見圖2。

3 討 論

目前研究發(fā)現(xiàn)，PD-1在非小細胞肺癌、腎癌和乳腺癌等在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均有高表達，且其表達量與存活率呈負相關[8-10]。TIM-3作為一種新的免疫檢查點受體, 它在腫瘤干細胞和骨髓細胞中可誘導T細胞衰竭并抑制抗腫瘤的免疫作用[11]。T細胞能對病毒和癌細胞進行識別和清除，但若被持續(xù)的抗原刺激和在腫瘤微環(huán)境中釋放的免疫抑制介質(zhì)破壞，導致T細胞處于一種功能失調(diào)的狀態(tài)，稱為T細胞耗竭，這種狀態(tài)將無法抑制病毒或癌癥[12-13]。Kuai等[14]研究報道，PD-1和TIM-3是重要的免疫抑制因子，在腫瘤免疫逃逸和癌癥進展中發(fā)揮著重要作用，影響多種腫瘤患者的預后。

選取最優(yōu)的CNN模型與傳統(tǒng)模型評測結(jié)果繪制P-R曲線和ROC曲線，其中圖8為各模型P-R曲線對比圖，圖9為各模型ROC曲線對比圖。

表1 不同TIM-3組和PD-1組宮頸癌患者臨床病理特征的關系 例

圖2 不同PD-1組和TIM-3組宮頸癌患者無病生存期、隨訪生存時間曲線

表2 45例宮頸癌患者無病生存期、隨訪生存時間單因素分析

表3 45例宮頸癌患者無病生存期的多因素分析

表4 45例宮頸癌患者隨訪生存時間的多因素分析

表5 45例宮頸癌患者臨床病理特征各因素與PD-1和TIM-3的相關性

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中PD-1蛋白陽性表達率為73.3% , TIM-3蛋白陽性表達率為64.4%，證實早期宮頸癌患者多數(shù)存在PD-1和TIM-3表達；且PD-1和TIM-3表達與腫瘤的分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關性，分化程度越低，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則PD-1和TIM-3陽性的可能性越大。結(jié)果與文獻[7,15-16]研究結(jié)果相似。通過生存曲線發(fā)現(xiàn), PD-1和TIM-3陽性患者預示著較差的疾病轉(zhuǎn)歸，更容易出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移；相關性分析顯示，PD-1和TIM-3的表達呈正相關，PD-1和TIM-3與腫瘤分化程度均呈正相關，與是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈負相關，提示二者表達水平可能有助于判斷宮頸癌的發(fā)生發(fā)展情況，且TIM-3似乎比PD-1可更好地預測宮頸癌患者的預后，可能為宮頸癌的腫瘤免疫治療提供新的思路和靶點。但本研究樣本量較小，可能存在選擇偏倚；隨訪時間相對較短，大多數(shù)患者尚未到達最終總生存期時間；僅采用免疫組化方法檢測宮頸癌組織中PD-1和TIM-3的表達情況。故有待擴大樣本量，采用不同方法鑒定宮頸癌組織中PD-1和TIM-3表達的細胞位置等深入研究。

從模型來看，地方感的3個維度之間呈顯著正相關，具有較強的相互影響，且對身份認同與融合的作用存在差異。地方依戀和地方認同對身份認同與融合的直接貢獻為正，而地方滿意度對身份認同與融合的直接影響為負。

綜上，早期宮頸癌患者PD-1和TIM-3陽性表達率較高，二者表達上調(diào)可能預示著易發(fā)生復發(fā)轉(zhuǎn)移和可能較差的生存結(jié)局；在未來，TIM-3抑制劑對宮頸癌免疫治療方面或許能占據(jù)不可或缺的地位。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。