蔣烈浩，許世瑩，錢晨宏，譚 卓，周 政，鄭國(guó)灣，葛明華,王佳峰

(1. 浙江省人民醫(yī)院(杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院)，浙江 杭州 310014；2. 浙江省內(nèi)分泌腺體疾病診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310014；3. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；4. 蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生院，安徽 蚌埠 233030)

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)又稱為唾液腺腺樣囊性癌，是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，早期以無(wú)痛性腫塊多見,具有生長(zhǎng)緩慢、嗜神經(jīng)侵襲性較強(qiáng)、易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[1]。SACC早期治療以手術(shù)切除為主，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者預(yù)后較差，因此中晚期和復(fù)發(fā)患者以放化療、靶向治療配以中藥調(diào)節(jié)免疫力的綜合治療為主。姜黃素是從姜黃中提取的一種多酚物質(zhì)，其可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[2-3]。目前姜黃素對(duì)SACC細(xì)胞的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制仍未十分明確，因此本研究以人源涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移株SACC-LM細(xì)胞株為研究對(duì)象，初步觀察了姜黃素對(duì)SACC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響，并從JAK-STAT3信號(hào)通路角度探討了其相關(guān)作用機(jī)制，以期為姜黃素用于SACC的治療提供新的方向和思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1細(xì)胞株和藥物 人源涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移株SACC-LM(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院李盛林教授惠贈(zèng))；姜黃素(中國(guó)Sigma-Aldrich公司，C1386)。

1.2試劑及儀器 胎牛血清(Fetal Bovine Serum/FBS，Sera&Pro公司，S601P-500)；RPMI-1640 Medium (with Penicillin-Streptomycin)(Biochannel，BC-M-016-500ml)；CCK-8試劑盒(中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所,C0037)；RIPA蛋白裂解液(中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所,P0013B)；PMSF (中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所,ST506)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所,P0010S)；SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5×，還原型，中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所，P0015L)；一抗STAT3(英國(guó)Abcam公司，ab68153)，TIMP1(英國(guó)Abcam公司，ab211926)，SNAIL(英國(guó)Abcam公司，ab216347)，CyclinD1(英國(guó)Abcam公司，ab16663)，MMP-9(英國(guó)Abcam公司，ab76003)，MMP-2(英國(guó)Abcam公司，ab92536)，二抗羊抗兔IgG(英國(guó)Abcam公司，ab6721)，二抗羊抗鼠IgG(英國(guó)Abcam公司，ab6789)；AURAGENE ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(中國(guó)長(zhǎng)沙艾佳生物公司，P001WB)；膜聯(lián)蛋白 V/藻紅蛋白(Annexin V-PE)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào) C1065S)；蛋白電泳分子量300marker(美國(guó)Thermo公司，26634)、170marker(美國(guó)Thermo公司，26616)；Thermo scientific protein ladders(美國(guó)Thermo公司，26617)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)安捷倫，Agilent Technologies)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)，Bio-Rad)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 用RPMI-1640+10%FBS+10%胎牛血清+1%雙抗培養(yǎng)SACC-LM細(xì)胞株，置于37 ℃恒溫恒濕、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)到約90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以1∶2的比例進(jìn)行傳代。

1.3.2細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SACC-LM細(xì)胞接種于96孔板中，每孔3 000個(gè)細(xì)胞，在接種12 h細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將細(xì)胞暴露于含姜黃素濃度分別為0 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L的培養(yǎng)基中，每個(gè)樣本濃度6個(gè)復(fù)孔。處理72 h后，吸除原培養(yǎng)基，細(xì)胞中加100 μL含10%CCK-8的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱靜置2 h。利用紫外分光光度計(jì)于450 nm處檢測(cè)細(xì)胞吸光度，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)倍數(shù)。因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)在25 μmol/L濃度時(shí)發(fā)生了斷崖式下跌，因此為了更加精確摸索姜黃素的適宜濃度，觀察了姜黃素0μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L處理72 h后的細(xì)胞形態(tài)。同樣方法檢測(cè)SACC-LM細(xì)胞暴露于含姜黃素濃度分別為0 μmol/L、10 μmol/L的培養(yǎng)基中24 h、48 h、72 h、96 h的吸光度，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)倍數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.3細(xì)胞侵襲能力Transwell檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為姜黃素0μmol/L組、姜黃素1μmol/L組、姜黃素5 μmol/L組、姜黃素10 μmol/L組，各組分別用相應(yīng)濃度的姜黃素培養(yǎng)液處理SACC-LM細(xì)胞72 h，用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，按50 個(gè)/μL濃度稀釋，接種到鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室內(nèi)，每個(gè)小室加500 μL細(xì)胞懸液，下層的24孔板中加入750 μL含10%FBS的1640培養(yǎng)液，每組3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；然后用無(wú)菌棉簽輕輕擦去Matrigel基質(zhì)膠和上室未侵襲的細(xì)胞，用0.5%結(jié)晶紫對(duì)侵襲細(xì)胞染色，于顯微鏡下計(jì)數(shù)每組侵襲的細(xì)胞，并拍照。

1.3.4細(xì)胞遷移能力劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為姜黃素0μmol/L組、姜黃素1μmol/L組、姜黃素5 μmol/L組、姜黃素10 μmol/L組，各組分別用相應(yīng)濃度的姜黃素培養(yǎng)液處理SACC-LM細(xì)胞72 h后，將細(xì)胞以80萬(wàn)個(gè)/孔接種于6孔板，每組3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后用10 μL槍頭垂直于培養(yǎng)板背面的直線做劃痕處理，棄去培養(yǎng)基后，用PBS洗去被劃下的細(xì)胞，記錄劃痕寬度，并加入無(wú)血清1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔12 h同一位置連續(xù)拍照記錄各組細(xì)胞劃痕寬度，計(jì)算單位長(zhǎng)度內(nèi)跨過(guò)劃痕線的細(xì)胞數(shù)目。

1.3.5細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為姜黃素0 μmol/L組、姜黃素1 μmol/L組、姜黃素5 μmol/L組、姜黃素10 μmol/L組，各組分別用相應(yīng)濃度的姜黃素培養(yǎng)液處理SACC-LM細(xì)胞72 h后,將細(xì)胞重懸于195 μL的Binding Buffer中，吹打混勻后再轉(zhuǎn)移至5 mL的流式管中；把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞1次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來(lái)時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液，需避免胰酶的過(guò)度消化；取細(xì)胞懸液，4 ℃下1 000 r/min離心5 min,棄上清；加入1 mL預(yù)冷PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮,4 ℃下1 000 r/min離心5 min，棄上清；加入200 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μL 7-AAD 混勻；室溫、避光、反應(yīng)5 min；加入1 μL Annexin V-PE染液，混勻；室溫、避光、反應(yīng)15 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，每個(gè)樣品以流式細(xì)胞儀采集約10 000個(gè)細(xì)胞,右下象限為早期凋亡細(xì)胞，右上象限為中晚期凋亡及死亡細(xì)胞。使用CXP分析軟件進(jìn)行分析。

1.3.6JAK-STAT3信號(hào)通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為姜黃素0 μmol/L組和姜黃素10 μmol/L組，分別用相應(yīng)濃度的姜黃素培養(yǎng)液處理SACC-LM細(xì)胞72 h后,收集SACC-LM細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。將蛋白濃度調(diào)至一致后，每組每孔上樣10 μg蛋白，用10%的SDS-PAGE將蛋白質(zhì)分離，截取目的蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h或4 ℃過(guò)夜，隨后加入所需濃度的一抗于4 ℃孵育過(guò)夜。第2天洗去未結(jié)合一抗，加入二抗室溫孵育1 h，洗去未結(jié)合二抗，滴加ECL顯色液于暗室曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1SACC-LM細(xì)胞存活率 培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞存活率隨姜黃素濃度的增高而降低，見圖1；10 μmol/L姜黃素處理時(shí)細(xì)胞增殖抑制比較合適，細(xì)胞形態(tài)完整，見圖2；0 μmol/L和10 μmol/L姜黃素處理細(xì)胞24 h、48 h、72 h、96 h的吸光度OD值逐漸增高，但10 μmol/L姜黃素處理各時(shí)間點(diǎn)吸光度OD值均更低(P均<0.05)，見圖3。

圖1 不同濃度姜黃素處理72 h后SACC-LM細(xì)胞增殖情況

圖2 不同濃度姜黃素處理72 h后SACC-LM細(xì)胞形態(tài)(×200)

圖3 0 μmol/L和10 μmol/L姜黃素處理不同時(shí)間SACC-LM細(xì)胞增殖情況

2.2SACC-LM細(xì)胞侵襲能力 姜黃素0 μmol/L組、姜黃素1 μmol/L組、姜黃素5 μmol/L組、姜黃素10 μmol/L組細(xì)胞侵襲率分別為(112.33±3.51)%、(93.00±4.36)%、(46.00±2.08)%、(21.66±3.05)%，姜黃素5 μmol/L組、姜黃素10 μmol/L組均明顯低于姜黃素0 μmol/L組和姜黃素1 μmol/L組(P均<0.05)，且姜黃素10 μmol/L組明顯低于姜黃素5 μmol/L組(P<0.05)。鏡下觀察各組細(xì)胞侵襲情況見圖4。

圖4 姜黃素各組SACC-LM細(xì)胞侵襲結(jié)晶紫染色情況(×200)

2.3SACC-LM細(xì)胞遷移轉(zhuǎn)移能力 姜黃素0 μmol/L組、姜黃素1 μmol/L組、姜黃素5 μmol/L組、姜黃素10 μmol/L組細(xì)胞遷移率分別為(148.66±3.51)%、(138.66±3.05)%、(80.33±4.73)%、(30.66±5.51)%，姜黃素5 μmol/L組、姜黃素10 μmol/L組均明顯低于姜黃素0 μmol/L組和姜黃素1 μmol/L組(P均<0.05)，且姜黃素10 μmol/L組明顯低于姜黃素5 μmol/L組(P<0.05)。鏡下觀察各組細(xì)胞遷移情況見圖5。

2.4SACC-LM細(xì)胞凋亡情況 姜黃素0 μmol/L組、姜黃素1 μmol/L組、姜黃素5 μmol/L組、姜黃素10 μmol/L組細(xì)胞凋亡率分別為(4.46±0.47)%、(6.41±0.43)%、(8.95±0.33)%、(15.07±0.50)%，姜黃素5 μmol/L組、姜黃素10 μmol/L組均明顯高于姜黃素0 μmol/L組和姜黃素1 μmol/L組(P均<0.05)，且姜黃素10 μmol/L組明顯高于姜黃素5 μmol/L組(P<0.05)。各組細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖見圖6。

2.5SACC-LM細(xì)胞中JAK-STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 姜黃素10 μmol/L組SACC-LM細(xì)胞中STAT3、TIMP1、SNAIL、CyclinD1、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)量均明顯低于姜黃素0μmol/L組(P均<0.05)。見圖7。

圖5 姜黃素各組SACC-LM細(xì)胞遷移情況(×200)

圖6 姜黃素各組SACC-LM細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖

3 討 論

姜黃素的抗癌作用主要與其抗增殖和促凋亡作用有關(guān)，這已在人結(jié)腸癌細(xì)胞、人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞、慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系等體外研究中被證實(shí)[4-6]。體內(nèi)研究也表明姜黃素可以阻止癌細(xì)胞擴(kuò)散并抑制血管生成[7-8]。Bielak-Zmijewska等[9]觀察到姜黃素誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116系)和正常成纖維細(xì)胞凋亡的濃度分別為10 μmol/L和40 μmol/L。本研究用不同濃度的姜黃素處理SACC-LM細(xì)胞72 h，發(fā)現(xiàn)姜黃素可呈濃度依賴性抑制SACC-LM細(xì)胞的增殖，即隨著姜黃素濃度的增高，抑制效果增強(qiáng)；且姜黃素濃度為10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的增殖受到了明顯抑制，但是細(xì)胞的形態(tài)保持完好，當(dāng)姜黃素濃度為15 μmol/L時(shí)，SACC-LM細(xì)胞出現(xiàn)了斷層似的死亡。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示姜黃素能呈濃度依賴性明顯抑制SACC-LM細(xì)胞的侵襲和遷移，細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示姜黃素能呈濃度依賴性促進(jìn)SACC-LM細(xì)胞凋亡。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)姜黃素能明顯抑制SACC-LM細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)SACC-LM細(xì)胞凋亡。

圖7 2組SACC-LM細(xì)胞中JAK-STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

JAK-STAT信號(hào)通路是由酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(STATs)組成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程[10-11]。STATs主要存在于胞漿中，其激活后可以轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合，可以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)，調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程。其中STAT3與腫瘤的關(guān)系最為密切，活化的STAT3蛋白以二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與目的基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控特定靶基因如CyclinD1、c-myc、Bcl-xL、MMP-2、MMP-9、vemintin、VEGF等轉(zhuǎn)錄，這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別在細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)JAK-STAT3信號(hào)通路在肝癌[13]、肺癌[14]、直腸癌[15]、乳腺癌[16]、胃癌[17]等多種惡性腫瘤中存在過(guò)度激活。Wang等[18]報(bào)道，JAK-STAT信號(hào)通路異常與腺樣囊性癌的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，以JAK-STAT信號(hào)通路為靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)有望成為腺樣囊性癌治療的新途徑。相關(guān)研究證實(shí)，姜黃素能夠通過(guò)調(diào)控JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制宮頸癌Hela細(xì)胞、胃癌SGC-7901細(xì)胞和肝癌Hep3細(xì)胞增殖[19-20]。在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，給予姜黃素可增加miR-99a的表達(dá)，減少JAK1、STAT1和STAT3的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡并抑制細(xì)胞增殖、遷移[21]。Rajitha等[22]報(bào)道，姜黃素可通過(guò)抑制NF-κB途徑，下調(diào)STAT3，從而預(yù)防血管新生來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 μmol/L姜黃素處理SACC-LM細(xì)胞后，STAT3、TIMP1、SNAIL、CyclinD1、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，其中TIMP1、SNAIL、MMP-9、MMP-2是STAT3下游與細(xì)胞增殖、抗凋亡和轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因，受JAK-STAT3信號(hào)通路調(diào)控，故提示姜黃素可能通過(guò)調(diào)控JAK-STAT3信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抑制SACC-LM細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

綜上所述，姜黃素可抑制SACC-LM細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)SACC-LM細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與調(diào)控JAK-STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。