孔令巖，郝 帥，柴 儀，常波倫，齊立卿

(河北中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病[1]。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥指由于年齡增加、器官生理功能退行性改變和性激素分泌減少引起的骨質(zhì)疏松，一般分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥,都屬于退行性的骨質(zhì)疏松癥[2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎主骨，脾胃為后天之本，兩者與筋骨肌肉生長(zhǎng)發(fā)育有重要聯(lián)系，大多數(shù)老年性骨質(zhì)疏松癥患者以腎、肝、脾不足為主要病機(jī)。在“腎主骨”的理論指導(dǎo)下，確立中醫(yī)藥補(bǔ)腎健脾的治療原則，開發(fā)具有療效高、不良反應(yīng)小的中藥制劑，為治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥找到一條有效、安全、經(jīng)濟(jì)的新途徑[3]。目前對(duì)于絕經(jīng)去勢(shì)大鼠的實(shí)驗(yàn)研究較多，原發(fā)性老年性骨質(zhì)疏松癥大鼠的實(shí)驗(yàn)研究也在逐步增多，國(guó)內(nèi)外一些文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)D-半乳糖建立的雄性大鼠衰老模型出現(xiàn)骨密度下降，骨質(zhì)流失[4]。本課題組通過(guò)D-半乳糖誘導(dǎo)制備大鼠衰老模型，研究了以“溫補(bǔ)腎陽(yáng)，健脾和胃”為治則組方的強(qiáng)骨健脾湯對(duì)老年性骨質(zhì)疏松癥大鼠骨代謝指標(biāo)和骨微結(jié)構(gòu)的影響，旨在為拓展其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡健康雄性SD大鼠40只，體重(309±10)g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(冀)2021-002。大鼠飼養(yǎng)于屏障實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，自由獲取食水,每隔2 d換1次墊料，保持籠具內(nèi)清潔。實(shí)驗(yàn)室可通風(fēng)，室溫調(diào)節(jié)在(25±2)℃，濕度 30%～45%。實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審批，并按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理指南》(中國(guó)，2011年)進(jìn)行。

1.2藥物 強(qiáng)骨健脾湯，組方：淫羊藿12 g、骨碎補(bǔ)12 g、杜仲 12 g、黃芪10 g、山藥10 g、懷牛膝10 g、黨參10 g、茯苓10 g、白術(shù)12 g、葛根10 g、甘草6 g，采用神威產(chǎn)顆粒劑，每30 g強(qiáng)骨健脾湯顆粒劑溶于100 mL蒸餾水，按照“人與動(dòng)物體表面積計(jì)算法”計(jì)算灌胃量為3.125 g/(kg·d)。骨化三醇軟膠囊(正大制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20143141)，按照0.25 μg溶于50 mL蒸餾水制備骨化三醇混懸液。

1.3主要儀器及試劑 電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；一次性使用真空采血管(濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司)；雙能X射線骨密度儀(法國(guó) MEDILINK 公司)； Micro-CT(比利時(shí)SkyScan公司)；KDC-40低速臺(tái)式離心機(jī)(上海名元實(shí)業(yè)有限公司)；-20 ℃冰箱(伊萊克斯股份有限公司)； D-半乳糖(北京酷來(lái)搏科技有限公司)；多聚甲醛(天津市博迪化工股份有限公司)；戊巴比妥鈉(上海隆盛化工有限公司)；鈣試劑盒、磷試劑盒、骨鈣素(BGP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將40只雄性SD大鼠按體重隨機(jī)分為空白組、模型組、強(qiáng)骨健脾湯組和骨化三醇組，每組10只。SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，空白組給予生理鹽水1 mL/(kg·d)頸背部皮下注射，余組參考文獻(xiàn)[5-6]方法于頸背部皮下注射D-半乳糖150 mg/(kg·d)造模，1次/d，每周測(cè)體重 1 次，根據(jù)體重變化調(diào)整給藥量，持續(xù)8周。造模當(dāng)天開始，強(qiáng)骨健脾湯組給予強(qiáng)骨健脾湯顆粒沖劑3.125 g/(kg·d)灌胃，骨化三醇組給予骨化三醇混懸液0.05 μg/(kg·d)灌胃，空白組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)8周。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1體重及骨密度 實(shí)驗(yàn)結(jié)束稱量各組大鼠體重，然后麻醉大鼠，采用雙能X射線檢測(cè)股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端及L3～5段腰椎的骨密度。

1.5.2血清骨代謝指標(biāo) 使用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血5～6 mL，注入生化管中，將血液樣本放置2 h后，3 000 r/min離心20 min，提取血清，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中。采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血鈣、血磷，采用ELISA法檢測(cè)BGP、TRACP水平，按照試劑盒說(shuō)明書步驟操作。

1.5.3骨微結(jié)構(gòu) 用剃毛機(jī)剔除大鼠大腿和背部毛，取出左側(cè)脛腓骨、左側(cè)股骨、L3～5段腰椎，刮去軟組織，將樣本置入4%多聚甲醛中固定保存48 h。采用micro-CT掃描儀對(duì)樣本進(jìn)行掃描，掃描協(xié)議設(shè)置：18 mm等距體素大小、800 mA和80 kVp。將股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端組織手動(dòng)繪制成一個(gè)感興趣的區(qū)域，然后選取同等高度的100個(gè)切片，使用CTAn軟件1.13版(Bruker-micriCT)對(duì)相關(guān)骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁連接密度(Conn.D)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠體重及各部位骨密度比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組大鼠和股骨、脛骨、腰椎的骨密度均明顯低于空白組(P均<0.05)；強(qiáng)骨健脾湯組大鼠體重、骨化三醇組與強(qiáng)骨健脾湯組大鼠各部位骨密度均明顯高于模型組(P均<0.05)，骨化三醇組大鼠體重與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，骨化三醇組與強(qiáng)骨健脾湯組各部位骨密度比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

2.2各組血清骨代謝指標(biāo)比較 模型組血鈣、血磷、BGP和TRACP水平均明顯低于空白組(P均<0.05)；骨化三醇組血鈣、血磷、BGP水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，TRACP水平與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；強(qiáng)骨健脾湯組血鈣、血磷、BGP水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，TRACP水平明顯低于模型組(P<0.05)；強(qiáng)骨健脾湯組血鈣、血磷、TRACP水平均明顯低于骨化三醇組(P均<0.05)，2組BGP水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 空白組和骨質(zhì)疏松各組大鼠體重和不同部位骨密度比較

2.3各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)二維圖像比較 不同組別大鼠選取同一高度二維圖像，空白組大鼠骨小梁數(shù)目正常，排列整齊，連接度較好；模型組大鼠可見骨小梁數(shù)目減少，間隙較大，甚至出現(xiàn)空洞；強(qiáng)骨健脾湯組和骨化三醇組大鼠構(gòu)造較為緊實(shí)，排列整齊，骨小梁數(shù)目較模型組多。見圖1。

表2 空白組和骨質(zhì)疏松各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)

2.4各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較 與空白組比較，模型組大鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均明顯降低(P均<0.05)，Tb.Sp明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，骨化三醇組與強(qiáng)骨健脾湯組BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均明顯增高(P均<0.05)，Tb.Sp均明顯降低(P均<0.05)；骨化三醇組與強(qiáng)骨健脾湯組各參數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

圖1 空白組和骨質(zhì)疏松各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)micro-CT掃描二維圖像

3 討 論

表3 空白組和骨質(zhì)疏松各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較

老年性骨質(zhì)疏松癥屬于“骨痿”范疇，是眾因素、多臟腑綜合作用在骨骼的結(jié)果。古代醫(yī)家早對(duì)運(yùn)動(dòng)、飲食、體質(zhì)、勞逸、情志等因素對(duì)骨病和骨質(zhì)量的影響有一定認(rèn)識(shí)，其中《素問(wèn)·宣明五氣篇》記載“久立傷骨，久行傷筋……”指出運(yùn)動(dòng)對(duì)增強(qiáng)骨強(qiáng)度的重要性；《素問(wèn)·生氣通天論》曰:“是故謹(jǐn)和五味，骨正筋柔?！闭f(shuō)明營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入可使骨骼強(qiáng)健有力；《景岳全書》曰:“凡虛損之由……無(wú)非酒色勞倦。”強(qiáng)調(diào)虛損疾病與飲食、勞倦關(guān)系密切[7]。目前中醫(yī)學(xué)者普遍認(rèn)為原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的病因病機(jī)與腎、脾、肝三者關(guān)系密切[8-10]，其中腎為先天之本，主骨生髓，腎精衰弱、髓之府空虛則影響機(jī)體骨骼生長(zhǎng)發(fā)育及骨骼堅(jiān)硬程度；脾為后天之本，主肉主運(yùn)化水谷精微，脾氣虛弱則化生以及運(yùn)送營(yíng)養(yǎng)成分受阻，影響肌肉骨骼養(yǎng)分供給，加之脾失運(yùn)化不能補(bǔ)充腎精，多因素長(zhǎng)期作用必然導(dǎo)致骨痿；肝主筋，筋骨相連，協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)，肝藏血主疏泄，腎藏精主封藏，兩者相互制約促進(jìn)，肝虛時(shí)腎精隨之不足，筋燥髓空，運(yùn)動(dòng)痿軟導(dǎo)致骨痿；另外氣血順暢，經(jīng)絡(luò)相通也是濡養(yǎng)骨骼關(guān)節(jié)的物質(zhì)基礎(chǔ)，氣血受阻，脈絡(luò)阻滯，瘀血滋生，血液更新不暢，勢(shì)必影響骨骼細(xì)胞，進(jìn)而引發(fā)骨痿甚則骨痹[11]?，F(xiàn)代研究已明確胃腸道對(duì)于鈣及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收會(huì)直接影響骨骼的代謝，這與中醫(yī)脾胃為后天之本思想不謀而合[12]。強(qiáng)骨健脾湯由經(jīng)驗(yàn)方“骨松方”與參苓白術(shù)散加減化裁而成，方中淫羊藿(仙靈脾)、懷牛膝、杜仲合用補(bǔ)腎陽(yáng)壯骨功效強(qiáng)大，整方配合具有溫腎助陽(yáng)、健脾和胃、強(qiáng)筋健骨的功效，不僅可通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，還可以提升機(jī)體整體功能，溫補(bǔ)人體陽(yáng)氣以調(diào)節(jié)氣血經(jīng)脈，為骨代謝提供原動(dòng)力。目前研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，增加礦化結(jié)節(jié)數(shù)量，還能通過(guò)減少紅細(xì)胞聚集性而降低全血黏度，進(jìn)而改善血液流變性[13]；牛膝根提取物牛膝總皂苷可促進(jìn)骨形成，降低骨質(zhì)疏松大鼠尿羥脯氨酸值，抑制破骨細(xì)胞的活性，從而抑制骨吸收[14]。

D-半乳糖對(duì)機(jī)體許多器官均有影響，其在醛糖還原酶的作用下生成半乳糖醇，細(xì)胞內(nèi)半乳糖醇不斷堆積，致細(xì)胞滲透壓升高，細(xì)胞脆性增加，同時(shí)其在代謝過(guò)程中產(chǎn)生能誘導(dǎo)脂質(zhì)體氧化的自由基，隨著氧化壓力增高，導(dǎo)致細(xì)胞老化，可造成骨質(zhì)疏松和肌肉減少[15-16]。而骨密度測(cè)量在骨質(zhì)疏松診斷、骨折風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和藥物療效評(píng)估方面有不可替代的作用[17]。本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖建立老年性骨質(zhì)疏松癥模型，結(jié)果顯示模型組大鼠體重、骨密度、骨小梁厚度和連接密度較空白組明顯下降，骨小梁數(shù)目減少，說(shuō)明D-半乳糖致衰過(guò)程是全身性、多器官的，細(xì)胞老化也會(huì)表現(xiàn)在體重下降和骨丟失方面；與模型組比較，強(qiáng)骨健脾湯組大鼠體重、骨密度、骨小梁厚度和連接密度均明顯增高，骨小梁數(shù)目增多，說(shuō)明強(qiáng)骨健脾湯能增加骨質(zhì)疏松大鼠體重和骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)，這可能與中藥成分能抗機(jī)體氧化和促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收有關(guān)。

骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的病理基礎(chǔ)主要是成骨能力和骨吸收速度失去平衡，骨折愈合的生理基礎(chǔ)是骨皮質(zhì)內(nèi)外成骨細(xì)胞的增生和鈣化，因此通過(guò)藥物調(diào)節(jié)骨重建和加速成骨細(xì)胞增殖、分化過(guò)程對(duì)治療骨質(zhì)疏松癥具有重要意義[18]。骨重建是由破骨細(xì)胞吸收舊骨和成骨細(xì)胞合成等量新骨來(lái)完成的，整個(gè)新陳代謝過(guò)程是多種細(xì)胞及因子協(xié)同參與的，其中骨、軟骨、肝、腎、內(nèi)分泌腺體等組織會(huì)分泌大量的酶和激素或骨基質(zhì)產(chǎn)生一些膠原蛋白、非膠原蛋白代謝物，這些均為骨代謝生化指標(biāo)，它們能夠敏銳地反映骨骼的轉(zhuǎn)換狀態(tài)，對(duì)骨質(zhì)疏松癥的臨床診治和藥物研究有著重大意義[19]。本研究通過(guò)檢測(cè)血鈣、血磷和BGP、TRACP來(lái)反映骨形成和骨吸收情況。血清鈣、磷一方面來(lái)自骨中釋放, 另一方面來(lái)源于胃腸道從飲食物中的吸收[20]。血鈣由血清總鈣和游離鈣兩部分構(gòu)成，各占約50%，其中結(jié)合鈣大部分和清蛋白結(jié)合稱作不擴(kuò)散鈣，它與血漿中的離子鈣在pH值的影響下保持一種微妙的動(dòng)態(tài)平衡[19]。血磷在血液中以無(wú)機(jī)鹽的形式存在，血磷升高可促進(jìn)骨形成，血磷降低可促進(jìn)骨吸收[19]。BGP是骨中非膠原性蛋白的主要成分，為成骨細(xì)胞合成和分泌的一種肽類物質(zhì)，具有結(jié)合骨礦物質(zhì)的重要功能，不僅可反映成骨細(xì)胞活性，而且可反映骨轉(zhuǎn)換情況[21]。TRACP是破骨細(xì)胞產(chǎn)生的酶類，在骨吸收過(guò)程中能較好地反映骨吸收活性[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血鈣、血磷、BGP、TRACP水平均明顯降低，提示D-半乳糖可引起骨轉(zhuǎn)換率降低，這與成骨、破骨細(xì)胞活性減弱相關(guān)；強(qiáng)骨健脾湯組大鼠血鈣、血磷、BGP水平升高，TRACP水平降低，提示強(qiáng)骨健脾湯能促進(jìn)大鼠腸道鈣、磷吸收，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收。

綜上所述，強(qiáng)骨健脾湯能增加老年性骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)，其可能通過(guò)促進(jìn)腸道對(duì)鈣、磷的吸收，上調(diào)BGP水平和下調(diào)TRACP表達(dá)發(fā)揮上述作用，該藥的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究探討。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。