劉金豹，馮 萍，李 剛

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250011；2. 濟(jì)南市第四人民醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000)

近年來(lái)隨著激素在臨床上的廣泛應(yīng)用，激素性股骨頭壞死躍居非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首位，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。有研究表明，激素性股骨頭壞死與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化障礙密切相關(guān)，BMSCs具有多向分化潛能，可以定向分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種功能細(xì)胞[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn) Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能是BMSCs分化、增殖、活性表達(dá)的關(guān)鍵信號(hào)通路[2-6]。補(bǔ)腎活血方在臨床上廣泛用于激素性股骨頭壞死的治療，效果顯著,但作用機(jī)制尚不明確。本研究基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路探討了補(bǔ)腎活血湯對(duì)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的影響，旨在為該湯劑治療激素性股骨頭壞死提供分子生物學(xué)理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠30只，體重180～220 g,購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：No.37009200006066。購(gòu)入后飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物房，室溫控制在18～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，通風(fēng)換氣環(huán)境下標(biāo)準(zhǔn)鼠糧及純凈水適應(yīng)性喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2藥物與試劑 補(bǔ)腎活血湯(組方：淫羊藿30 g、杜仲15 g、丹參30 g、川芎15 g、白芍15 g、茯苓12 g、牛膝12 g、鹿角膠10 g、香附9 g、甘草9 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院煎藥室制備)；DMEM(L)培養(yǎng)基及胎牛血清(杭州四季青生物有限公司，中國(guó))；地塞米松、茜素紅染料染(Sigma公司，美國(guó))；Anti-CD44、Anti-CD45、Anti-CD73、Anti-CD90、Anti-CD105(艾博抗上海貿(mào)易有限公司，中國(guó))；CCK-8試劑盒(南京霆瑞生物科技有限公司，中國(guó))；堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(Sigma公司，美國(guó))；EASYspin Plus大量組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒(杭州昊鑫生物科技股份有限公司，中國(guó))；TaKaRa Prime Script Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(大連寶生物工程有限公司，中國(guó))；SYBR Green I(北京索萊寶科技有限公司，中國(guó))； PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司，中國(guó))。

1.3主要儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州艾科科技有限公司)，顯微鏡(日本Olympus公司),電子秤(上海恒平科技有限公司)，制冰機(jī)(上海暢可制冷設(shè)備有限公司)，高速冰凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)，高壓蒸汽滅菌鍋(上海雅瑪拓科貿(mào)公司)，烤箱(天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器公司)，-80 ℃冰箱(中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)，常溫4 ℃冰箱(海爾集團(tuán))，流式細(xì)胞儀( 北京眾力挽生物科技有限公司)，羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(賽默飛科技有限公司)。

1.4培養(yǎng)基制備 將20只6周齡SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和補(bǔ)腎活血湯組各10只，補(bǔ)腎活血湯組給予補(bǔ)腎活血湯3 mL/250 g(給藥量根據(jù)Meeh-Rubner公式計(jì)算)灌胃，生理鹽水給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃后2 h腹主動(dòng)脈取血，于4 ℃下放置4 h，3 000 r/min離心30 min，取上層血清56 ℃、30 min滅活，同組血清混勻并經(jīng)0.22 μm一次性濾膜抽濾除菌，然后分別制備含10%對(duì)照組大鼠滅活血清的DMEM(L)培養(yǎng)基和含10%補(bǔ)腎活血湯組大鼠滅活血清的DMEM(L)培養(yǎng)基。取含10%對(duì)照組大鼠滅活血清的DMEM(L)培養(yǎng)液，加入終濃度10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C和10-8mol/L地塞米松制備為含經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑的DMEM(L)培養(yǎng)基。

1.5細(xì)胞獲取及實(shí)驗(yàn)分組 脫臼法處死3只8周齡SD大鼠，無(wú)菌狀態(tài)下獲取大鼠BMSCs，采用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSCs，傳至第3代后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組細(xì)胞在含10%對(duì)照組大鼠滅活血清的DMEM(L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，補(bǔ)腎活血湯含藥血清組細(xì)胞在含10%補(bǔ)腎活血湯組大鼠滅活血清的DMEM(L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組細(xì)胞在含經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑的DMEM(L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.6觀察指標(biāo)及方法

1.6.1BMSCs形態(tài)學(xué)觀察及表面抗原鑒定 待第3代BMSCs鋪滿培養(yǎng)瓶底80%以上時(shí)，常規(guī)消化細(xì)胞；離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2～3次；計(jì)數(shù)細(xì)胞，保持每100 μL PBS中含106個(gè)細(xì)胞；根據(jù)說(shuō)明書(shū)每管加入抗體(CD105,CD90,CD73,CD44,CD45)染色，冰上避光孵育30～40 min；依次加入定量冷PBS，移至流式管中，上機(jī)，流式儀相應(yīng)光學(xué)通道檢測(cè)。

1.6.2BMSCs增殖率檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組同1.5。收集BMSCs，按每孔104個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h后，分別加入3組相應(yīng)培養(yǎng)基中，再次培養(yǎng)1 d后加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1～4 h，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光值(OD值)，每組6個(gè)復(fù)孔。同法依次檢測(cè)培養(yǎng)2 d、3 d、4 d的細(xì)胞增殖率。

1.6.3堿性磷酸酶活性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組同1.5。將BMSCs按每孔104個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h后，分別加入3組相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d后，參照堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，酶標(biāo)儀檢測(cè)BMSCs中堿性磷酸酶活性，每組6個(gè)復(fù)孔。

1.6.4茜素紅染色 實(shí)驗(yàn)分組同1.5。BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.6.3，培養(yǎng)21 d后倒掉培養(yǎng)基，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定15 min，茜素紅(pH 8.3)孵育30～40 min。鏡下觀察局部區(qū)域呈紫紅色或紅色代表鈣結(jié)節(jié)形成或鈣鹽沉積。

1.6.5Wnt3a、β-catenin、CyclinD1和Runx2 mRNA表達(dá)RT-PCR檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組同1.5,3組細(xì)胞干預(yù)21 d后，參照EASYspin Plus大量組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒說(shuō)明提取總RNA?？俁NA經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280比值介于1.8～2.0。反轉(zhuǎn)錄，參照TaKaRa Prime Script Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)，20 mL體系合成cDNA。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列及退火溫度見(jiàn)表1。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，45個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物與內(nèi)參GAPDH基因修正，將檢測(cè)所得CT值轉(zhuǎn)換為基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子RT-PCR檢測(cè)引物序列和退火溫度

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs形態(tài) 全骨髓培養(yǎng)法獲取BMSCs起初以懸浮為主，接種48 h后首次全量換液后可見(jiàn)數(shù)目較多的貼壁細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察主要為圓形、梭形、紡錘形、多角形等幾種形狀，培養(yǎng)10～14 d，細(xì)胞呈典型的集落樣生長(zhǎng)，中心呈旋渦狀，貼壁細(xì)胞達(dá)80%～90%進(jìn)行傳代；第1代細(xì)胞增殖加快，大量細(xì)胞呈梭形生長(zhǎng)，向外伸出偽足，細(xì)胞純度增高；經(jīng)過(guò)3次傳代純化后，第3代細(xì)胞形態(tài)單一，光鏡下貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)出成纖維狀或紡錘狀，貼壁生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞增殖快。各期BMSCs形態(tài)見(jiàn)圖1。

2.2BMSCs表面抗原鑒定 傳至第3代的BMSCs流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，CD44陽(yáng)性表達(dá)率為97.39%， CD45陽(yáng)性表達(dá)率為1.69%，CD73陽(yáng)性表達(dá)率為83.91%，CD90陽(yáng)性表達(dá)率為80.19%，CD105陽(yáng)性表達(dá)率為84.58%。見(jiàn)圖2。

2.3BMSCs增殖情況 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，3組BMSCs增殖率逐漸增高；補(bǔ)腎活血湯含藥血清組干預(yù)3 d、4 d的BMSCs增殖率均明顯高于同期經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組和空白對(duì)照組(P均<0.05)，經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖1 不同時(shí)期的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原陽(yáng)性表達(dá)情況

圖3 各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖情況

2.4BMSCs中堿性磷酸酶活性 干預(yù)14 d后，補(bǔ)腎活血湯含藥血清組及經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組堿性磷酸酶活性均明顯高于空白對(duì)照組(P均<0.05)，補(bǔ)腎活血湯含藥血清組與經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

2.5茜素紅染色BMSCs成骨分化情況 細(xì)胞培養(yǎng)21 d后,空白對(duì)照組未見(jiàn)明顯陽(yáng)性區(qū)域；補(bǔ)腎活血含藥血清組和經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組可見(jiàn)明顯片狀陽(yáng)性區(qū)域，由集落 為中心放射性向四周生長(zhǎng)。見(jiàn)圖5。

圖4 干預(yù)14 d后各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中堿性磷酸酶活性

2.6BMSCs中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)情況 補(bǔ)腎活血方含藥血清組和經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組Wnt3a、β-catenin、CyclinD1、Runx2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白對(duì)照組(P均<0.05)，補(bǔ)腎活血湯含藥血清組與經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖6。

3 討 論

BMSCs是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，其具有保持自我更新和多向分化的能力，可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元、心肌細(xì)胞及肝細(xì)胞等[7-8]。大量研究證實(shí)，BMSCs的分化障礙在激素性股骨頭壞死發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[9-10]。如何定向成骨誘導(dǎo)分化BMSCs可為骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死等疑難疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。

圖5 干預(yù)21 d后各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞茜素紅染色表現(xiàn)(×100)

圖6 干預(yù)21 d后各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Wnt 信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)量

BMSCs缺乏特異性的識(shí)別標(biāo)志，但是同時(shí)具有間充質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的特點(diǎn)[11]。Arufe等[12]認(rèn)為BMSCs的標(biāo)志物有CD105、CD90、CD73、CD44、CD45。隨著研究的深入，體外分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增BMSCs及其鑒定技術(shù)都取得了巨大的進(jìn)展。本研究采用成熟的全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)、純化BMSCs,與國(guó)內(nèi)外研究一致，獲得了較理想的用于體外實(shí)驗(yàn)的BMSCs。但是成骨誘導(dǎo)分化尚未形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，目前誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的方法眾多，可以應(yīng)用物理方法、化學(xué)藥物、細(xì)胞因子促進(jìn)其成骨分化，也可以通過(guò)骨細(xì)胞共培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因作用和中藥提取物作用下促成骨分化，其中補(bǔ)腎活血藥物在MBSCs成骨誘導(dǎo)分化中顯示出優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)所用補(bǔ)腎活血方中淫羊藿、杜仲、牛膝、鹿角膠填精益髓，壯陽(yáng)生精，使“陽(yáng)得陰生、陰得陽(yáng)化，陰充陽(yáng)旺而源不絕”；丹參、川芎、白芍活血化瘀，消腫止痛，“瘀血去、新血生，氣血通達(dá)而痛自止”；佐以茯苓、香附健脾化飲，舒肝理氣，行氣滯以暢氣機(jī)，化濕濁以行津液；使藥甘草緩急止痛、調(diào)和諸藥。本方從整體觀念出發(fā)，治病求本，重在補(bǔ)腎健骨，同時(shí)活血化瘀，使氣血通暢、筋骨強(qiáng)勁，從而起到改善股骨頭壞死區(qū)域血供和緩解臨床癥狀的目的?，F(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究表明，補(bǔ)腎藥物可提高機(jī)體免疫功能，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)激素水平，刺激BMSCs增殖、成骨分化和成熟[13-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活血湯含藥血清組及經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組BMSCs增殖率、堿性磷酸酶活性明顯高于空白對(duì)照組，茜素紅染色的陽(yáng)性區(qū)域明顯多于空白對(duì)照組，說(shuō)明補(bǔ)腎活血湯具有明顯促進(jìn)BMSCs增殖和成骨分化的能力。

Wnt信號(hào)通路在骨骼發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。Wnt/β-catenin信號(hào)途徑由19種分泌蛋白家族組成，Wnt3a是現(xiàn)已知的一種蛋白。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的核心蛋白，CyclinD1和Runx2是其信號(hào)通路下游重要的靶向蛋白。其中CyclinD1是細(xì)胞G1/S期行進(jìn)中必不可少的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖。β-catenin蛋白為間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化提供了一種分子轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，并且實(shí)驗(yàn)證實(shí)β-catenin 可通過(guò)增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的應(yīng)答來(lái)誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化[15]。Gaur等[16]研究表明，Runx2是經(jīng)典Wnt通路中的一個(gè)靶基因，β-catenin的穩(wěn)定表達(dá)和TCF1的激活能夠啟動(dòng)早期成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Runx2/Cbfa1/Aml3表達(dá)，從而決定BMSCs向成骨細(xì)胞的分化。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者均認(rèn)為激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路可以促進(jìn)BMSCs向成骨分化。劉光旺等[17]研究表明補(bǔ)腎填精中藥血清可通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)去勢(shì)小鼠BMSCs成骨分化。李新建等[18]研究表明，補(bǔ)腎活血湯能夠通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)兔激素性股骨頭缺血壞死BMSCs的成骨分化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活血湯和經(jīng)典的成骨誘導(dǎo)劑都可以促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路成骨因子Wnt3a、β-catenin、CyclinD1和Runx2的表達(dá)，促進(jìn)成骨分化。

綜上所述，補(bǔ)腎活血湯可以促進(jìn)BMSCs的增殖與成骨分化，其機(jī)制可能與經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的激活有關(guān)，這對(duì)于激素性股骨頭壞死的治療有重要意義。但是補(bǔ)腎活血湯成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)多，其促進(jìn)BMSCs增殖與成骨分化的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究、探討。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。