武亦閣，范麗娜，賀 乙，孫世嬌，許 可，周 光

(新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830011)

“證”是中醫(yī)學發(fā)展史中特有的一種辨識疾病的模型，能夠簡潔高效反映出疾病發(fā)展中臟腑病位、正邪關系及與病機之間的一般規(guī)律與聯系[1]。辨證論治是中醫(yī)基礎理論的核心，對于臨床實踐有著重要的指導作用。濕疹是常見的炎癥性、變態(tài)反應性皮膚疾病，屬于中醫(yī)外科學皮膚病“濕瘡”范疇，臨床中以多形損害、劇烈瘙癢、反復發(fā)作為特點，帶給患者嚴重的心身損害。中醫(yī)外科學教材、期刊文獻研究及臨床經驗中均顯示，濕熱蘊膚證、血虛風燥證、脾虛濕蘊證為濕疹的三大核心證型[2]。 結合臨床及中醫(yī)辨證要點分析，急性濕疹以丘皰疹為主，滲出明顯，辨證多屬濕熱蘊膚證，為表證實證；慢性濕疹以干燥脫屑為特點，辨證多屬血虛風燥證；亞急性濕疹皮損以多形性損害為主，其用藥多以健脾運濕為原則[3]，故多屬本虛標實之脾虛濕蘊證。本研究通過對課題組前期相關研究數據進行橫向對比[4-6]，分析濕熱蘊膚證、脾虛濕蘊證、血虛風燥證濕疹樣病變豚鼠模型間的皮膚屏障功能、分子生物學及病理學特征差異，以期探討各證型間的生物學表征差異、同病異治的分子生物學基礎、辨證論治體系下的方證相應性，為中醫(yī)證型的實驗研究探討提供新思路新方法。

1 實驗材料與方法

1.1動物 普通級雄性豚鼠，體重(350±20)g，購于陜西君行生物科技有限公司，動物合格證號：SCXK(陜)2017-001，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心普通級環(huán)境實驗室,溫度20～26 ℃,相對濕度10%～25%,光照節(jié)律12L∶12D。本實驗已經通過動物實驗倫理委員審查(IACUC-20160218-076)。

1.2藥品 番瀉葉，飲片購自新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中藥房；番瀉葉冷浸液制備：稱取40.0 g番瀉葉完全浸泡在100 mL常溫純水中，3 h后4層紗布過濾備用。2,4-二硝基氯苯(DNCB),上海古朵生物科技有限公司(20191210)；丙酮，天津富宇精細化工有限公司(20190608)，以丙酮為溶劑配置濃度為7%的NDCB丙酮溶液作為致敏劑和濃度為0.1%的NDCB丙酮溶液作為激發(fā)劑。

1.3試劑 豚鼠血清白細胞介素-17(IL-17，貨號：YX-E28700，批號：20200130)、CD4+(貨號：YX-E28758，批號：20200130)、CD8+(貨號：YX-E28799，批號：20200130)、免疫球蛋白E(IgE，貨號：YX-E28996，批號：20200130)ELISA檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。蘇木素伊紅(HE)染色液(LEAGENE公司，批號：0611A20)，4%多聚甲醛(LEAGENE公司，批號：0830A19)。

1.4儀器 多功能皮膚測試儀(德國CK公司， MPA6/10)，臺式低速離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司，SF-TDL-5C)，分析天平(德國Sartorius公司 ，BL310/BL21S)，電子天平(上海菁海儀器有限公司，DY15K)，光學顯微鏡(德國Leica公司，DM2500)。

1.5實驗方法 適應性喂養(yǎng)1周后，將豚鼠按隨機數字表法隨機分為空白對照組、濕熱蘊膚組、血虛風燥組和脾虛濕蘊組。參考文獻[7-8]方法造模：所有豚鼠背部脫毛3 cm×3 cm大小以暴露皮膚，濕熱蘊膚組豚鼠實驗第1天以7%DNCB丙酮溶液100 μL外涂背部脫毛區(qū)致敏,第5天外涂0.1% DNCB丙酮溶液25 μL于豚鼠左耳內側激發(fā)，每周1次,連續(xù)2周，共致敏、激發(fā)各2次；血虛風燥組豚鼠實驗第1天以7%DNCB丙酮溶液100 μL外涂背部脫毛區(qū)致敏,第5天外涂0.1%DNCB丙酮溶液25 μL于豚鼠左耳內側激發(fā)，每周1次,連續(xù)4周，共致敏、激發(fā)各4次；脾虛濕蘊組豚鼠在血虛風燥組造模的基礎上，同時每日灌胃番瀉葉冷浸液，5 mL/kg，1次/d，連續(xù)4周。濕熱蘊膚組豚鼠在造模階段死亡2只。

1.6檢測指標及方法

1.6.1皮膚角質層含水量 造模結束后,使用多功能皮膚測試儀水分測試探頭測量并記錄皮膚角質層含水量。

1.6.2經表皮水分流失量 造模結束后,使用多功能皮膚測試儀水分散失測試探頭測量并記錄皮膚經表皮水分流失量。

1.6.3皮膚組織病理形態(tài) 造模結束后，取造模部位皮膚組織，固定脫水后石蠟包埋，制成5 μm厚切片，HE染色后中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察，隨機選取病理視野并進行評分。評分標準：0分為皮膚結構完整，未見細胞變性壞死、水腫、充血及炎性細胞浸潤等病理改變；1分為皮膚表皮角化過度或角化不全，水腫，棘細胞層輕度增厚，真皮層少量炎性細胞浸潤；2分為皮膚表皮角化過度或角化不全，水腫，棘細胞層中度增厚，真皮層少量炎性細胞浸潤；3分為皮膚表皮角化過度或角化不全，水腫，棘細胞層明顯增厚，真皮層少量或大量炎性細胞浸潤。

1.6.4血清IgE、IL-17水平及CD4+、CD8+濃度造模結束后，所有豚鼠腹主動脈取血，靜置2 h后，離心機3 000 r/min離心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱中，參照試劑盒說明書測定血清IgE、IL-17水平及CD4+、CD8+濃度。

1.7統(tǒng)計學方法 所有數據采用SPSS 26.0軟件進行分析，計量資料若數據滿足正態(tài)性和方差齊性，組間比較使用單因素方差分析中的LSD法；若方差不齊，則用Tamhane’sT2法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1各組豚鼠皮膚角質層含水量與經表皮水分散失量比較 濕熱蘊膚組、血虛風燥組、脾虛濕蘊組豚鼠皮膚角質層含水量均明顯低于空白對照組(P均<0.05)，且血虛風燥組豚鼠皮膚角質層含水量明顯低于濕熱蘊膚組、脾虛濕蘊組(P均<0.05)；濕熱蘊膚組、血虛風燥組、脾虛濕蘊組豚鼠經表皮水分散失量均明顯高于空白對照組(P均<0.05)，不同證型組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 空白對照組和不同證型濕疹樣病變組豚鼠皮膚角質層含水量、經表皮水分散失量比較

2.2各組豚鼠皮膚組織病理表現及評分比較 空白對照組豚鼠皮膚組織結構基本正常，皮膚表皮角化層、顆粒層、棘細胞層及基底層結構完整，真皮層纖維排列整齊，未見水腫、出血及炎性細胞浸潤等病理改變；濕熱蘊膚組豚鼠皮膚表皮角化不全，伴有灶狀角化過度，顆粒層、棘細胞層及基底層細胞增生，真皮層可見纖維結締組織增生，出血，血管充血及大量炎性細胞浸潤，病理評分為(2.33±0.82)分；血虛風燥組豚鼠皮膚表皮角化過度，顆粒層、棘細胞層增生，真皮層纖維結締組織增生，可見嗜酸性粒細胞及散在炎性細胞浸潤，病理評分為(2.00±0.89)分，明顯低于濕熱蘊膚組(P<0.05)；脾虛濕蘊組豚鼠模型皮膚表皮棘層增厚，真皮層可見少量嗜酸性粒細胞，病理評分為(2.00±0.89)分，明顯低于濕熱蘊膚組(P<0.05)。見圖1。

圖1 空白對照組和不同證型濕疹樣病變組豚鼠皮損區(qū)皮膚組織病理HE染色表現

2.3各組豚鼠血清IgE、IL-17水平比較 濕熱蘊膚組、血虛風燥組、脾虛濕蘊組血清IgE、IL-17水平均明顯高于空白對照組(P均<0.05)；血清IgE水平由低到高的順序為血虛風燥組、脾虛濕蘊組、濕熱蘊膚組，血清IL-17水平由低到高的順序為濕熱蘊膚組、血虛風燥組、脾虛濕蘊組，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 空白對照組和不同證型濕疹樣病變組豚鼠血清IgE、IL-17水平比較

2.4各組豚鼠血清CD4+、CD8+濃度及CD4+/CD8+比較 與空白對照組比較，濕熱蘊膚組血清CD4+濃度明顯升高(P<0.05)，血虛風燥組、脾虛濕蘊組血清CD4+濃度均明顯降低(P均<0.05)，脾虛濕蘊組血清CD4+濃度明顯低于血虛風燥組(P<0.05)。濕熱蘊膚組、血虛風燥組、脾虛濕蘊組血清CD8+濃度均明顯高于空白對照組(P均<0.05)，且濕熱蘊膚組、脾虛濕蘊組均明顯高于血虛風燥組(P均<0.05)。血虛風燥組、脾虛濕蘊組CD4+/CD8+明顯低于空白對照組(P均<0.05)，且脾虛濕蘊組明顯低于血虛風燥組(P<0.05)。見表3。

表3 空白對照組和不同證型濕疹樣病變組血清CD4+ T、CD8+ T濃度及CD4+/CD8+比較

3 討 論

本實驗研究中濕疹的造模是當前公認的DNCB濕疹動物造模方案[7]，通過刺激豚鼠局部皮膚出現濕疹樣改變，對造模部位皮膚進行病理分析顯示不同程度的表皮真皮炎性細胞浸潤與細胞間水腫，與臨床吻合度高。基于中西醫(yī)臨床特點評價方法[9-10]，通過臨床急性濕疹與慢性濕疹的發(fā)病時間、皮損表現對濕疹模型進行區(qū)分，構建出發(fā)病急、病程短、皮損以滲出為特點的濕熱蘊膚型濕疹模型，病程長及皮膚以肥厚、脫屑、苔蘚樣變?yōu)樘攸c的血虛風燥型濕疹模型；基于病證結合評價方法，通過病癥疊加構建出番瀉葉冷浸液灌胃下的脾虛濕蘊型濕疹模型。以上3種病證模型具有較強的代表性。

經表皮水分流失量是測定皮膚組織水分因屏障破壞后從內向外持續(xù)流失的一個活動性指標。中醫(yī)基礎理論中論述到風為陽邪，其性開泄，五行理論架構下的風邪指具有擾動和變化特征的病邪和證候，據此討論將經表皮水分流失量作為風邪進行病機闡釋。本研究中，濕熱蘊膚組、血虛風燥組、脾虛濕蘊組豚鼠皮膚經表皮水分流失量均升高，客觀反映出風邪在表證中的廣泛存在，與《黃帝內經》中提出的“風為百病之長”相符，風邪亦是濕疹疾病瘙癢癥狀的重要病因，指導臨床在辨證論治抓主證的同時善于治風之法。角質層含水量是反映皮膚“潤澤”狀態(tài)的指標，是皮膚“燥象”的指征，本研究中血虛風燥組以低角質層含水量為突出表征，反映出皮毛氣血、津液敷布障礙，失于濡養(yǎng)而干燥脫屑，與臨床中治療該型養(yǎng)血潤燥的用藥經驗相符合。

IgE在濕疹疾病中扮演著重要角色，張夢鴿等[11]研究發(fā)現IgE水平與濕疹疾病的嚴重程度呈正相關。本實驗結果顯示，濕熱蘊膚組豚鼠血清IgE水平最高，皮膚組織病理示血管充血及大量炎性細胞和嗜酸性粒細胞浸潤。濕熱蘊膚證濕疹的臨床病機特點多表現為急性發(fā)病，結合本研究模型外邪直侵肌表，處于疾病發(fā)生的早期，此時機體正氣充足，正邪相爭于肌表，病變豚鼠表現為瘙癢劇烈，皮膚組織病理滲出明顯，符合“濕邪”的證候要點。結合本研究血虛風燥組模型特點，說明疾病后期若外邪刺激繼續(xù)存在，疾病的轉歸則向慢性轉變。

中醫(yī)認為臟腑病變會影響機體的免疫調節(jié)，而免疫失調是濕疹發(fā)病的主要原因之一[12]。CD4+、CD8+T淋巴細胞彼此相互調節(jié)，是免疫系統(tǒng)的核心[13]。另有研究表明，Th17細胞因子IL-17通過驅動炎性細胞在皮膚聚集介導皮膚炎癥，推動著皮膚炎癥反應的慢性化[14]。本實驗結果顯示，脾虛濕蘊組豚鼠CD4+與CD8+比值降低，其免疫紊亂的程度在3個證型組中位居首位，且該組豚鼠血清IL-17水平明顯升高。提示免疫紊亂后機體對炎癥因子的調節(jié)能力下降，同時促使病情向著慢性轉變，故免疫紊亂可作為濕疹脾虛濕蘊證中“脾虛”的證候特點。在濕疹的中醫(yī)辨證論治中，該證型以調節(jié)臟腑功能為首要，反映出中醫(yī)標本兼治的臨床智慧。

綜上所述，低角質層含水量體現出血虛風燥證中“燥象”的證候特點；皮膚病理形態(tài)炎癥滲出、高IgE體現出濕熱蘊膚證中“濕邪”的證候特點；低CD4+/CD8+、高血清IL-17體現出脾虛濕盛證中免疫紊亂“脾虛”的證候特點；經表皮水分流失量體現出中醫(yī)“風邪”的證候特點。本研究從分子生物學角度闡釋出中醫(yī)辨證論治、整體觀念、同病異治等中醫(yī)基礎思維的遠見性，為臨床同病異治的分子生物學基礎、辨證論治體系下的方證相應提供了實驗支撐。但本研究是在特定動物模型中進行的，具有一定的局限性。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。