楊 靜,吳沅皞

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院/國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381；2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性自身免疫性疾病，臨床上以關(guān)節(jié)腫脹、疼痛為主要特征。除關(guān)節(jié)外，RA常導(dǎo)致全身多系統(tǒng)受累，肺部是最常受累的器官之一。RA相關(guān)性間質(zhì)性肺病是RA最常見的肺部并發(fā)癥，此類患者若未經(jīng)及時治療可進一步發(fā)展為肺纖維化(PF)，PF是RA患者預(yù)后不良的體征，也是RA患者死亡的重要原因[1-2]。PF是一種慢性、進行性、間質(zhì)性肺病，其主要特征是肺部纖維化和肺功能惡化，起病隱匿，常因無明顯癥狀、體征而被忽略，中位生存期估計在診斷后2～3年[3]。PF的發(fā)病機制目前尚未有明確結(jié)論，可能與炎癥反應(yīng)、肺泡上皮細胞的異常損傷與修復(fù)、免疫紊亂等相關(guān)。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是介導(dǎo)纖維化發(fā)生的關(guān)鍵細胞因子，其可以通過介導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生使上皮細胞分化為肌成纖維細胞，EMT過程以上皮細胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)減少以及間充質(zhì)細胞標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)增多為特征。肌成纖維細胞是EMT過程的產(chǎn)物，也是纖維化形成的重要組成物質(zhì)。因此TGF-β1是介導(dǎo)肺纖維化形成的重要細胞因子，抑制TGF-β1表達是阻止肺纖維化發(fā)生的有效措施。中醫(yī)典籍中沒有與RA-PF完全相對應(yīng)的名稱記載，因其常有咳嗽、氣短、呼吸困難等癥狀可歸屬于“肺痹” “肺萎” “喘證” “肺脹” “咳嗽”等疾病，根據(jù)疾病特點及臨床表現(xiàn)，現(xiàn)代醫(yī)家多將RA-PF歸屬于“肺痹”的范疇?！秲?nèi)經(jīng)》記載“五臟皆有合，病久而不去者，內(nèi)舍于其合也……皮痹不已，復(fù)感于邪，內(nèi)舍于肺”，“今風(fēng)寒客于人，使人毫毛畢直……弗治，病入舍于肺，名曰肺痹”。認為痹證日久不愈，患者久病體虛，加之復(fù)感外邪，導(dǎo)致肺臟受累，則發(fā)為肺痹。肺痹的主要病因病機為外感風(fēng)寒濕邪，經(jīng)脈阻滯，痰瘀互結(jié)，日久不愈，外邪內(nèi)舍，肺氣痹阻，因此在治療上多采用祛風(fēng)散寒、除濕止痛、祛瘀化痰、解毒通絡(luò)、活血通痹的原則。中藥復(fù)方清痹達金方具有祛風(fēng)除濕、通痹止痛、化痰祛瘀、瀉肺平喘、止咳化痰之功效，為進一步闡明該方治療RA-PF的療效及作用機制，本實驗以纖維化形成的關(guān)鍵介質(zhì)TGF-β1為出發(fā)點，以膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎-肺纖維化(CIA-PF)大鼠為實驗對象進行了相關(guān)研究，以期為清痹達金方在臨床上的使用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 36只7周齡健康雄性SPF級Wistar大鼠，體重(180±20)g，購于北京華阜康實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京)2019-0008。飼養(yǎng)于屏障環(huán)境內(nèi)，室內(nèi)溫度20～26 ℃，室內(nèi)濕度40%～70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實驗期間動物進食、飲水自由。動物實驗遵循天津市醫(yī)學(xué)實驗動物保護中心的指導(dǎo)原則，實驗方案經(jīng)易生源基因科技(天津)有限公司的動物倫理委員會批準(zhǔn)(YSY-DWLL-202105218)。

1.2主要實驗藥品及制備

1.2.1清痹達金方的制備 清痹達金方由防風(fēng)、知母、露蜂房、姜黃、桑白皮、皂角刺各10 g組成，購于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，制備為顆粒劑備用。根據(jù)體表面積計算出大鼠用藥量，高、中、低劑量分別為10.8 g/(kg·d)、5.4 g/(kg·d)、2.7 g/(kg·d)。大鼠灌胃容積為10 mL/kg，每次給藥前分別將藥物配制為高劑量1.08 g/mL、中劑量0.54 g/mL、低劑量0.27 g/mL的濃度備用。

1.2.2醋酸潑尼松混懸液的制備 醋酸潑尼松片購于天津天藥藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H12020689，按成人每日劑量15 mg換算，大鼠等效劑量為1.35 mg/(kg·d)。將醋酸潑尼松片碾碎溶于蒸餾水，按大鼠灌胃容積為10 mL/kg計算，制備成濃度為0.135 mg/mL的醋酸潑尼松混懸液備用。

1.3主要實驗試劑及儀器 硫酸博來霉素(上海吉至生化科技有限公司，B5D870)，牛Ⅱ型膠原(Chondrex公司，200394)，弗氏完全佐劑(Chondrex公司，200260)，弗氏不完全佐劑(Sigma公司，SLBZ9888)，大鼠TGF-β1ELISA試劑盒(北京索萊寶，SEKR-0012)，Mouse Anti-β-actin mAb(中杉金橋TA-09)，TGF Beta 1 Polyclonal Antibody(Proteintech21898-1-AP)，Anti-α smooth muscle actin(α-SMA) Antibody(BOSTER BM0002)，Anti-E-cadherin Antibody(BOSTER PB9561)，實時定量PCR儀(ThermoFisher Scientific QuantStudio 1)，普通PCR儀(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，Hema9700)，足趾容積測量儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司，YLS-7C)。

1.4實驗方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、模型組、醋酸潑尼松組及清痹達金方高、中、低劑量組，每組6只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰臥固定于鼠板上，頸部剃毛，碘伏消毒，沿頸中線剪開頸部皮膚，剝離周圍組織，暴露氣管。各造模組大鼠用注射器向氣管內(nèi)注入預(yù)先配置好的博來霉素生理鹽水溶液(硫酸博來霉素溶于生理鹽水中，濃度為5 mg/mL)5 mg/kg，對照組大鼠同期同法注入生理鹽水。注射完畢后立即豎起鼠板，迅速轉(zhuǎn)動，使博來霉素生理鹽水溶液均勻分布于大鼠氣管及支氣管。隨后放下鼠板，縫合大鼠頸部皮膚。將濃度為2 mg/mL的牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑等比例混合，冰浴中混合攪勻至乳化，配制成終濃度為1 mg/mL的牛Ⅱ型膠原乳化劑備用。固定大鼠，尾根部剃毛，各造模組大鼠于尾根部皮內(nèi)多點注射乳化劑共計0.2 mL(內(nèi)含膠原200 μg)進行初次免疫，對照組大鼠同期同部位注入生理鹽水0.2 mL。初次免疫7 d后，將濃度為2 mg/mL的牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑同法混合備用，于尾根部皮內(nèi)多點注射乳化劑共計0.1 mL(含膠原100 μg)進行加強免疫，對照組同期同部位注入生理鹽水0.1 mL。 加強免疫7 d后，對照組和模型組給予蒸餾水10 mL/(kg·d)灌胃，清痹達金方高、中、低劑量組分別給予清痹達金方10.8 g/(kg·d)、5.4 g/(kg·d)、2.7 g/(kg·d)灌胃，醋酸潑尼松組給予醋酸潑尼松1.35 mg/(kg·d)灌胃，均連續(xù)灌胃14 d。

1.5標(biāo)本采集 末次灌胃結(jié)束后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，將其仰臥固定于鼠板上，腹主動脈取血，室溫下靜置1 h，待血清、血漿分層后離心，取上層血清凍存，盡快進行后續(xù)ELISA檢測。剪開大鼠胸腔，暴露肺組織，取病變部位肺組織，PBS沖洗殘留血液，部分放入4%多聚甲醛中固定24 h以上，隨后脫水、包埋、切片，進行HE染色及Masson染色觀察病理學(xué)改變。部分肺組織置于凍存管內(nèi)-80 ℃凍存，以供q-PCR及Western blot檢測。

1.6觀察指標(biāo)及方法

1.6.1大鼠一般生理狀態(tài) 造模后觀察大鼠的一般情況，包括精神狀態(tài)、飲食水情況、毛發(fā)、日?；顒拥?。

1.6.2關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評分 參考 Abreu 等[4]的技術(shù)方案，采用AI評分法分別評估造模后及灌胃7 d、灌胃14 d后前后4爪炎癥嚴(yán)重程度。AI評分標(biāo)準(zhǔn)：關(guān)節(jié)無紅腫為0分；1個關(guān)節(jié)部位發(fā)紅，并(或)見腫脹為1分；關(guān)節(jié)發(fā)紅并(或)腫脹關(guān)節(jié)>1個為2分；整個爪部發(fā)紅并(或)腫脹為3分；關(guān)節(jié)畸形并(或)僵直為4分。各關(guān)節(jié)累計分數(shù)為大鼠的 AI 評分，AI評分≥4 分為造模成功。

1.6.3足趾容積 采用排水法測量各組大鼠造模前、造模后及灌胃14 d后足趾容積。具體方法：環(huán)繞大鼠踝關(guān)節(jié)畫線，將畫線處以下踝關(guān)節(jié)放入足趾容積測量儀液面內(nèi)，每側(cè)測量3次后取平均值，再取左右兩側(cè)足趾容積平均值為最終結(jié)果。

1.6.4血清TGF-β1水平 大鼠血清樣品室溫解凍備用，嚴(yán)格按ELISA試劑盒操作說明進行操作。

1.6.5病理學(xué)形態(tài) 將肺組織從4%多聚甲醛固定液中取出，經(jīng)沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、攤片、烤片后分別進行HE染色及Masson染色。

1.6.6肺組織中TGF-β1、E-cadherin、α-SMA mRNA表達情況 采用q-PCR法測定：冰浴上稱取肺組織50 mg，加入1 mL變性緩沖液(Trizol)后放入組織研磨機內(nèi)。組織研磨碎后加入200 μL氯仿，劇烈振蕩搖晃使溶液混勻，常溫放置5 min，隨后4 ℃離心10 min，此時上層為透明的水相(含RNA)，下層為有機相。取新離心管先加入上層溶液500 μL，再加入同等體積的異丙醇，混勻室溫靜置10 min，4 ℃離心10 min。此時RNA沉淀在離心管底部，棄去上層清液，加入1 mL提前預(yù)冷的75%乙醇，彈起沉于底部的RNA，充分洗滌。隨后4 ℃離心5 min。離心后盡量倒干剩余乙醇，洗滌過程重復(fù)2次。待乙醇飛干后，加DEPC水45 μL，溶解RNA。將RNA稀釋100倍，測定稀釋處理后的RNA在波長260 nm處的OD值。按試劑盒要求將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后擴增。引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列：TGF-β1上游引物為5’-GCAACAATTCCTGGCGTTACC-3’，下游引物為5’-ATACCCACCATCACACCCTG-3’；α-SMA上游引物為5’-GGACAGAGAAGATTCGGAGCAT-3’，下游引物為5’-TGACAGGACCAGGAGAAGAGT-3’；E-cadherin上游引物為5’-GGATCAGCGCCTTCAGTTCT-3’，下游引物為5’-AGGGCTAGAAGGGTAGCACA-3’；β-actin上游引物為5’-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3’，下游引物為5’-ATACCCACCATCA-CACCCTG-3’。結(jié)果采用2-ΔΔCT進行相對定量分析。

1.6.7肺組織中TGF-β1、E-cadherin、α-SMA 蛋白表達情況 采用Western blot法測定：提取肺組織蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測量蛋白濃度。樣品蛋白隨后進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育及洗膜、二抗孵育及洗膜、顯影，采用Image J軟件分析各條帶灰度值，用目的基因條帶與內(nèi)參的相對灰度值比值作為蛋白相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般生理狀態(tài)比較 實驗期間對照組大鼠反應(yīng)迅速，活動自如，呼吸平穩(wěn)，體重平穩(wěn)增長，飲食、飲水正常。模型組大鼠精神狀態(tài)萎靡不佳，呼吸急促，甚則喘息，皮毛晦暗枯槁，形體消瘦，后足腫脹，皮膚光亮緊繃，皮色由紅到紫，皮溫升高，后期出現(xiàn)間歇性跛行，甚至關(guān)節(jié)畸形，喪失活動功能，飲食減少，小便增多。與模型組大鼠比較，醋酸潑尼松組及清痹達金方各劑量組大鼠活動增加，精神情況較好，呼吸急促情況有所緩解，后足紅腫減輕，飲食增多。

2.2各組大鼠AI評分比較 造模后，模型組、醋酸潑尼松組及清痹達金方各劑量組大鼠AI評分均大于4分，各組間AI評分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。灌胃7 d后，清痹達金方高劑量組、醋酸潑尼松組大鼠AI評分均明顯低于模型組(P均<0.05)；灌胃14 d后，清痹達金方高、中劑量組和醋酸潑尼松組大鼠AI評分均明顯低于模型組(P均<0.05)，清痹達金方高劑量組和醋酸潑尼松組AI評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎-肺纖維化各組大鼠不同時間點AI評分

2.3各組大鼠足趾容積比較 造模前各組大鼠足趾容積比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；造模后，清痹達金方各劑量組及醋酸潑尼松組大鼠足趾容積均明顯高于對照組(P均<0.05)，各組間足趾容積比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；灌胃14 d后，清痹達金方各劑量組和醋酸潑尼松組大鼠足趾容積均明顯低于模型組(P均<0.05)，清痹達金方高、中劑量組和醋酸潑尼松組足趾容積比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖2。

2.4各組大鼠血清TGF-β1水平比較 模型組大鼠血清TGF-β1水平明顯高于對照組(P<0.05)；清痹達金方各劑量組和醋酸潑尼松組大鼠血清TGF-β1水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，清痹達金方各劑量組間比較及和醋酸潑尼松組血清TGF-β1水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。

圖2 對照組和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎-肺纖維化各組大鼠不同時間點足趾容積

圖3 對照組和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎-肺纖維化各組大鼠血清TGF-β1 水平

2.5各組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn)比較 對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔未見增厚，無明顯炎性細胞浸潤及充血現(xiàn)象；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔大面積消失，肺泡間隔增厚，有充血現(xiàn)象出現(xiàn)；與模型組比較，清痹達金方各劑量組大鼠肺泡間隔較薄，結(jié)構(gòu)相對完整，肺泡壁間隔隨給藥劑量的降低而增厚；醋酸潑尼松組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁略有增厚，肺間質(zhì)偶見充血。見圖4。

2.6各組大鼠肺組織Masson染色表現(xiàn)比較 對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔正常，肺泡壁無增厚，僅有少量淺藍色膠原纖維分布；模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完全消失、無法辨識，肺泡壁增厚變形，出現(xiàn)大量藍色膠原纖維增生；清痹達金方各劑量組大鼠肺泡壁較薄，結(jié)構(gòu)相對完整，肺泡間隔可見藍色膠原纖維，隨著給藥量降低而逐漸增加；醋酸潑尼松組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，偶見肺泡壁增厚與藍色膠原纖維沉積。見圖5。

圖4 對照組和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎-肺纖維化各組大鼠肺組織HE染色病理表現(xiàn)(×200)

圖5 對照組和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎-肺纖維化各組大鼠肺組織Masson染色病理表現(xiàn)(×200)

2.7各組大鼠肺組織中TGF-β1、E-cadherin、α-SMA mRNA表達情況比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織中TGF-β1、α-SMA mRNA相對表達量均明顯升高(P均<0.05)，E-cadherin mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，清痹達金方各劑量組和醋酸潑尼松組大鼠肺組織中TGF-β1、α-SMA mRNA相對表達量均明顯降低(P均<0.05)，清痹達金方高、中劑量組及醋酸潑尼松組大鼠肺組織中E-cadherin mRNA相對表達量均明顯升高(P均<0.05)；清痹達金方高劑量組和醋酸潑尼松組各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖6。

圖6 對照組和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎-肺纖維化各組大鼠肺組織中TGF-β1、E-cadherin、α-SMA mRNA表達情況

2.8各組大鼠肺組織中TGF-β1、E-cadherin、α-SMA蛋白表達情況 與對照組比較，模型組大鼠肺組織中TGF-β1、α-SMA蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05)，E-cadherin蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，清痹達金方各劑量組和醋酸潑尼松組大鼠肺組織中TGF-β1、α-SMA 蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05)，E-cadherin蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05)；清痹達金方高劑量組和醋酸潑尼松組各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖7及圖8。

3 討 論

RA常累及其他系統(tǒng)，肺部因其血管與結(jié)締組織豐富，為RA患者最常見的受累器官。肺部受累的RA患者初期肺部癥狀通常不明顯，后期因合并PF導(dǎo)致呼吸衰竭而死亡，因此合并PF的RA患者預(yù)后差、病死率高[5]。

PF形成過程中以成纖維細胞增殖、肌成纖維細胞活化、細胞外基質(zhì)沉積、最終導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)不可逆改變?yōu)樘卣鱗6-7]，EMT在纖維化過程中起到重要作用[8-10]。EMT是受損的上皮細胞失去細胞間黏附特性、轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞的過程，在此過程中成纖維細胞轉(zhuǎn)化為活化的肌成纖維細胞，肌成纖維細胞是纖維化的主要效應(yīng)細胞。通常上皮細胞通過黏附機制緊密相連，EMT過程中上皮細胞間的黏附性及細胞極性喪失，上皮細胞標(biāo)志物黏附分子E-cadherin表達水平降低，間質(zhì)細胞標(biāo)志物α-SMA表達水平升高[11]。因此可通過E-cadherin和α-SMA的表達水平評估肺纖維化程度。TGF-β信號通路是誘導(dǎo)EMT發(fā)生的重要信號通路，可激活一種或多種EMT驅(qū)動轉(zhuǎn)錄因子，這些因子可直接或間接抑制細胞間黏附分子的表達，使上皮細胞之間失去黏附性。TGF-β1是調(diào)控肌成纖維細胞活化和分化的關(guān)鍵細胞因子[12-13]， E-cadherin、α-SMA是TGF-β1在促進纖維化發(fā)生過程中的重要下游細胞因子，受TGF-β1調(diào)控。

圖7 對照組和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎-肺纖維化各組大鼠肺組織中TGF-β1、E-cadherin、α-SMA蛋白條帶圖

圖8 對照組和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎-肺纖維化各組大鼠肺組織中TGF-β1、E-cadherin、α-SMA 蛋白相對表達量

中藥清痹達金方由防風(fēng)、知母、露蜂房、姜黃、桑白皮、皂角刺6味藥物組成，其作用與西醫(yī)治療RA-PF的調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗纖維化有相似之處。防風(fēng)是治療風(fēng)濕痹痛的核心藥物[14]，其具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、解熱、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用；防風(fēng)中的石油醚提取物能夠降低關(guān)節(jié)炎大鼠血清中促炎因子的表達，減輕滑膜炎癥，進而改善關(guān)節(jié)炎癥狀[15]；防風(fēng)中的升麻素苷能夠?qū)Ψ螕p傷小鼠起到保護作用[16]。知母能夠入肺經(jīng)以潤肺燥，其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤作用[17]；知母中的雙苯吡酮類化合物芒果苷有平喘鎮(zhèn)咳、抗纖維化的功效[18]；知母中的知母皂苷能夠通過抑制TNF-α、IL-6等炎性因子的分泌而發(fā)揮抗炎作用[19-20]，以減輕關(guān)節(jié)及肺部癥狀。露蜂房屬蟲類藥物，具有攻沖走竄之性，能夠消風(fēng)剔邪、緩解僵攣，與祛風(fēng)濕藥相結(jié)合，可增強祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止痹痛之功效。姜黃破血行氣、通絡(luò)止痛，姜黃中的脂溶性多酚類色素姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤等作用[21]，能夠抑制α-SMA的表達[22]，可以通過抑制成纖維細胞和肌成纖維細胞的增殖，減少炎性細胞因子的表達和細胞外基質(zhì)沉積等途徑來發(fā)揮抗纖維化作用[23-24]。桑白皮入肺經(jīng)，是治療肺部疾病的常用藥，桑白皮提取物可通過下調(diào)TGF-β1、α-SMA的表達減輕肺纖維化癥狀[25]。桑根酮C是桑白皮中的一種化學(xué)成分，其能降低小鼠肺組織膠原水平及減少TGF-β1、α-SMA等蛋白表達，減輕博萊霉素誘發(fā)小鼠肺纖維化時炎性細胞的激活和細胞外基質(zhì)的過度沉積[26]。皂角刺有抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗癌的作用[27-28]，皂角刺中的黃顏木素可抑制細胞中炎性因子的表達[29]，還能通過調(diào)節(jié)TGF-β信號通路發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用[30]。清痹達金方中諸藥合用，可對RA-PF起到治療作用。CIA大鼠模型是一種自身免疫性關(guān)節(jié)炎動物模型，在臨床及病理方面與RA存在多種相似之處，如產(chǎn)生自身抗體、滑膜炎性細胞浸潤、滑膜增生、軟骨結(jié)構(gòu)破壞以及骨侵蝕等[31]，因此在實驗研究中被廣泛應(yīng)用。PF在疾病發(fā)展過程中以炎癥進展為纖維化為特征，在動物模型構(gòu)建時，最廣泛使用的誘導(dǎo)劑是博來霉素。博來霉素造成的肺損傷會經(jīng)歷急性損傷及炎癥期、炎癥到纖維化的過渡期、慢性纖維化期，這一疾病進程與人的PF病理過程相似[32]，博來霉素誘導(dǎo)的PF模型常用于相關(guān)研究。因此本實驗以Ⅱ型膠原和博來霉素誘導(dǎo)的CIA-PF大鼠作為研究對象。

本實驗結(jié)果顯示，清痹達金方各劑量組大鼠血清TGF-β1水平及肺組織中TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白相對表達量均明顯低于模型組，清痹達金方高、中劑量組大鼠肺組織中E-cadherin mRNA相對表達量及清痹達金方各劑量組大鼠肺組織中E-cadherin蛋白相對表達量均明顯高于模型組；清痹達金方各劑量組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺纖維化程度較模型組輕。提示清痹達金方可以降低CIA-PF大鼠血清及肺組織內(nèi)TGF-β1的表達水平，并上調(diào)E-cadherin表達，下調(diào)α-SMA表達，從而抑制EMT過程，增加大鼠肺組織上皮細胞黏附性，減少上皮-間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化。綜上所述，清痹達金方可改善CIA-PF大鼠肺組織炎癥及纖維化情況，其作用可能與干預(yù)TGF-β1信號通路及其下游信號分子E-cadherin、α-SMA有關(guān)。TGF-β1是促進纖維化發(fā)生的關(guān)鍵介質(zhì)，清痹達金方通過抑制TGF-β1治療RA-PF對于今后臨床治療具有一定的指導(dǎo)意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。