王建文，丁玉澤，李璐伶，姚新奎，曾亞琦，閆 睛，任萬路，王川坤，孟 軍

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆馬繁育與運動生理重點實驗室/新疆農(nóng)業(yè)大學馬產(chǎn)業(yè)研究院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】馬肉營養(yǎng)價值高[1]，肉馬養(yǎng)殖效益良好，馬匹繁育時代間隔長，選種準確性關(guān)系到馬匹培育質(zhì)量，篩選LPL基因中與伊犁馬肉質(zhì)性狀相關(guān)的突變位點，將研究結(jié)果與傳統(tǒng)選育方法相結(jié)合，有利于加快專門化肉用馬培育進程，對加快肉馬發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase，LPL)屬于脂肪酶基因家族成員，主要由脂肪細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞合成與分泌，在甘油三酯及脂蛋白代謝和運輸中具有重要的作用[2]，廣泛分布于機體的肌肉和脂肪組織中[3]。LPL基因通過對甘油脂代謝、類固醇生物合成等信號通路調(diào)控，影響到脂肪的代謝與合成、沉積[4]。LPL基因在肉質(zhì)及其胴體性狀選擇應(yīng)用廣泛[5]。LPL基因表達較高的部位肌內(nèi)脂肪含量將會有所上升[6]，對羊的研究結(jié)果也與此基本一致[7]，肉品的剪切力較小[8]，肉品的嫩度將得到改善[9]。LPL基因突變有利于肌內(nèi)脂肪的沉積、肉品的嫩度及色澤的改善[10]，豬LPL基因的G117IC位點突變將使得其pH值顯著降低[11]，對于肌肉的成熟及其肉食用品質(zhì)的提升有益。LPL基因的表達與其年齡及飼養(yǎng)條件有一定的關(guān)聯(lián)[12]，LPL基因的表達會對LPL酶活性產(chǎn)生影響，對肌內(nèi)脂肪的水解代謝起到重要的調(diào)節(jié)作用[13]，通過對酶活性的調(diào)節(jié)，影響到肌內(nèi)脂肪的沉積與代謝，使得肉的品質(zhì)得到改善[14-15]?！颈狙芯壳腥朦c】分子生物學方法已廣泛應(yīng)用于其它家畜選種方面，但在專門化用途馬培育方面的研究相對較少。需研究伊犁馬脂蛋白脂酶基因多態(tài)性及其對肉質(zhì)性狀的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究以伊犁馬為主要研究對象，測定LPL基因序列及其肉質(zhì)性狀，研究伊犁馬LPL基因多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀之間的關(guān)系，篩選與伊犁馬肉質(zhì)性狀相關(guān)的LPL基因多態(tài)位點，為專門化肉用馬分子選育提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 馬 匹

選取41匹健康成年、伊犁馬為研究對象，馬匹膘情中等、無顯著親緣關(guān)系。馬匹由伊犁哈薩克自治州昭蘇馬場提供。采用枸櫞酸鈉抗凝管采集頸靜脈血液樣本5 mL，混勻后置于-18℃冰箱待用。對所選馬匹禁食24 h、禁水12 h后屠宰，立即采集三角肌、背闊肌、臂三頭肌、腹外斜肌和臀中肌5個部位肌肉樣本，成熟24 h后置于-18℃保存待用。

1.1.2 引物設(shè)計與PCR擴增

參照GenBank中公布的純血馬LPL基因序列(登錄號：NC_009145.3)中第1外顯子、第3外顯子、第4外顯子和第10外顯子序列為目標片段，采用Primer軟件進行引物設(shè)計，所設(shè)計引物由上海生工根據(jù)設(shè)計引物序列進行引物合成。表1

1.2 方 法

1.2.1 PCR擴增與基因多態(tài)性檢測

本試驗采用降落PCR法進行擴增，具體程序為：95℃預變性3 min，94℃變性30s，63℃退火45s，每個循環(huán)降低0.5℃，72℃延伸1 min，共計10個循環(huán)；而后94℃變性30s，退火45s，72℃延伸1 min，共計30個循環(huán)，72℃修復延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1.5% TAE瓊脂糖電泳進行檢測。表2

表1 LPL基因引物基本信息

1.2.2 肉質(zhì)性狀檢測

對所采集的肉樣在4℃環(huán)境中排酸24 h后測定肉質(zhì)性狀。在4 000 r/min條件下離心20 min，測定肉樣系水力；在水浴鍋中將肉樣隔袋水煮30 min測定肉樣熟肉率；將煮熟的肉樣沿肌纖維方向修整為橫截面積為1 cm2的長條，采用物性儀測定肉樣剪切力，每個樣本重復測定10次，取最接近3次測定樣本平均值為該肉樣的剪切力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將符合條件的PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工采用雙向測序法進行測序，檢測結(jié)果采用DNAStar軟件校正，并與純血馬LPL基因序列(登錄號：NC_009145.3)比對，采用BLAST確定突變位點及基因型。

采用HaploView 4.2軟件對基因數(shù)據(jù)分析群體遺傳學，運用Excel軟件整理肉質(zhì)性狀，根據(jù)基因型進行分組，采用SPSS 18.0軟件對肉質(zhì)性狀數(shù)據(jù)進行獨立樣本T檢驗，結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPC基因引物PCR擴增

研究表明，各電泳條帶清晰明亮，且無拖尾與雜帶現(xiàn)象發(fā)生。第1泳道為第3外顯子擴增產(chǎn)物，擴增片段長度約785 bp，第2泳道為第1外顯子擴增產(chǎn)物，擴增片段長度約664 bp，第3泳道為第10外顯子擴增產(chǎn)物，擴增片段長度約515 bp，第4泳道為第4外顯子擴增片段，擴增片段長度約621 bp，各擴增片段長度均與目的片段長度相一致。圖1

注：第1泳道為第3外顯子，第2泳道為第1外顯子，第3泳道為第10外顯子，第4泳道為第4外顯子

2.2 LPC基因測序同譜對比

研究表明，共計檢測出2個SNP位點，其中第1個SNP位點位于第1外顯子和第2外顯子中間的內(nèi)含子區(qū)域：g.715T>C，共檢測出2種基因型(TT基因型和TC基因想)；另一個SNP位點位于第4外顯子和第5外顯子中間的內(nèi)含子區(qū)域：g.12074C>A，共檢測出2種基因型(CC基因型和AC基因型)。圖2

圖2 LPL基因測序圖譜

2.3 伊犁馬LPL基因多態(tài)位點遺傳學

研究表明，g.715T>C突變位點的優(yōu)勢基因型為TT基因型，優(yōu)勢等位基因為T；g.12074C>A突變位點的優(yōu)勢基因型為CC基因型，優(yōu)勢等位基因為C；χ2所檢測出的兩個位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。所檢測出的2個突變位點均為低度多態(tài)位點(PIC<0.25)。表3，表4

表3 LPL基因不同突變位點基因型及基因頻率

表4 LPL基因不同突變位點遺傳學特性

2.4 伊犁馬LPL基因不同基因型對肉質(zhì)性狀的影響

研究表明，g.715T>C突變位點而言，在三角肌中TT基因型剪切力顯著高于TC基因型(P<0.05)；在背闊肌中TT基因型失水率顯著高于TC基因型(P<0.05)，剪切力極顯著高于TC基因型(P<0.01)；在臂三頭肌中TT基因型失水率極顯著低于TC基因型(P<0.01)；在腹外斜肌中TT基因型剪切力極顯著低于TC基因型(P<0.01)；在臀中肌中TT基因型失水率和剪切力顯著高于TC基因型(P<0.05)。g.12074C>A突變位點，在三角肌中CC基因型熟肉率顯著高于CA基因型(P<0.05)；在背闊肌中CC基因型失水率顯著低于CA基因型(P<0.05)；在臂三頭肌中CC基因型失水率極顯著低于CA基因型(P<0.01)，熟肉率和剪切力極顯著高于CA基因型(P<0.01)；在腹外斜肌中基因型剪切力極顯著高于CA基因型(P<0.01)，失水率和熟肉率顯著低于CA基因型(P<0.05)；在臀中肌中失水率CC基因型極顯著低于CA基因型(P<0.01)。表5

表5 伊犁馬LPL基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)

3 討 論

LPL基因在機體內(nèi)各主要器官、組織中均有表達，在各種脂類代謝中起著重要作用[16]，LPL基因突變將導致其編碼的蛋白活性發(fā)生變化，從而影響到其結(jié)構(gòu)與功能，對動物肉品質(zhì)產(chǎn)生影響[17]。馬LPL基因位于2號染色體，編碼471個氨基酸，共有10個外顯子[18]，試驗對伊犁馬的4個外顯子及其附近內(nèi)含子區(qū)域進行多態(tài)性檢測，共檢測出2個內(nèi)含子突變。大約每644～891 bp就會出現(xiàn)一個突變位點[19]，所檢測出突變的擴增產(chǎn)物片段大小與此基本一致，通過比對序列顯示，2個突變均為該基因突變位點。所檢測出的2個突變位點均為內(nèi)含子突變，且為新發(fā)現(xiàn)突變位點，可能是由于該基因在馬匹方面的研究較少，暫時未能發(fā)現(xiàn)該突變位點；可能是由于品種因素的影響[20]，伊犁馬為我國自主培育品種，在其培育過程中曾引入部分品種對其進行改良，也可能是其出現(xiàn)新突變位點的因素之一[21]。χ2檢驗結(jié)果顯示，這兩個突變位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，該群體基因型頻率和基因頻率具有較好的穩(wěn)定性，遺傳變異度相對較小，在后期人工定向選擇時具有較大的潛力[22]。

研究將檢測出的2個突變位點與伊犁馬肉質(zhì)性狀進行關(guān)聯(lián)性分析，研究結(jié)果顯示g.715T>C和g.12074C>A突變位點在臂三頭肌、背闊肌和臀中肌中兩種基因型之間失水率均呈現(xiàn)出顯著差異性，相關(guān)研究結(jié)果顯示，失水率越低則肉質(zhì)越好[23,24]，這2個突變位點對伊犁馬肉品質(zhì)產(chǎn)生一定影響，在選育的過程中可以加以利用；但在三角肌中差異不顯著，可能是由于試驗中所選擇的樣本量相對較小所致，還需要加大樣本量進行證實。熟肉率是肉品加工過程中的重要評價指標之一，熟肉率高則表明在加工過程中其失水較少，肉品的多汁性較好[2]，g.12074C>A突變位點三角肌和臂三頭肌中CC基因型熟肉率較高，顯示出該突變位點CC基因型肉品加工效率較好，在選育的過程中可以考慮以該基因型為主。g.715T>C位點背闊肌、腹外斜肌中剪切力呈極顯著差異，三角肌、臀中肌中剪切力呈顯著差異；g.12074C>A臂三頭肌、腹外斜肌中剪切力呈極顯著差異，造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于這兩個突變位點雖然位于內(nèi)含子區(qū)域，不會對蛋白質(zhì)中氨基酸產(chǎn)生影響，但可能參與到該基因的表達調(diào)控或與其相關(guān)的功能基因一起產(chǎn)生影響，影響到該基因的表達，影響到該蛋白質(zhì)的生理活性，導致其剪切力產(chǎn)生了一定的差異，但具體的原因還有待于進一步的機理性研究加以證實。對牛的研究結(jié)果顯示，LPL基因表達量較高的部位其肌內(nèi)脂肪含量會有所上升[25]，此時該部位肉品的剪切力會有所下降[26]，使得肉品的嫩度得到改善[27]，對羊的研究結(jié)果也可得到與此類似的結(jié)論[28]。g.12074C>A突變位點臂三頭肌和腹外斜肌中CC基因型極顯著高于CA基因型，該突變位點對伊犁馬肉的嫩度會產(chǎn)生較大的影響，在對肉用馬的選育過程中。研究中所檢測出突變位點未能在部分部位中對所檢測指標產(chǎn)生影響，可能是由于部位因素的影響，也可能是因為所檢測樣本量較少所致，在今后的研究中可加大樣本量進一步加以驗證。

4 結(jié) 論

在伊犁馬LPL基因中共檢測出g.715T>C和g.12074C>A兩個突變位點，均為低度多態(tài)位點且為Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。g.715T>C位點兩種基因型臂三頭肌失水率呈極顯著差異，背闊肌、臀中肌失水率呈顯著差異；背闊肌、腹外斜肌中剪切力呈極顯著差異，三角肌、臀中肌中剪切力呈顯著差異。g.12074C>A位點兩種基因型臂三頭肌、臀中肌中失水率呈極顯著差異，背闊肌、腹外斜肌中失水率呈顯著差異；臂三頭肌中熟肉率呈極顯著差異，三角肌、腹外斜肌中熟肉率呈顯著差異；臂三頭肌、腹外斜肌中剪切力呈極顯著差異。2個突變位點對伊犁馬肉質(zhì)會產(chǎn)生一定影響，是影響伊犁馬肉質(zhì)性狀的可能候選功能基因位點。

參考文獻(References)

[1] 閆睛,孟軍,王建文,等.伊犁馬不同部位肉食用品質(zhì)與脂肪酸組成差異性分析[J].新疆農(nóng)業(yè)科學,2020,57(2):357-364.

YAN Jing, MENG Jun, WANG Jianwen, et al. Difference analysis of meat edible quality and fatty acid composition in different parts of Yili horses [J].XinjiangAgriculturalSciences, 2020, 57(2):357-364.

[2] 高鴻蒙,張秀英,張慧澤,等.烏珠穆沁羊LPL基因第3外顯子多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報,2019,27(3):449-455.

GAO Hongmeng, ZHANG Xiuying, ZHANG Huize, et al. Association analysis between polymorphism in the exon 3 ofLPLgene and meat quality Traits in Ujimqin sheep (Ovis aries) [J].JournalofAgriculturalBiotechnology, 2019, 27(3):449-455.

[3] 方程.隆林黃牛、荷斯坦牛和西林水牛的肉質(zhì)、肌纖維和酶活性差異的研究[D].南寧:廣西大學,2018.

FANG Cheng.Studyonthedifferencesofmeatquality,musclefiberandenzymeactivityofLonglincattle,HolsteinCattleandXilinbuffalo[D]. Nanning: Guangxi University, 2018.

[4] Mu X, Cui X, Liu R, et al. Identification of differentially expressed genes and pathways for abdominal fat deposition in ovariectomized and Sham-operated Chickens[J].Genes, 2019, 10(2):155-160.

[5] Abd E M E, Abdelnour S A, Swelum A A, et al. The application of gene marker-assisted selection and proteomics for the best meat quality criteria and body measurements in Qinchuan cattle breed [J].MolecularBiologyReports, 2018, 45(5):1445-1456.

[6] Adoligbe C, Huangfu Y F, Zan L S, et al. C/EBPα gene as a genetic marker for beef quality improvement[J].GeneticsandMolecularResearch, 2015, 14(3):9370-9383.

[7] Li H, Wang H, Yu L, et al. Effects of supplementation of rumen-protected choline on growth performance, meat quality and gene expression inner, longissimus dowser, muscle of lambs [J].ArchivesofAnimalNutrition, 2015, 69(5):340-350.

[8] Liu Y, Ma T, Du W H, et al. Gene’s expression related to intramuscular fat deposition in muscles of small Tail Han sheep [J].JournalOfAnimalAndVeterinaryAdvances, 2012, 11(21): 3969-3977.

[9] Urrutia O, Mendizabal J A, Insausti K, et al. Effects of Addition of Linseed and Marine Algae to the diet on adipose tissue development, fatty acid profile, lipogenic gene expression, and meat quality in lambs[J].PlosOne, 2016, 11(6):e0156765.

[10] Wang W, Xue W, Zhou X, et al. Effects of candidate genes’ polymorphisms on meat quality traits in pigs [J].ActaAgriculturaeScandinavica,SectionA—AnimalScience, 2012, 62(3):120-126.

[11] Zhang B Z, Lei M G, Deng C Y, et al. Association between PCR-RFLP Polymorphism of the fifth intron in lipoprotein lipase gene and productive traits in pig resource family [J].Asian-AustralasianJournalofAnimalSciences, 2005, 18(18):458-462.

[12] Milka V, Marko C, Matja? U, et al. Age-Dependent expression of MyHC Isoforms and lipid metabolism-related genes in the longissimus dorsi muscle of wild and domestic pigs [J].Animals, 2019, 9(1):10-21.

[13] Zappaterra M, Deserti M, Mazza R, et al. A gene and protein expression study on four porcine genes related to intramuscular fat deposition [J].MeatScience, 2016, (121):27-32.

[14] Xiao H B, Wang J Y, Sun Z L. Icariin Changes ANGPTL3 expression and LPL activity to improve meat quality in Swine [J].JournalofAnimalAndVeterinaryAdvances, 2012, 11(9):1450-1454.

[15] Wu W. Betaine enhances skeletal muscle cell lipid accumulation by promoting adipogenic genes expression [J].JournalofAnimalScience, 2017, (95):175.

[16] Emmerich J, Beg O U, Peterson J, et al. Human lipoprotein lipase. Analysis of the catalytic triad by site-directed mutagenesis of Ser-132, Asp-156, and His-241[J].JournalofBiologicalChemistry, 1992, 267(6):4161-4165.

[17] Lei M G, Xiong Y Z, Deng C Y, et al. Sequence variation in the porcine lipoprotein lipase gene[J].AnimalGenetics, 2004, 35(5): 422-423.

[18] Hestand M S, Kalbfleisch T S, Coleman S J, et al. Annotation of the protein coding regions of the equine genome[J].PlosOne, 2015, 10(6):e0124375.

[19] Orlando L, Ginolhac A, Zhang G, et al. Recalibrating equus evolution using the genome sequence of an early Middle Pleistocene horse[J].Nature, 2013, 499(7456):74-80.

[20]孫亞偉,加依娜古麗·吐爾遜拜,張永鵬,等.新疆褐牛瘦素基因第2外顯子多態(tài)性與肉品質(zhì)性狀的相關(guān)性[J].西北農(nóng)業(yè)學報,2021,(2):1-9.

SUN Yawei, Jiayinaguli Turersun, ZHANG Yongpeng, et al. Correlation analysis between polymorphisms of Leptin gene exon2 and the meat qualitative traits in Xinjiang brown cattle [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica, 2021,(2): 1-9.

[21] 王建文,李林玲,王鏡力,等.伊犁馬ACTN3基因外顯子多態(tài)性研究[J].畜牧獸醫(yī)學報,2018,49(6):1299-1306.

WANG Jianwen, LI Llinling, WANG Jinli, et al. Analysis onACTN3 gene exon polymorphism of Yili horse [J].ChineseJournalofAnimalandVeterinarySciences, 2018, 49(6):1299-1306.

[22] 王燕燕,容維中,徐建峰,等.早勝牛CD36基因第4外顯子多態(tài)性與生長性狀相關(guān)性分析[J].中國草食動物科學,2020,40(3):17-21.

WANG Yangyan, RONG Wweizhong, XU Jianfeng, et al. Analysis of the association between polymorphisms of CD36 gene and growth traits in Zaosheng cattle [J].ChinaHerbivoreScience, 2020, 40(3):17-21.

[23] 韋克林,胡天龍,李坤.肌內(nèi)脂肪、脂肪酸與豬肉肉質(zhì)三者關(guān)系研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2012,28(11):50-51, 66.

WEI Keling, HU Tianlong, LI Kun. Research progress on relationship between intramuscular fat, fatty acid and pig meat quality [J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine, 2012, 28(11):50-51, 66.

[24] 鄒華鋒,文美英,魏星華,等.生豬宰前不同靜養(yǎng)時間和屠宰方式對背長肌肌肉pH值和滴水損失的影響[J].肉類工業(yè),2013,(5):19-21.

ZOU Huafeng, WEN Meiying, WEI Xinhua, et al. Effects of different resting time beforepig slaughtering and slaughtering methods on pH valueand drip loss of porcine longissimus muscle[J].MeatIndustry, 2013,(5):19-21.

[25] Adoligbe C, Huangfu Y F, Zan L S, et al. C/EBPα gene as a genetic marker for beef quality improvement[J].GeneticsandMolecularResearch, 2015, 14(3):9370-9383.

[26] Liu Y, Ma T, Du W H, et al. Genes expression related to intramuscular fat deposition in muscles of small Tail Han sheep [J].JournalofAnimalandVeterinaryAdvances, 2012, 11(21): 3969-3977.

[27] Urrutia O, Mendizabal J A, Insausti K, et al. Effects of Addition of Linseed and Marine Algae to the diet on adipose tissue development, fatty acid profile, lipogenic gene expression, and meat quality in lambs [J].PlosOne, 2016, 11(6):e0156765.

[28] Li H, Wang H, Yu L, et al. Effects of supplementation of rumen-protected choline on growth performance, meat quality and gene expression inner, longissimus dowser, muscle of lambs[J].ArchivesofAnimalNutrition, 2015, 69(5):340-350.