侯晨曦，洪文娟，何宗龍，決肯·阿尼瓦什

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830000)

0 引 言

【研究意義】羊毛是重要的紡織原材料[1]。毛色是綿羊重要的外觀表型特性，在品種鑒定、特征描述等起著重要作用[2]。新疆綿羊品種，巴什拜羊是具有代表性的優(yōu)質(zhì)品種之一，其毛色主要為棕紅色，少量為青灰色、白色等顏色，雖為粗毛羊，但具有產(chǎn)毛量大，絨毛含量高，被毛光澤好等優(yōu)點，具有較高的毛用價值[2]。研究巴什拜羊毛色的形成，對更好利用天然毛色提高其經(jīng)濟價值具有重要意義。【前人研究進展】綿羊毛色形成過程比較復雜，但其主要受遺傳因素影響。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了300多個基因座和150多個已識別的毛色相關(guān)基因[4]。這些毛色相關(guān)基因通過調(diào)控黑色素細胞產(chǎn)生的真黑素和褐黑素的分布和數(shù)量來影響綿羊的被毛顏色[5]。Wnt/β-catenin信號通路是毛色形成的重要通路，能夠抑制黑色素的合成以及運輸[6]。淋巴增強因子-1(Lymphoid enhancer factor 1，LEF1)是這條通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，Van Genderen C等[7]研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠皮膚組織LEF1后，小鼠由于毛囊中黑色素生成失敗而呈現(xiàn)淺色。LEF1基因在毛囊發(fā)育與再生過程中均有表達，對毛色的形成有重要影響。在正常細胞中，DNA確保和調(diào)節(jié)基因的適當表達以及穩(wěn)定基因的沉默，調(diào)節(jié)基因組的功能，改變遺傳表現(xiàn)，對毛色的形成過程也有重要的調(diào)控作用[8]?！颈狙芯壳腥朦c】目前對于在毛色基因的研究比較深入，但對LEF1基因的研究，特別對棕紅色與青灰色間LEF1基因的表達研究均較少。需分析LEF1基因在紅棕色與青灰色巴什拜羊皮膚組織中DNA甲基化與mRNA的表達水平。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用亞硫酸氫鹽修飾分析巴什拜羊皮膚組織中LEF1基因的甲基化水平，分別從表觀遺傳和分子遺傳兩個方面來分析皮膚組織中LEF1基因的DNA甲基化水平與mRNA表達量之間的關(guān)系，探討LEF1基因的DNA甲基化水平對不同毛色的影響，了解DNA甲基化對LEF1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，篩選與毛色相關(guān)的表觀遺傳標記。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗羊

試驗動物選取新疆塔城地區(qū)裕民縣紅棕色與青灰色周歲巴什拜羊各12只，個體間體重相近，健康無疾病，取其左肩胛部的皮膚組織，大小約為0.6 cm2。將皮膚組織樣本置于液氮中運輸保存，用于RNA和DNA的提取。

1.1.2 主要試劑

Trizol總RNA抽提試劑、Trizol總RNA抽提試劑、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒、TB Green Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒、瓊脂糖、EZ DNA Methylation-GoIdTMKit、膠純化試劑盒、pMD19-T Vector Cloning Kit、DH5α感受態(tài)細胞等。

1.2 方 法

1.2.1 總DNA的提取與亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA

取巴什拜羊皮膚組織10～30 mg于研缽中研磨至粉末狀，采用酚-氯仿抽提法對不同毛色巴什拜羊的皮膚樣組織提取總DNA。將純度與濃度檢測合格后的DNA按照EZ DNA Methylation-GoIdTMKit試劑盒說明書對基因組DNA進行處理。

1.2.2 CpG島預測及引物設計

使用Chormas軟件打開巴什拜羊LEF1基因亞硫酸氫鹽處理后的測序峰圖，對測序結(jié)果與LEF1基因原始序列進行比對，統(tǒng)計LEF1基因甲基化位點中的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶(T)的位點。通過在線軟件MethPrimer(http://www.urogene.org/methprimer/)對LEF1基因甲基化位點的預測分析。根據(jù)NCBI上的GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)數(shù)據(jù)庫中查詢的綿羊β-actin、LEF1的基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件、Methprimer在線軟件與BLAST在線網(wǎng)頁進行熒光定量引物、BSP的設計，確保以保證引物的特異性后，最終由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表1

表1 熒光定量與BSP擴增引物

1.2.3 PCR擴增及產(chǎn)物純化

將EZ DNA Methylation-GoldTMKit試劑盒修飾后的DNA進行PCR擴增反應。對PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，確定片段大小后，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(天根)對產(chǎn)物進行純化。純化后的產(chǎn)物與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)12～16 h，挑取培養(yǎng)板上的白色單菌落，在1.5 mL的含Amp的LB液體培養(yǎng)基中200 r/min過夜培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁；對菌液進行PCR檢測，鑒定其產(chǎn)物片段與目的片段一致后，將樣本送至公司測序。表2，表3

表2 PCR擴增反應體系

1.2.4 LEF1基因在不同毛色巴什拜羊皮膚組織中的mRNA表達

試劑與用量為cDNA 2 μL，PCR Forward/Reverse Primer(10 μmol/L)各1 μL，TB Green Premix ExTaqII 12.5 μL，Rnase-Free ddH2O 8.5 μL。擴增程序為95℃ 3 min，95℃ 5s，最適溫度58℃ 30s，40個循環(huán)，95℃ 10s，65℃ 5s，95℃ 5s。擴增結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠檢測產(chǎn)物片段大小是否與預期的基因片段大小一致。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2019對數(shù)據(jù)進行整理，將每個樣品的3次重復中差異較大的數(shù)值去除，運用相對表達量計算公式F=2-△△CT計算相對表達量，并運用SPSS統(tǒng)計分析軟件單因素方差分析目的基因在紅棕色與青灰色巴什拜羊皮膚組織中的表達差異，使用Graph Prime 8軟件繪制柱形圖。

表3 PCR擴增反應程序

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA與RNA質(zhì)量檢測

研究表明，用酶標儀對提取出紅棕色與青灰色巴什拜羊皮膚組織總RNA進行濃度與純度的檢測，檢測結(jié)果顯示，總RNA的濃度在100 ng/μL以上，純度均在1.8～2.0，通過結(jié)果可知總RNA的濃度與純度均較好；用瓊脂糖凝膠電泳對總RNA進行完整性檢測，總RNA完整性較好，可以進行反轉(zhuǎn)錄試驗。圖1

2.2 PCR擴增結(jié)果

研究表明，利用LEF1基因的甲基化引物以甲基化修飾后的DNA為模板進行PCR擴增，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物檢測，產(chǎn)物的片段大小為160 bp，與目的片段大小一致。圖2

圖1 總RNA檢測結(jié)果

注：M：1 kb Plus DNA Marker；1～8：LEF1基因

2.3 測序結(jié)果統(tǒng)計與序列比對

研究表明，巴什拜羊LEF1基因啟動子區(qū)的DNA序列存在1個從1 642 bp～1 801 bp的甲基化密集區(qū)域，長度為160 bp，CPG位點為14個，分別在目的片段的第31、39、44、57、74、91、94、101、103、105、114、123、129和136 bp處。圖3

圖3 LEF1基因的甲基化區(qū)域預測序列

2.4 LEF1基因的DNA甲基化模式

研究表明，共有7個CpG位點。LEF1基因在兩種毛色巴什拜羊中的甲基化概率均較低，紅棕色巴什拜羊皮膚組織中的甲基化率為4.29%，在青灰色巴什拜羊皮膚組織中的甲基化率為2.86%。不同毛色的啟動子區(qū)甲基化CpG位點不同，紅棕色巴什拜羊的啟動子區(qū)CpG位點為CpG4、CpG6、CpG14，青灰色為CpG1、CpG3、CpG7、CpG14。圖4，圖5

圖4 LEF1基因甲基化區(qū)域測序峰

注：●：表示發(fā)生甲基化；○：表示未發(fā)生甲基化

2.5 LEF1基因在紅棕色與青灰色巴什拜羊皮膚組織中表達量

研究表明，LEF1基因在青灰色巴什拜羊皮膚組織中的表達量極顯著高于紅棕色(P< 0.01)，并且LEF1基因mRNA表達趨勢與甲基化水平呈顯著負相關(guān)(P< 0.05)，表明LEF1基因的DNA甲基化對其表達量具有一定的負調(diào)節(jié)作用。圖6

圖6 紅棕色與青灰色巴什拜羊羊皮膚組織中LEF1基因的表達量

3 討 論

哺乳動物毛色的變化是由褐黑素和真黑素的生化功能、數(shù)量、分布和可用性決定的，而黑色素細胞的數(shù)量通常是不變的[9]。褐黑素使哺乳動物產(chǎn)生紅棕色和黃色的毛色或膚色表型，而真黑素使哺乳動物產(chǎn)生黑色和棕色的毛色或膚色表型[10]。LEF1基因參與兩種黑色素的生成過程，在毛囊發(fā)育與再生過程中均有表達，當敲除LEF1時，小鼠在毛發(fā)和胡須的形成方面會有缺陷[11]。Catherine A等[12]研究發(fā)現(xiàn)，當淋巴增強子結(jié)合因子(LEF1)的結(jié)合位點改變時，會降低培養(yǎng)LEF1反應性和增強子活性，從而使小鼠在毛發(fā)色素沉著方面表現(xiàn)出顯著差異。Adam M.M等[13]通過轉(zhuǎn)錄組學對高度多型毒蛙顏色和模式的研究發(fā)現(xiàn)，LEF1基因參與黑素細胞分化和發(fā)育以及黑色素的生成。Song等[14]研究發(fā)現(xiàn)，LEF1基因黑色水貂中的表達量低于白色水貂，表達水平經(jīng)qRT-PCR驗證，結(jié)果與RNA-seq分析一致，說明LEF1基因與水貂兩種毛色的形成有關(guān)。研究中LEF1基因在青灰色巴什拜羊皮膚組織中的表達量高于紅棕色巴什拜羊皮膚組織中的表達量且高于紅棕色表達量的3倍，這個結(jié)果與楊磊等[15]對不同毛色羊駝皮膚組織中LEF1的表達量結(jié)果基本一致。

DNA甲基化是表觀遺傳修飾中最為常見的修飾方式，普遍發(fā)生于動植物等真核生物體內(nèi)以及細菌等原核生物體內(nèi)[16]。隨著DNA甲基化研究的不斷深入，DNA甲基化的應用領(lǐng)域也不斷增多，如基礎研究中的癌癥、發(fā)育生物學與干細胞分化等方面的研究，對改良畜禽新品種有重要意義[17]。基因啟動子區(qū)的甲基化水平對基因表達量具有調(diào)節(jié)作用[18]。曼則熱·朱爾丁等[19]研究發(fā)現(xiàn)哈薩克羊脂肪組織中的MSTN基因甲基化概率高于肌肉組織。劉亮等[20]對膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織中miR-133a的表達與甲基化水平的研究，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化對miR-133a的表達具有負調(diào)節(jié)作用。CHEN等[21]通過對非腫瘤組織與腎細胞癌組織中miR-766-3p的比較，發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)高度甲基化的腎細胞癌組織中，miR-766-3p的表達量低于非腫瘤組織，表明DNA的甲基化抑制其表達。黃永震[22]對中國地方黃牛IGF2和ZBED6基因的研究發(fā)現(xiàn)，在2個發(fā)育時期6中組織中mRNA表達量和甲基化水平呈現(xiàn)負相關(guān)。研究中LEF1基因在紅棕色與青灰色皮膚組織中甲基化水平均較低，但紅棕色甲基化水平高于青灰色，而紅棕色皮膚組織中LEF1基因的表達量低于青灰色巴什拜羊，這與DNA啟動子區(qū)甲基化水平與基因表達呈負相關(guān)結(jié)果一致，推測巴什拜羊皮膚組織中LEF1基因通過DNA甲基化修飾調(diào)節(jié)基因的表達，調(diào)控巴什拜羊的毛色。

4 結(jié) 論

共有14個CPG位點，兩種毛色的甲基化概率分別為4.29%與2.86%，同時LEF1基因在青灰色的表達量極顯著高于紅棕色(P< 0.01)，LEF1基因啟動子區(qū)的DNA甲基化水平與mRNA表達量呈顯著的負相關(guān)(P< 0.05)，DNA甲基化水平對紅棕色與青灰色巴什拜羊的毛色形成具有調(diào)節(jié)作用，可作為一個候選的毛色遺傳標記。

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