李靜 裴建贏 劉倩 王文第 金玉霞 毛寶宏

1甘肅省婦幼保健院（蘭州 730050）；2蘭州大學(xué)第二醫(yī)院（蘭州 730020）

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）病因復(fù)雜，發(fā)生率約占1%～5%［1］，嚴重影響著我國育齡期女性的生殖健康［2-3］。其中仍有約50%，其發(fā)病機制至今尚未完全明確，稱作原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexpected recurrent spontaneous abortion，URSA）。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）主要由單核巨噬細胞分泌的一類促炎因子，它與URSA的相關(guān)性是目前研究的熱點且研究結(jié)果存在分歧［4］。對于基因-環(huán)境之間的潛在關(guān)系，廣義多因子降維法（generalized multifactor dimensionality reduction，GMDR）［5-6］被越來越多地用來發(fā)現(xiàn)復(fù)雜疾病潛在的生物學(xué)途徑。目前有關(guān)基因-基因交互作用與URSA相關(guān)性的研究較少。因此，本研究擬基于GMDR模型探討 TNF-α 基因-308G/A（rs1800629）和-238G/A（rs361625）兩個單核苷酸多態(tài)性位點與URSA人群危險性的關(guān)系，為蘭州地區(qū)人群URSA的病因的尋找及后期制定干預(yù)措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究收集2019年1月至2020年8月在我院門診就診的URSA患者150例為病例組，年齡19～41歲；納入標準：（1）流產(chǎn)次數(shù)≥ 2次；（2）甲狀腺激素、胰島素、性激素等內(nèi)分泌檢查正常；（3）無高血壓、糖尿病、風(fēng)濕免疫性疾病、家族遺傳病史；（4）夫婦雙方無近親結(jié)婚，染色體均未見異常；（5）免疫學(xué)相關(guān)抗體篩查（抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體、抗β2-糖蛋白Ⅰ抗體）正常。對照組為無自然流產(chǎn)史、早產(chǎn)史和妊娠高血壓病史并且至少成功分娩1次一名健康足月兒，年齡20～40歲，兩組比較年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究已經(jīng)獲得本院倫理委員會批準［編號：［2018］院倫審研第（3號）］，研究對象均簽訂知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般情況調(diào)查、標本采集及基因組DNA提取 對納入人群統(tǒng)一行面對面調(diào)查問卷，獲取一般人口學(xué)特征、生育史、環(huán)境暴露史及相關(guān)生活行為特征。采集外周靜脈血5 mL，提取基因組DNA，并檢測提取DNA濃度和純度。

1.2.2 TNF基因SNP測定 深圳華大有限公司設(shè)計本次實驗PCR擴增引物（正向：5'-CTTTCTGAAGCCCCTCCCAGTT-3'，22 bp；反向：5'-GTTGGGGACACACAAGCATCAA-3'，22 bp）及多重單堿基延伸反應(yīng)延伸引物（正向：5'-TGAAGACCCCCCTCGGAATC-3'，20 bp；反向：5'-TTTTTTGGAGGCTGAACCCCGTCC-3'，24 bp），并采用 SNaPshot技術(shù)進行基因分型實驗。多重PCR反應(yīng)體系（20 μL）包含去離子水 5 μL，2x GC-I buffer（Takara.）10 μL，3.0 mmol/L Mg2+0.4 μL，0.3 mmol/L dNTP 2.4 μL，1 U HotStarTaq polymerase（Qiagen Inc。）0.2 μL，樣本DNA1 μL和多重PCR引物1 μL。PCR循環(huán)程序：95℃ 2 min；94℃ 20 s、65℃和-0.5℃/cycle 40 s、72℃1.5 min，共11個循環(huán)；94℃ 20 s、59℃ 30 s、72℃ 1.5 min，24個循環(huán)；72℃ 2 min、4℃保存。PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的HotStarTaq進行多重PCR獲得，然后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進行延伸反應(yīng)。延伸反應(yīng)后純化，經(jīng)ABI3730XL測序檢測，收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper4.1（AppliedBiosystems，USA）來分析并輸出結(jié)果。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 通過SAS 9.4（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）軟件進行分析。正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料比較用χ2檢驗。雙側(cè)檢驗水準α=0.05。采用二分類logistic回歸分析法分析TNF基因型頻率及其在顯性模型和隱性模型下與uRSA的關(guān)聯(lián)性。應(yīng)用SNPStats在線平臺（https：//www.snpstats.net/start.htm.）進行連鎖不平衡分析和單體型及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。基因型與環(huán)境危險因素交互作用應(yīng)用GMDR進行模型構(gòu)建和分析。

2 結(jié)果

2.1 基本情況及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測

病例組學(xué)歷水平低于對照組，且是從事體力活動者易發(fā)生uRSA，輕中重度趨勢相同（P＜0.05），兩組在年齡、民族、家庭收入、居住環(huán)境、體質(zhì)指數(shù)、吸煙、飲酒喝茶、環(huán)境危險因素暴露分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。TNF基因rs1800629、rs361525位點在病例組和對照組均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（均P＞0.05）。

表1 研究對象一般特征分布Tab.1 Distribution of basic characteristics of the study population 例（%）

2.2 TNF基因基因型和等位基因分布比較及遺傳模式分析 二分類logistic分析結(jié)果顯示，校正年齡、教育、居住地、職業(yè)、工作屬性、吸煙、接觸高危因素、運動等協(xié)變量后，在共顯性、顯性和隱性遺傳模式以及等位基因模式下，TNF基因rs1800629、rs361525位點均未發(fā)現(xiàn)與URSA發(fā)病風(fēng)險增加有關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組多態(tài)性位點基因型和等位基因分布比較及遺傳模式分析Tab.2 The comparison of SNPs's genotype，allele frequency and genetic model analysis in two groups例（%）

2.3 按流產(chǎn)次數(shù)進行分層分析 按流產(chǎn)次數(shù)進行分層分析，結(jié)果顯示在所有遺傳模型中，rs1800629位點不同流產(chǎn)次數(shù)下均未發(fā)現(xiàn)與URSA發(fā)病風(fēng)險增加有關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在顯性遺傳模式中，rs361525位點G/A-A/A基因型攜帶者顯著增加2次RSA的發(fā)生風(fēng)險（ORa=2.526，95%CI：1.03～6.19）；且在等位基因模式下，A等位基因攜帶者顯著增加2次RSA的發(fā)生風(fēng)險（ORa=2.402，95%CI：1.041～ 5.545），但≥ 3次RSA患者未見類似結(jié)果（表3）。

表3 按流產(chǎn)次數(shù)分層分析TNF基因SNPs與URSA易感性的關(guān)系Tab.3 Stratified analysis genetic model and URSA according the number of abortions in TNF locus

2.4 連鎖不平衡檢驗和單體型分析 TNF基因rs1800629、rs361525兩位點存在完全連鎖不平衡（D'=0.979 8，r2=-0.052 4，P=0.199 2），排除分布頻率＜0.01的單體型，表4結(jié)果顯示TNF基因兩個位點形成3種單體型（AG、GA、GG），校正年齡等協(xié)變量因素后，各單體型在兩組間分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05，表4）。

表4 TNF基因位點單倍體型分布Tab.4 Haplotype distribution of TNF gene loci 例（%）

2.5 基因-環(huán)境交互作用分析 初篩出4個環(huán)境因素，教育水平、職業(yè)、工作屬性、運動與否，最終只有工作屬性這個環(huán)境因素能夠建立較好的模型。從二階交互最優(yōu)模型是rs1805096與工作屬性的交互作用，交叉一致性為10/10，測試集精準度為0.620 1，模型差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004 7）。校正協(xié)變量因素后，在訓(xùn)練集中三因素交互顯示三階模型中rs1800629、rs361525及工作屬性模型（訓(xùn)練集平衡精度=0.623 4，P=0.003 6），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，且十重交叉驗證的一致率（比值）為10∶10，明顯優(yōu)于其他模型（表5）。

表5 TNF基因位點與環(huán)境交互作用GMDR分析結(jié)果Tab.5 GMDR analysis result of interaction between TNF gene loci and environment

3 討論

TNF-α基因主要位于染色體6p21.3，該區(qū)域為高度多態(tài)的主要組織相容性復(fù)合體的Ⅲ類所在區(qū)域［7-8］，其突變可能導(dǎo)致 TNF-α水平的變化，特別是在啟動子區(qū)域［9-10］，而且它的升高會誘導(dǎo)自然殺傷細胞的激活以及隨后對胎盤生長的損害［11-12］。許多研究分析TNF-α多態(tài)性和RPL之間的關(guān)聯(lián)。然而，結(jié)果仍然存在爭議。

rs1800629位點是被研究的最多和最具有爭議的一個位點。有些研究［13，15］發(fā)現(xiàn)該位點與RSA無關(guān)聯(lián)，而有的研究［15-18］表明它與RSA正相關(guān)。此外，有研究［19-20］根據(jù)納入人群的地理位置進行分層發(fā)現(xiàn)亞洲人群在該位點與RSA的關(guān)聯(lián)性較歐洲人群更強?？傊?，引起這種結(jié)果爭議可能原因是：（1）人種、地域等造成的遺傳異質(zhì)性；（2）選擇標準差異：有的納入的是流產(chǎn)3次以上人群，有的納入2次以上人群；（3）排除標準差異：有的研究并未排除患者凝血、遺傳、內(nèi)分泌等較為明確的病因。為了系統(tǒng)的分析URSA的病因，本研究在排除了可能的造成RSA的原因后，同時校正年齡等協(xié)變量，發(fā)現(xiàn)rs1800629位點在共顯性、顯性和隱性遺傳模式以及等位基因模式下其分布頻率在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與其他研究一致［13，15］。

對于rs36152位點，ZHAO等［21］系統(tǒng)評價研究表明，純合子模型（AAvs.GG，OR=1.533，95%CI：1.022～2.301）和隱性模型（AAvs.GG+AG，OR=1.571，95%CI：1.050 ～ 2.350）與URSA風(fēng)險具有相關(guān)性。但雜合子模型與URSA發(fā)病風(fēng)險無關(guān)。而有的研究［13，23］未觀察到此位點與RSA相關(guān)。在亞洲人群中與URSA相關(guān)的主要模型是（AGvs.GG；OR=7.155，95%CI：2.342 ～ 21.853）［22］。但是本研究結(jié)果顯示，按流產(chǎn)次數(shù)進行分層分析，結(jié)果顯示在共顯性遺傳模型、顯性模型及隱性模型中，此位點A等位基因攜帶者顯著增加發(fā)生2次流產(chǎn)的風(fēng)險（OR=2.402，95%CI：1.041～5.545）。本研究結(jié)果和MA等［24］結(jié)果不一致。

URSA是多基因復(fù)雜性疾病，單體型分析比單個SNP分析更具有優(yōu)勢。STAVROS等［23］研究表明TNF-α-376G/-308A/-238G單倍型與低TNF-α水平和流產(chǎn)相關(guān)。但本研究單體型分析表明，TNF-α基因這兩個位點形成3種單體型（AG、GA、GG），校正年齡等協(xié)變量因素后，各單體型在兩組間分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。既往有研究［23］發(fā)現(xiàn)TNF-α基因無單體型與URSA的危險因素相關(guān)，與本報道類似。

GMDR是一種新穎而強大的檢測和建模上位性的統(tǒng)計工具，它與logit模型相比，成比例的優(yōu)勢模型可以提高這些結(jié)果的統(tǒng)計能力，從而降低假陽性率的發(fā)生［26］。目前尚未見將GMDR方法應(yīng)用于RSA的研究。本研究受樣本量限制，將TNF-α基因的兩個基因位點分別與環(huán)境因素（教育、居住地、職業(yè)性質(zhì)、吸煙、接觸高危因素、運動）引入模型，校正年齡等協(xié)變量，分析基因-環(huán)境交互作用，結(jié)果顯示一階交互最優(yōu)模型是rs1800629與工作屬性的交互作用，交叉一致性為10/10；二階模型rs1800629、rs361525與工作屬性模型存在交互作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蘭州地區(qū)URSA人群TNF-α基因rs361525位點單核苷酸多態(tài)性與URSA（流產(chǎn)次數(shù)=2次）易感性相關(guān)，且研究對象的基因-環(huán)境交互作用中，模型（rs1800629、rs361525，工作屬性）為最優(yōu)模型，rs1800629、rs361525和工作屬性之間的交互作用可能與URSA的發(fā)生有關(guān)聯(lián)?；蚺c環(huán)境因素是URSA發(fā)病的重要因素，雖然既往研究表明了TNF基因與URSA密切相關(guān)，但該基因rs1800629、rs361525與URSA發(fā)生的關(guān)系，特別在蘭州地區(qū)人群中并未明確。本研究存在一定的局限性，僅探討了蘭州地區(qū)人群，且樣本量有限，但本研究說明URSA是由環(huán)境和遺傳因素共同影響的復(fù)雜性疾病，在今后的研究中應(yīng)進一步結(jié)合環(huán)境因素-內(nèi)表型-基因進行交互分析，這將有助于從更廣泛的角度去闡明URSA的病理機制。