宋美燕，黃小蘭，王 芳，張 敏，米臘臘，劉志貞

1山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 山西省出生缺陷與細(xì)胞再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，太原 030001 2首都兒科研究所兒童發(fā)育營(yíng)養(yǎng)組學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100020

維生素B12(vitamin B12，VB12)是一種人體必需的微量營(yíng)養(yǎng)素，在維持兒童神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[1]。VB12作為甲基丙二酰輔酶A變位酶和蛋氨酸合成酶的重要輔因子，其缺乏可能引起相關(guān)氨基酸及有機(jī)酸的代謝紊亂，從而直接或間接影響兒童的生長(zhǎng)發(fā)育，監(jiān)測(cè)相關(guān)代謝物水平有助于進(jìn)一步研究VB12缺乏對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的影響，以及相關(guān)臨床表現(xiàn)的致病機(jī)制[2-5]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)是生物基質(zhì)中痕量物質(zhì)定量的常用方法，尿液是繼外周血外最常用的生物基質(zhì)，不受體內(nèi)平衡調(diào)節(jié)，更能夠反映代謝失調(diào)[6]。氨基酸和有機(jī)酸均為水溶性物質(zhì)，在人體出現(xiàn)代謝紊亂時(shí)，多余的氨基酸和有機(jī)酸主要通過尿液進(jìn)行排泄，對(duì)尿液中氨基酸和有機(jī)酸的定量能夠反映機(jī)體代謝情況[7]。而且尿液采集無創(chuàng)，相對(duì)血液基質(zhì)干擾蛋白少，是進(jìn)行臨床診斷和研究的良好生物樣本。同時(shí)檢測(cè)尿液中與VB12代謝相關(guān)的多個(gè)氨基酸及有機(jī)酸水平可為VB12缺乏的早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)防、診療以及病因?qū)W研究提供有力數(shù)據(jù)支持。既往氨基酸和有機(jī)酸定量方法學(xué)研究較少，已發(fā)表的方法學(xué)研究存在靈敏度和通量較低的問題，目前仍缺乏能夠同時(shí)定量微量隨機(jī)尿液中氨基酸及有機(jī)酸LC-MS/MS方法。Joyce等[8]和Virgiliou等[9]應(yīng)用非衍生法進(jìn)行尿液氨基酸定量，受靈敏度所限，為了保證同型半胱氨酸(L-homocysteine，Hcy)和胱硫醚(L-cystathionine，Cysta)等含量較低的氨基酸定量的可靠性，樣本需求量較大(50～100 μl)，且分析時(shí)間較長(zhǎng)(10～18 min)。Dhahouri等[10]、Magera等[11]和Kushnir等[12]通過柱前衍生增加靈敏度定量尿液中甲基丙二酸(methylmalonic acid，MMA)和甲基枸櫞酸(methylcitric acid，MCA)，尿液需求量均為100 μl。本研究擬建立一種靈敏、快速的能夠同時(shí)定量微量隨機(jī)尿液(10 μl)中多種氨基酸和有機(jī)酸的LC-MS/MS方法，并參照歐洲藥品管理局發(fā)布的生物分析方法驗(yàn)證指南[13]及美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的工業(yè)生物分析方法驗(yàn)證指南[14]要求從靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性等方面進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)確證。

材料和方法

試劑與儀器丙氨酸(L-alanine，Ala)、精氨酸(L-arginine，Arg)、瓜氨酸(L-citrulline，Cit)、Cysta、甘氨酸(glycine，Gly)、Hcy、組氨酸(L-histidine，His)、異亮氨酸(L-isoleucine，Ile)、亮氨酸(L-leucine，Leu)、蛋氨酸(L-methionine，Met)、苯丙氨酸(L-phenylalanine，Phe)、脯氨酸(L-proline，Pro)、絲氨酸(L-serine，Ser)、蘇氨酸(L-threonine，Thr)、色氨酸(L-tryptophan，Trp)、酪氨酸(L-tyrosine，Tyr)、纈氨酸(L-valine，Val)標(biāo)準(zhǔn)品、MMA標(biāo)準(zhǔn)品以及二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)均購(gòu)置于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。MCA標(biāo)準(zhǔn)品和MMA-d3標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)置于多倫多研究化學(xué)品公司。包含甘氨酸-13C，15N(glycine-13C，15N，Gly-13C，15N)、丙氨酸-d4(L-alanine-d4，Ala-d4)、苯丙氨酸-13C6(L-phenylalanine-13C6，Phe-13C6)、酪氨酸-13C6(L-tyrosine-13C6，Tyr-13C6)、亮氨酸-d3(L-leucine-d3，Leu-d3)、谷氨酸-d3(DL-glutamic-d3，Glu-d3)、纈氨酸-d8(L-valine-d8，Val-d8)、精氨酸鹽酸-13C，d4(L-arginine：HCl-13C，d4，Arg-13C，d4)、瓜氨酸-d2(L-citrulline-d2，Cit-d2)、蛋氨酸-d3(L-methionine-d3，Met-d3)的混合氨基酸同位素內(nèi)標(biāo)購(gòu)置于美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室公司。同型半胱氨酸-d4(DL-homocysteine-d4，Hcy-d4)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)置于IsoScience。人工尿液來自于CST Technologies Inc；飽和鹽酸正丁醇購(gòu)置于Regis Technologies Inc；甲酸(色譜純)購(gòu)置于美國(guó)迪馬公司；乙腈(色譜純)購(gòu)置于北京邁瑞達(dá)科技有限公司。Waters UPLC Xevo TQ-S液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)配置有電噴霧離子源和Masslynx數(shù)據(jù)處理軟件；NV-96G氮吹儀(杭州凱萊譜精準(zhǔn)醫(yī)療監(jiān)測(cè)技術(shù)有限公司)；XS205DU電子天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))；Microfuge 22r centrifuge離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)，Milli-Q超純水機(jī)(德國(guó)默克密理博公司)；SBD120-2金屬浴(美國(guó)Select Bioproducts公司)。

樣本來源收集2021年11月1日至2022年6月20日于首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院就診的97例0～12歲兒童的清潔中段尿。依據(jù)既往VB12缺乏篩查研究建議[15]，選取VB12可疑缺乏兒童，具體選擇依據(jù)為：(1)全血丙酰肉堿>5 μmol/L；或(2)丙酰肉堿>4 μmol/L，且丙酰肉堿/游離肉堿比值>0.26，丙酰肉堿/乙酰肉堿比值>0.26，丙酰肉堿/棕櫚酰肉堿比值>3.2，丙酰肉堿/蛋氨酸比值>0.36；或(3)Met<8.05 μmol/L；或(4)Met/Phe<0.2。以健康體檢于保健科就診，且血液氨基酸及?；鈮A譜分析結(jié)果為“未見典型氨基酸及脂肪酸代謝病改變”的兒童納入健康組，嚴(yán)格按照尿液標(biāo)本采集規(guī)范收集其清潔中段尿，并置于-20 ℃保存。排除標(biāo)準(zhǔn)為近3個(gè)月內(nèi)有過營(yíng)養(yǎng)干預(yù)；近1個(gè)月內(nèi)有感染性疾病病史，近3個(gè)月內(nèi)服用或規(guī)律性服用過抗生素；有其他共患病等兒童。最終選取VB12可疑缺乏組兒童27例(男18例、女9例，年齡均數(shù)為1.21歲)、健康組兒童70例(男46例、女24例，年齡均數(shù)為2.39歲)為研究對(duì)象，兩組在性別和年齡上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。另選取經(jīng)基因檢測(cè)確診為甲基丙二酸血癥cblC型(鈷胺素C缺陷病)患兒3例，檢測(cè)其代謝物水平，年齡1～4歲。本研究獲首都兒科研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審查編號(hào)：SHERLL2021096)，所有研究對(duì)象家長(zhǎng)均被告知尿液預(yù)期用途并簽署知情同意。

溶液配制準(zhǔn)確稱取適量氨基酸、MMA和MCA標(biāo)準(zhǔn)品加入水制備標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。取適量標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液混合后加人工尿液進(jìn)行逐級(jí)稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，其濃度如下：MMA、Met、Val、Thr、Ile、Leu、Ala、Arg、Gly、Phe、Pro、Ser、Tyr為0.50、1.00、2.00、5.00、20.00、50.00、100.00、200.00、500.00 μmol/L；Cysta、Cit、Trp為0.25、0.50、1.00、2.50、10.00、25.00、50.00、100.00、250.00 μmol/L；Hcy為0.15、0.30、0.60、1.50、6.00、15.00、30.00、60.00 μmol/L；MCA為0.01、0.02、0.04、0.10、0.40、1.00、2.00、4.00、10.00 μmol/L；His為1.00、2.00、5.00、20.00、50.00、100.00、200.00、500.00 μmol/L。

另稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品按溶液配制方法同樣制備儲(chǔ)備液，混合后使用人工尿液逐級(jí)稀釋制備質(zhì)控品工作液，其濃度如下：MMA、Met、Val、Thr、Ile、Leu、Ala、Arg、Gly、Phe、Pro、Ser、Tyr、His為6.00、60.00、375.00 μmol/L，Cysta、Cit、Trp為3.00、30.00、178.50 μmol/L，Hcy為0.90、1.80、18.00 μmol/L，MCA為0.12、1.20、7.50 μmol/L。

同位素標(biāo)記的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品加水充分溶解，Hcy-D4和MMA-D3加入乙腈充分溶解制備內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。取適量?jī)?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液混合后加入乙腈稀釋制備內(nèi)標(biāo)工作液，濃度如下：Hcy-D4和MMA-D3為4.60 μmol/L，Gly-13C，15N為153.37 μmol/L，Ala-D4、Phe-13C6、Tyr-13C6、Leu-D3、Glu-D3、Val-D8、Arg-13C，D4、Cit-D2、Met-D3為30.67 μmol/L。

樣本處理取10 μl尿液于1.5 ml離心管中，加入5 μl DTT(1 mol/L)和100 μl內(nèi)標(biāo)工作液，充分渦旋15 min后，在4 ℃條件下12 000 ×g 離心15 min。取上清95 μl轉(zhuǎn)移至0.2 ml管中，在50 ℃氮?dú)庀麓蹈伞Ｊ褂?00 μl 飽和鹽酸正丁醇對(duì)殘留物進(jìn)行溶解，充分渦旋后在70 ℃ 下進(jìn)行衍生30 min。衍生后在50 ℃氮?dú)庀麓蹈?，加?00 μl水充分溶解后進(jìn)行分析。

肌酐測(cè)定肌酐采用苦味酸法檢測(cè)，儀器使用深圳普門科技股份有限公司生產(chǎn)的自動(dòng)尿液微量白蛋白肌酐分析儀ACR-300，試劑由廠家配套提供。以肌酐作為內(nèi)參對(duì)尿液中待測(cè)物水平進(jìn)行校正。為確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性，在檢測(cè)每批樣本前，使用高、低兩個(gè)水平的質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)控，測(cè)試結(jié)果應(yīng)處于該批質(zhì)控品靶值±2SD濃度范圍之內(nèi)，若超出該范圍，需要重新定標(biāo)，直至質(zhì)控在控再進(jìn)行臨床樣本的檢測(cè)。

色譜與質(zhì)譜條件色譜柱：ACE Excel 2 AQ(50×2.1 mm，2 μm)，英國(guó)ACE公司；樣品室溫度：10 ℃；柱溫：45 ℃；流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相A為水(含0.1%甲酸，V/V)；梯度洗脫程序：0.00～2.00 min為0～18% B，0.40 ml/min；2.00～4.00 min為18% B，0.40 ml/min；4.00～4.01 min為18%～25% B，0.40 ml/min；4.01～5.50 min為25% B，0.40 ml/min；5.50～5.51 min為25%～75% B，0.40 ml/min；5.51～6.50 min為75% B，0.40 ml/min；6.50～7.00 min為75%～0% B，0.40 ml/min；7.00～8.00 min為0% B，0.40 ml/min；總分析時(shí)長(zhǎng)為8.00 min；進(jìn)樣量為7.50 μl。采用Waters ACQUITY UPLC聯(lián)合 Xevo TQ-S三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜，電噴霧離子源正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描方式，毛細(xì)管電壓為2.80 kV，脫溶劑氣流速為700 L/H，脫溶劑氣溫度為400 ℃，源溫度為150 ℃。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子通道、錐孔電壓、碰撞能量和保留時(shí)間等參數(shù)見表1。

表1 19種待測(cè)物保留時(shí)間、MRM離子通道、錐孔電壓、碰撞能量、內(nèi)標(biāo)

特異性測(cè)定在本實(shí)驗(yàn)條件下分別取空白人工尿液、加入混合標(biāo)準(zhǔn)品的人工尿液以及實(shí)際尿液樣本進(jìn)行分析，考察待測(cè)物在人工尿液以及實(shí)際尿液中的特異性。

標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限測(cè)定測(cè)定系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)示濃度為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)為定量下限樣本，定量下限樣本按照“樣本處理”方法進(jìn)行處理，每個(gè)批次5個(gè)平行樣本，連續(xù)測(cè)定3個(gè)批次，計(jì)算其批內(nèi)批間精密度和準(zhǔn)確度。

準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定取低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣本按“樣本處理”方法進(jìn)行處理，每個(gè)濃度5個(gè)平行樣本，連續(xù)測(cè)定3個(gè)分析批。分別計(jì)算出批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度以及精密度。準(zhǔn)確度用相對(duì)誤差(relative error，RE)表示，批內(nèi)精密度和批間精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)表示。

加標(biāo)回收率測(cè)定隨機(jī)選取6個(gè)志愿者的尿液樣本，混合后制備本底尿液樣本，在本底樣本中分別加入低、中、高3個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備低、中、高濃度的質(zhì)控尿液，每個(gè)濃度質(zhì)控和本底尿液3個(gè)平行樣本。按上述方法進(jìn)行測(cè)定后，依據(jù)(質(zhì)控測(cè)定值-本底測(cè)定值)/理論添加值×100%計(jì)算回收率。

基質(zhì)效應(yīng)測(cè)定參考?xì)W盟發(fā)布的《生物分析方法驗(yàn)證指南》[13]要求，選取6個(gè)志愿者來源的尿液樣本，作為基質(zhì)背景樣本，以待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)峰面積之比作為本底值(C)。在上述6個(gè)樣本參照“樣本處理”部分進(jìn)行前處理后分別加入低、高兩個(gè)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為加標(biāo)后樣本(B)。取相同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(低、高)作為無基質(zhì)樣本(A)進(jìn)行測(cè)定，以(B-C)/A×100%計(jì)算得到基質(zhì)效應(yīng)，其中A、B、C均設(shè)置3個(gè)平行樣本。

穩(wěn)定性測(cè)定在混合實(shí)際尿液樣本中加入低、高兩個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)品(n=3)，考察室溫放置8 h以及經(jīng)過3個(gè)凍融循環(huán)的樣本穩(wěn)定性。以不同條件下待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值評(píng)估穩(wěn)定性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料均通過Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)、Shapiro-Wilk檢驗(yàn)和Q-Q plot進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用M(P25，P75)表示，VB12可疑缺乏與健康組組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

分離度和特異性空白基質(zhì)(人工尿液)中未見目標(biāo)待測(cè)物。在本實(shí)驗(yàn)條件下，19種目標(biāo)待測(cè)物包括同分異構(gòu)體(異亮氨酸和亮氨酸，異亮氨酸保留時(shí)間為4.06 min，亮氨酸保留時(shí)間為4.16 min)及其同位素內(nèi)標(biāo)均實(shí)現(xiàn)了良好分離，健康志愿者尿液中17種氨基酸(同分異構(gòu)體在一張圖內(nèi))和2種有機(jī)酸色譜圖顯示很清楚(圖1)。

m/z：質(zhì)荷比；RT：保留時(shí)間

線性及定量下限目標(biāo)待測(cè)物線性良好，R2均>0.990，各目標(biāo)待測(cè)物定量下限為0.01～1.00 μmol/L，各待測(cè)物在其定量下限濃度水平上信噪比均大于10，批內(nèi)準(zhǔn)確度和批間準(zhǔn)確度分別為-14.48%～13.92%和-11.40%～5.60%，批內(nèi)精密度和批間精密度分別為2.28%～16.08%和5.63%～14.68%。標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍等見表2。

準(zhǔn)確度和精密度目標(biāo)待測(cè)物的批內(nèi)準(zhǔn)確度和批間準(zhǔn)確度分別為-12.51%～13.77%和-11.79%～12.38%，批內(nèi)精密度和批間精密度分別為0.12%～12.18%和1.77%～14.53%。

加標(biāo)回收率Cysta在高濃度時(shí)回收率小于80%，低濃度時(shí)回收率大于120%，但6個(gè)平行樣本間RSD均≤10.99%。其余待測(cè)物回收率均為80.20%～114.97%，RSD為0.33%～14.42%。

基質(zhì)效應(yīng)大部分待測(cè)物未見明顯基質(zhì)效應(yīng)，Pro、Cit、Gly和Val可見基質(zhì)增強(qiáng)(基質(zhì)效應(yīng)：117.32%～131.96%)，6個(gè)不同來源樣本間RSD≤12.76%。Arg可見明顯基質(zhì)增強(qiáng)，且6個(gè)來源樣本間RSD>15%。Arg色譜保留時(shí)間<1 min，基質(zhì)增強(qiáng)可能與共流出的干擾物未能充分分離有關(guān)。

穩(wěn)定性以新鮮制備樣本的待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比為參照，室溫放置8 h和經(jīng)過3個(gè)凍融循環(huán)的樣本穩(wěn)定性良好，峰面積之比為83.23%～117.88%，RSD≤16.98%。

方法小樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用所建立方法分析甲基丙二酸血癥cblC型患兒(鈷胺素C缺陷病)、VB12可疑缺乏兒童及健康兒童尿液中氨基酸及有機(jī)酸水平，結(jié)果顯示VB12可疑缺乏兒童的尿液中MMA(P=0.030)、Hcy(P<0.001)、MCA(P=0.006)、Cysta(P=0.001)以及Phe(P=0.004)均顯著高于健康兒童，3例甲基丙二酸血癥cblC型患兒MMA、Hcy以及MCA水平均高于健康兒童(表3)。

表3 甲基丙二酸血癥cblC型患兒、VB12可疑缺乏與健康兒童尿液氨基酸與有機(jī)酸含量比較(μmol/mmol Crea)

討 論

VB12是生命代謝中不可或缺的重要輔因子，其不足或缺乏將會(huì)引起一系列中間代謝過程的紊亂，從而影響兒童生長(zhǎng)發(fā)育。目前還沒有系統(tǒng)的定量這些代謝物的方法，本研究建立微量隨機(jī)尿液中VB12代謝相關(guān)的氨基酸和有機(jī)酸定量方法，并分析這些代謝物在VB12缺乏中可能出現(xiàn)的代謝紊亂。選擇70例健康兒童、27例VB12可疑缺乏兒童及3例甲基丙二酸血癥cblC型患兒，檢測(cè)其尿液中目標(biāo)待測(cè)物水平。健康兒童尿中目標(biāo)待測(cè)物水平與國(guó)外研究[12，16-17]一致，且均在Labcorp實(shí)驗(yàn)室公布的兒童參考區(qū)間內(nèi)。27例VB12可疑缺乏組兒童尿液中的MMA、Hcy、MCA、Cysta和Phe水平顯著高于健康組兒童。甲基丙二酸血癥是一種罕見的遺傳代謝病，已報(bào)道的我國(guó)各地發(fā)病率為1.2/10萬～3/10萬，其中cblC型(VB12代謝障礙)為本病在我國(guó)最常見的亞型[2]。由于疾病罕見，甲基丙二酸血癥cblC型組樣本量少，因此本組數(shù)據(jù)以濃度范圍展示，由于樣本例數(shù)不滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，本組未納入統(tǒng)計(jì)分析。本組患兒尿液中MMA、MCA及Hcy最低值高于健康兒童中位數(shù)5.14～76.52倍，因此，MMA、MCA及Hcy可作為甲基丙二酸血癥cblC型篩查與診斷的指標(biāo)[2]，也表明本研究建立的方法在目標(biāo)待測(cè)物異常高值時(shí)的可靠性。甲基丙二酸為Ile、Val、Met、Thr等分解途中甲基丙二酰輔酶A的代謝產(chǎn)物，本研究甲基丙二酸血癥cblC型患者尿中上述氨基酸水平與健康兒童較一致，且均在Labcorp實(shí)驗(yàn)室以及既往研究公布的兒童參考區(qū)間內(nèi)[16]。其中健康人群測(cè)定值與既往研究以及Labcorp實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)一致[16-17]。

已有多項(xiàng)研究表明VB12缺乏經(jīng)由甲基丙二酰輔酶A變位酶和蛋氨酸合成酶兩種酶導(dǎo)致MMA和Hcy水平增高，并廣泛應(yīng)用于VB12營(yíng)養(yǎng)狀況的評(píng)估[2-3]。甲基丙二酰輔酶A變位酶和蛋氨酸合成酶在氨基酸代謝網(wǎng)絡(luò)中是不可或缺的關(guān)鍵酶，在各種氨基酸代謝中發(fā)揮重要作用。然而，由VB12缺乏導(dǎo)致這兩種酶功能障礙所引起的氨基酸代謝紊亂的相關(guān)研究較少。本研究VB12可疑缺乏組兒童的尿液中除MMA和Hcy水平升高外，MCA、Cysta和Phe也出現(xiàn)升高。MCA在甲基丙二酰輔酶A變位酶功能障礙時(shí)會(huì)在體內(nèi)發(fā)生蓄積，因此，MCA的升高在一定程度上能反映VB12缺乏[5]。Cysta和Phe水平雖然較健康組兒童高，但其中位數(shù)并未超出Labcorp和已發(fā)表的參考區(qū)間，推測(cè)Cysta和Phe水平增高可能是樣本量較少所致。

血中VB12、Met、丙酰肉堿及其相關(guān)比值，以及VB12的代謝指標(biāo)MMA與Hcy均為VB12營(yíng)養(yǎng)狀況評(píng)估的指標(biāo)[15，18]。在蛋奶素食者中進(jìn)行的研究表明，MMA和Hcy比鈷胺素更為敏感，能夠更早期地反映VB12缺乏與不足，這對(duì)VB12缺乏性疾病的預(yù)防、診療、個(gè)性化增補(bǔ)均具備重要意義[18-19]。VB12缺乏在發(fā)展中國(guó)家普遍存在，但VB12缺乏導(dǎo)致一系列神經(jīng)系統(tǒng)障礙的機(jī)制尚未明確[18，20]。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)及多肽的基本單位，也是神經(jīng)遞質(zhì)、激素、磷酸甘油、糖脂、核酸、多胺、低分子量含氮物質(zhì)等合成的關(guān)鍵前體，在生物體多種代謝途徑中發(fā)揮重要作用[21]。體液中氨基酸及其代謝產(chǎn)物濃度變化在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中的作用已被多個(gè)研究報(bào)道。氨基酸和有機(jī)酸均為水溶性代謝物，尿液是其主要排泄途徑[12，22]。測(cè)定尿液中氨基酸和有機(jī)酸有助于了解VB12缺乏對(duì)氨基酸代謝的影響，為VB12缺乏導(dǎo)致的一系列不典型癥狀的研究提供新的思路。

本研究建立了在微量隨機(jī)尿液中定量VB12代謝相關(guān)的氨基酸和有機(jī)酸的方法，并分析這些代謝物在VB12缺乏中可能出現(xiàn)的代謝紊亂。分析時(shí)間為8 min，相較于Virgiliou等[9]、Yongqing等[23]及Joyce等[8]的研究，分析速度更快，方法靈敏度高，樣本需求量少，更適用于高通量檢測(cè)。相對(duì)于血液，尿液采集更容易，微量尿液對(duì)于新生兒、無尿及少尿患者等尿液采集困難群體有重要意義。前處理應(yīng)用蛋白沉淀結(jié)合鹽酸正丁醇衍生，尿液基質(zhì)比血液更純凈，干擾蛋白相對(duì)較少，相較于固相萃取法[11]，蛋白沉淀法操作更簡(jiǎn)便、成本更低。在樣本衍生上，與aTRAQ和iTRAQ兩種氨基端衍生化試劑盒相比[24-25]，鹽酸正丁醇能同時(shí)作用氨基酸和有機(jī)酸的羧基，以其作為衍生劑能增強(qiáng)待測(cè)物的疏水性，改善待測(cè)組分在色譜柱上的保留，提升檢測(cè)靈敏度，同時(shí)降低檢測(cè)成本。本研究仍有不足，如Arg有明顯基質(zhì)增強(qiáng)，尚需更換保留能力更強(qiáng)的色譜柱進(jìn)一步分離Arg與共流出基質(zhì)。本研究Leu與Ile實(shí)現(xiàn)了良好分離，緊隨亮氨酸后，在4.26 min處的色譜峰應(yīng)為另一個(gè)同分異構(gòu)體別異亮氨酸，尚需購(gòu)買別異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證。另外，臨床樣本較少，可在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充樣本進(jìn)一步驗(yàn)證，為臨床診療和病因?qū)W研究提供可靠依據(jù)。