劉曉穎 蔡 斌 甘 露 金詩煒 蔣瑾瑾 周 霖

假肥大型肌營養(yǎng)不良包括杜氏肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)和貝氏肌營養(yǎng)不良(Becker muscular dystrophy，BMD)，均是由抗肌萎縮蛋白(dystrophin)的基因突變所致的X連鎖隱性遺傳病。DMD常為致死性，臨床表現(xiàn)為進行性加重的肌萎縮及肌無力，活產(chǎn)男嬰的發(fā)病率為1/6 000～1/3 500?；颊叱Ｔ?5歲出現(xiàn)明顯癥狀，部分患者20歲左右可因心、肺功能衰竭而死亡[1-2]。BMD患者的臨床過程與DMD相似，但病情進展緩慢，預(yù)后良好。通過對假肥大型肌營養(yǎng)不良先證者及其家系成員進行DMD基因突變分析，可以協(xié)助臨床癥狀不典型患兒的早期診斷。現(xiàn)回顧性分析海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科近年收治的5例假肥大型肌營養(yǎng)不良患兒資料，以加強對該疾病的認識。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2009年7月-2020年5月收治于海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，并確診為假肥大型肌營養(yǎng)不良的5例患兒資料?；純罕O(jiān)護人均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準 假肥大型肌營養(yǎng)不良診斷標準參考2016年《中國假肥大型肌營養(yǎng)不良癥診治指南》[1]?；純号R床癥狀不典型時，若出現(xiàn)不明原因的心肌酶譜指標水平升高、DMD基因突變，亦可支持診斷。

1.3 研究方法 收集5例患兒的一般資料、臨床癥狀、體征(主要為Gower征)、實驗室檢查結(jié)果、肌肉活組織檢查(簡稱活檢)結(jié)果等。實驗室檢查的主要指標包括肌酸激酶(creatine kinase, CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme MB, CK-MB)、ALT、AST、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)等，其正常值范圍分別為CK 25～200 U/L，CK-MB<25 U/L，ALT<64 U/L，AST<64 U/L， LDH 80～285 U/L。

1.4DMD基因檢測方法 采集患兒及其父母外周靜脈血2 mL，應(yīng)用高通量測序進行DMD全基因panel檢測。全基因檢查長度2.2 Mb，檢測內(nèi)容包括缺失重復(fù)及點突變(外顯子+內(nèi)含子)。DMD基因缺失(或重復(fù))的驗證采用多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料分析 納入的5例假肥大型肌營養(yǎng)不良患兒均為男性，就診時年齡范圍為2 d～8歲，發(fā)病年齡范圍為1 d～4歲。主要首發(fā)表現(xiàn)為雙下肢無力、步態(tài)不穩(wěn)、皮膚黃染、肝酶水平升高、新生兒感染等。病例1、3和4均因“肝酶異?！痹镣庠壕驮\，并因誤診只行保肝治療。病例2的姨表兄曾罹患肌營養(yǎng)不良(具體不詳)，余患兒均無家族史。病例4和5因年幼無法配合完成Gower征的體格檢查，余3例患兒Gower征均為陽性(+)，并伴有雙側(cè)腓腸肌肥大。病例1完成肌肉活檢，符合肌營養(yǎng)不良改變，肌電圖結(jié)果提示肌源性損害導(dǎo)致的肌電改變。見表1。

表1 5例患兒一般資料

2.2 實驗室檢查結(jié)果 5例患兒CK水平均顯著升高，伴CK-MB、ALT、AST和LDH水平不同程度的升高。5例患兒CK、CK-MB、ALT、AST、LDH水平分別為(15 810±10 378) U/L、(351.2±212.4) U/L、(202.6±149.9) U/L、(202.4±82.0) U/L、(1 068.0±583.8) U/L，分別為正常上限的 22.9～162.8倍、5.7～28.0倍、0.8～6.9倍、1.6～5.3倍、1.8～6.6倍。分別比較CK升高倍數(shù)與CK-MB、ALT、AST和LDH升高倍數(shù)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 5或0.001 6)，后4者升高倍數(shù)之間兩兩比較的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。見表2。

表2 5例患兒實驗室檢查結(jié)果 (U/L)

2.3 基因檢測結(jié)果 因病例1、2原始基因報告難以獲得，本研究詳述病例3、4、5基因檢測結(jié)果，分別見圖1、圖2、圖3。

A 病例3患兒的基因檢測結(jié)果提示患兒DMD基因49～52號外顯子半合子缺失，為自發(fā)突變 B 病例3患兒父親的基因檢測結(jié)果提示該區(qū)域無變異 C 病例3患兒母親的基因檢測結(jié)果提示該區(qū)域無變異圖1 病例3 DMD基因檢測結(jié)果(圖上方序列號為樣本編號)

A 病例4患兒的基因檢測結(jié)果提示患兒DMD基因45號外顯子半合子缺失，為自發(fā)突變 B 病例4患兒父親的基因檢測結(jié)果提示該區(qū)域無缺失 C 病例4患兒母親的基因檢測結(jié)果提示該區(qū)域無缺失圖2 病例4 DMD基因檢測結(jié)果(圖上方序列號為樣本編號)

4例患兒基因檢測提示DMD基因缺失突變，其中自發(fā)突變3例，遺傳自母親突變1例，突變位點分別位于48～51號、42～43號、49～52號、45號外顯子，既往均見報道，診斷明確。病例5患兒基因檢測結(jié)果為DMD基因單純57～59外顯子重復(fù)突變，為自發(fā)突變，既往數(shù)據(jù)庫中未見此突變報道。見表3。

表3 5例患兒基因檢測結(jié)果

A 病例5患兒MLPA分析結(jié)果提示患兒DMD基因57～59號外顯子重復(fù)變異，為自發(fā)突變 B 病例5患兒母親MLPA分析結(jié)果提示無此變異 (橫坐標代表探針編號及檢測基因-所在外顯子；縱坐標代表患者與對照樣本熒光信號的比值，紅藍線為基準線，比值高于藍線為重復(fù)，比值低于紅線為缺失，熒光信號強度介于0.7～1.3為正常)圖3 病例5患兒DMD基因MLPA分析

3 討 論

假肥大型肌營養(yǎng)不良是由位于Xp21.1的DMD基因缺陷所致的X連鎖隱性遺傳病。DMD基因突變?nèi)粲绊懥似溟_放閱讀框，蛋白質(zhì)表達則被過早截斷，引發(fā)DMD；突變?nèi)舯Ａ袅碎_放閱讀框，蛋白質(zhì)的功能則被部分保留，引發(fā)BMD。故與BMD相比，DMD發(fā)病早、預(yù)后差，更受學(xué)者及臨床醫(yī)師的關(guān)注。本文僅針對DMD進行討論。

不同年齡的DMD患兒具有不同的臨床特征，診斷要點包括：①X連鎖隱性遺傳，3～5歲隱襲起病，進行性發(fā)展，一般在12歲后出現(xiàn)行走障礙；②可出現(xiàn)雙下肢無力、鴨步、Gower征、起蹲困難和腓腸肌肥大等臨床表現(xiàn)；③血清CK水平顯著升高至正常值的數(shù)十倍至上百倍；④肌電圖顯示肌源性受損；⑤肌肉活檢呈典型的肌源性損傷表現(xiàn)，且抗肌萎縮蛋白抗體免疫組織化學(xué)染色呈陰性；⑥超聲心動圖可顯示左心室擴大，肌肉MRI提示肌肉水腫和脂肪浸潤；⑦DMD基因檢測為外顯子缺失、重復(fù)、微小突變或點突變[1]。在以上7條診斷標準中，年幼兒肌電圖和肌肉活檢的接受度較差，不易實施；心臟超聲和肌肉MRI則不能直接提供診斷線索。故在臨床實踐中，臨床癥狀和CK檢測結(jié)果是較易獲得的重要的診斷依據(jù)。典型特殊姿勢和步態(tài)包括Gower征，常于患兒幼年發(fā)病，但起病隱匿，可無典型臨床表現(xiàn)，直至患兒20歲左右因呼吸、心力衰竭就診，但DMD發(fā)展迅速，一經(jīng)診斷疾病常已達中晚期。因此，在疾病早期，患兒的癥狀常常被忽視，易誤診、漏診。

本研究5例患兒均于5歲前起病，病例3、4為嬰兒期起病，病例5為新生兒期起病，目前關(guān)于嬰兒及新生兒起病的報道較少。因年幼患兒在行Gower征檢查時不能配合，為診斷帶來一定難度，故部分患兒常在發(fā)病數(shù)年后才得以確診[3]。在實驗室檢查方面，患兒除了有典型的CK水平升高，亦伴有心肌酶及肝酶譜指標的異常，臨床上易漏診或誤診為“心肌炎”“肝功能異?！钡萚4-5]。雖然，AST和ALT水平升高通常提示肝細胞損傷，但肌肉是血清轉(zhuǎn)氨酶的潛在來源。肌營養(yǎng)不良、炎性肌病和代謝性肌病等肌肉疾病可導(dǎo)致血液中肌酸磷酸激酶(CPK)、LDH、ALT和AST水平升高，當伴有肝功能異常、肝酶水平升高時，需考慮到兒童肌肉疾病。當遇到有肝酶水平升高而沒有肝病相關(guān)臨床癥狀或體征的患兒時，應(yīng)盡早檢測CK水平，有助于肌肉疾病的早期診斷，并避免類似肝活檢等不必要的侵入性檢查[6-10]。年齡≤3歲的患兒CK水平升高10倍以上時應(yīng)考慮DMD可能。本研究中5例患兒CK、CK-MB、ALT、AST、LDH水平均升高，但以CK升高尤為顯著，提示CK可能是DMD最敏感的實驗室檢測指標，可用于區(qū)別肝臟與心肌損害。新生兒及嬰兒期CK水平已顯著升高，對于發(fā)病早、臨床癥狀隱匿的DMD幼年患兒有重要的診斷意義。

此外，也有國內(nèi)學(xué)者報道1例因腸道感染就診發(fā)現(xiàn)心肌酶水平升高的年長患兒，其無肌肉萎縮、四肢無力、運動障礙、腓腸肌肥大，Gower征呈陰性，擬診心肌炎并行營養(yǎng)心肌治療，后經(jīng)肌電圖及基因檢測確診為DMD[6]。DMD患兒在左心室收縮功能下降之前可出現(xiàn)心肌損害，而心肌病是導(dǎo)致DMD患兒死亡的主要原因。本研究中5例患兒的CK-MB水平均明顯升高(5.7～28.0倍)，提示疾病早期即可出現(xiàn)CK-MB水平升高，應(yīng)盡早完善相關(guān)檢查，對DMD早期隨訪和干預(yù)有一定意義。

抗肌萎縮蛋白是目前所知DMD的唯一致病靶點。DMD基因突變多為大缺失、大重復(fù)和點突變[7]。本研究5例患兒中4例為自發(fā)基因突變，其中1例系遺傳自母親?；蛲蛔冾愋?0%為缺失突變，突變位點與既往文獻報道一致, 基因突變分布于外顯子兩個熱點區(qū)域(外顯子44～53號和外顯子2～20號缺失熱區(qū))，與文獻報道基本相符。病例5患兒基因檢測結(jié)果為DMD基因單純57～59號外顯子重復(fù)突變，既往鮮見相關(guān)報道。曾有研究[8]顯示，DMD基因52～62號外顯子重復(fù)突變，與本研究中重復(fù)變異區(qū)域有包含關(guān)系。自發(fā)突變患兒母親MLPA分析未發(fā)現(xiàn)DMD基因外顯子拷貝數(shù)異常，但不能排除其母親生殖腺鑲嵌體突變的情況存在，亦無法確定變異發(fā)生階段，因此仍建議患兒及其親屬行遺傳咨詢，以降低再發(fā)風(fēng)險。本研究中5例患兒發(fā)病均較早，考慮假肥大型肌營養(yǎng)不良中DMD可能性較大，但DMD基因檢測未體現(xiàn)是否破壞“開放閱讀框”，因患兒年幼、癥狀隱匿、體格檢查不能配合，僅根據(jù)目前的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查尚不能完全確診為DMD，需進一步隨訪其臨床表現(xiàn)以明確其類型。對疑診假肥大型肌營養(yǎng)不良的患兒進行基因檢測，通過其先證者及家系成員進行突變分析，可以發(fā)現(xiàn)未經(jīng)文獻及數(shù)據(jù)庫報道的新突變，從而豐富DMD的基因突變譜。

探索DMD理想的生物標志物有助于DMD的診斷。肌特異性微核糖核酸(miRNA)在DMD患者的骨骼肌中富集，且在DMD發(fā)病機制中起重要作用，故有學(xué)者認為肌特異性miRNA可能成為理想的DMD生物標志物[9]。DMD分子診斷可用于臨床診斷。對于依據(jù)臨床表現(xiàn)和血生物化學(xué)檢測結(jié)果疑診DMD或BMD的患者，首先選擇多重PCR擴增技術(shù)(multiplex polymerase chain reaction，mPCR)分析，陰性者行MLPA技術(shù)對DMD基因進行缺失及重復(fù)突變篩查，對MLPA檢測陰性者采用二代測序(NGS)進行檢測，如仍未發(fā)現(xiàn)異常，進行肌活檢蛋白質(zhì)分析和cDNA分析，這可能是最佳、最經(jīng)濟的基因診斷策略[5,10]。

因目前尚無DMD有效的根治方案，糖皮質(zhì)激素是唯一被循證醫(yī)學(xué)證實有效且可以延緩病程的藥物。近年來，研究者探索治療DMD的方法包括研發(fā)抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)鈣水平、促進肌肉生長、抗纖維化、促進線粒體功能等針對肌營養(yǎng)不良機制的對癥治療藥物，物理治療(適量的運動訓(xùn)練、應(yīng)用矯形支具、虛擬現(xiàn)實游戲)，以及基因替代、外顯子跳躍、基因編輯等基因治療方案和干細胞治療[11-13]。采用基因手段治療和改善DMD癥狀、縮短病程、提高生活質(zhì)量，將為DMD的有效治療帶來希望[14]。準確的患者和攜帶者基因檢測和產(chǎn)前篩查結(jié)果，是降低DMD發(fā)病率的關(guān)鍵。

綜上所述，對于不明原因肝酶、CK-MB水平升高的年幼患兒，應(yīng)考慮DMD診斷。年幼患兒如不能配合神經(jīng)系統(tǒng)體格檢查，抗拒肌肉活檢等有創(chuàng)檢查，應(yīng)盡早完善CK水平檢測，并積極進行DMD基因檢測，以實現(xiàn)早期診斷、早期治療，減少漏診及誤診。