郭淑文，石晶紅

（河套學院 農學系，內蒙古 巴彥淖爾 015000）

傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團是由面粉或者其他谷物同水與環(huán)境中的微生物經自然發(fā)酵后保留一部分作為下次發(fā)面的菌種，也被稱為“面頭”、“酵面”、“酵子”和“面起子”[1-2]，其是由酵母菌、乳酸菌及霉菌等多菌種組成的混合發(fā)酵體系[3]，是一個微型的菌種資源庫。

近年來，國內外越來越多的研究者針對傳統(tǒng)酸面團中的微生物菌群進行研究。RANDAZZO C L等[4]使用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reactiondenaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術和培養(yǎng)法對傳統(tǒng)西西里小麥酸面團樣品的細菌菌群結構進行研究，結果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌種分別為舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；MICHEL E等[5]分別通過培養(yǎng)法、實時定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）法和高通量測序技術對16個法國發(fā)酵面團樣品中乳酸菌的相對豐度進行研究，發(fā)現(xiàn)13個樣品的優(yōu)勢菌種均為舊金山乳桿菌；陶東婭等[6]利用變性梯度凝膠電泳技術和基因測序技術在粘豆包酸面團中檢測到7種乳酸菌；張新杰[7]使用DGGE技術對不同配比原料制作的傳統(tǒng)自然發(fā)酵粘豆包發(fā)酵面團進行研究，共檢測出18種乳酸菌；烏日娜等[8]利用PCR-DGGE技術在酸湯子玉米面團中檢測出4種細菌菌種，其中類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）為優(yōu)勢菌種；楊健等[9]對黑龍江省肇源縣粘豆包發(fā)酵面團中細菌菌群多樣性進行檢測，推測發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌為優(yōu)勢菌種；吳斯日古冷[10]結合經典分離鑒定法和電泳技術研究內蒙古西部地區(qū)酸面團樣品中生物多樣性，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢乳酸菌種為舊金山乳桿菌、植物乳桿菌；張國華等[11]研究發(fā)現(xiàn)，山西省臨汾市傳統(tǒng)酸面團樣品中參與發(fā)酵的微生物大約有210個種水平物種信息，且以乳桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，以舊金山乳桿菌為優(yōu)勢菌種；李曉敏等[2]對采自山西、河北、青海、甘肅和河南5個地區(qū)酸面團樣品中的細菌菌群結構進行研究，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬、乳球菌屬和魏斯氏菌屬；高靜等[12]采用高通量測序分析老面中的菌群多樣性，發(fā)現(xiàn)在屬水平上存在地區(qū)差異，河北、山西、山東樣品中以片球菌屬（Pediococcus）為主，而云南樣品中以乳桿菌屬（Lactobacillus）為主。傳統(tǒng)發(fā)酵面團中微生物的多樣性受多種因素影響，包括環(huán)境微生物種類、谷物種類及來源、和面用水、發(fā)酵工藝及其他成分等[13-14]。因此，研究不同地域來源酸面團中微生物菌群的組成，對菌種的篩選具有一定的指導意義。

本研究利用高通量測序技術對內蒙古不同地區(qū)傳統(tǒng)酸面團的細菌群落多樣性進行解析，并對酸面團中的細菌代謝途徑進行預測和對比，以期為篩選優(yōu)質特性的菌種資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

傳統(tǒng)酸面團樣品：內蒙古西部地區(qū)（編號為nx1～nx5）、中部地區(qū)（編號為nz1～nz4）和東部地區(qū)（編號為nd1～nd5）的農戶家中，共采集14個地市的樣品。

1.1.2 試劑

MoBio PowerSoil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Isolation Kit：德國Qiagen公司；AgencourtAMPureXP：美國Beckman Coulter公司；細菌16S rRNA V3-V4區(qū)PCR擴增引物338F（5'-AC-TCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVG-GGTWTCTAAT-3'）：北京奧維森基因科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Illumina MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；9700 PCR儀、Step One Plus QPCR儀：美國ABI公司；5702 R臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌菌群多樣性分析

根據MoBio PowerSoil Isolation Kit操作手冊提取酸面團樣品中微生物的總DNA，以其為模板，采用338F和806R PCR擴增16S rDNA V3-V4區(qū)基因序列。將PCR擴增產物送至北京奧維森基因科技有限公司，采用Illumina MiSeq平臺進行高通量測序。

1.3.2 數(shù)據處理及分析

利用Flash軟件根據overlap原始數(shù)據進行拼接，采用Uchime軟件[15]去除嵌合體，得到優(yōu)質序列。采用Uclust軟件在97%相似度下構建操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。利用Mothur軟件計算各樣本的α多樣性指數(shù)，基于Silva V128[16]、RDP v16和Greengenes v13.5數(shù)據庫對OTU代表性序列進行注釋；利用Qiime軟件[17]對樣品β多樣性進行分析，OTU聚類分析通過R軟件實現(xiàn)。采用PICRUSt軟件[18]和京都基因百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據庫對樣品中細菌的代謝功能進行預測。

2 結果與分析

2.1 傳統(tǒng)酸面團樣品細菌群落高通量測序結果及Alpha多樣性分析結果

稀疏曲線可以判定樣本的取樣大小及測序深度是否合理[19]。3個地區(qū)酸面團樣品的稀疏曲線見圖1。

圖1 傳統(tǒng)酸面團樣品中細菌菌群的稀疏曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacterial flora in traditional sourdough samples

由圖1可知，隨著序列數(shù)的增加，14個樣品的OTU數(shù)量呈先增加后趨于平坦的趨勢，說明此次測序數(shù)據合理，測序深度能反映樣品中的物種信息。傳統(tǒng)酸面團樣品中細菌菌群的高通量測序及α多樣性分析結果見表1。

表1 傳統(tǒng)酸面團樣品中細菌菌群高通量測序及Alpha多樣性分析結果Table 1 Results of high-throughput sequencing and Alpha diversity analysis of bacterial flora in traditional sourdough samples

由表1可知，14個酸面團樣品共產生1 230 198條高質量序列，得到656個OTU，其Coverage為99.77%～99.94%，說明樣品中序列被測出的概率較高。由表1亦可知，不同樣品間的α多樣性指數(shù)存在較大差異，其中樣品nx3的OTU數(shù)（260）和Chao1指數(shù)（384.50）最大，而樣品nd4的Shannon指數(shù)（4.15）最大，說明樣品nx3中細菌菌群豐度最高，樣品nd4中細菌菌群多樣性最高。為進一步分析不同地區(qū)酸面團樣品中細菌菌群的差異，對不同地區(qū)酸面團樣品中細菌菌群的OTU繪制韋恩圖，并基于OTU進行聚類分析，結果見圖2。

圖2 細菌群落OTU水平的Venn圖（a）及聚類分析結果（b）Fig.2 Venn diagram (a) and cluster analysis result (b) of OTU level of bacterial community

由圖2a可知，內蒙古東部地區(qū)酸面團樣品的OTU數(shù)為185個，內蒙古中部地區(qū)酸面團樣品的OTU數(shù)為204個，內蒙古西部地區(qū)酸面團樣品的OTU數(shù)為233個，三個地區(qū)樣品中共有的OTU數(shù)為95個?？梢姡瑏碜圆煌貐^(qū)的酸面團在細菌群落組成上存在相似性。內蒙古東部、中部和西部地區(qū)酸面團樣品特有的OTU數(shù)分別為50個、53個和76個，分別占各地區(qū)總OTU數(shù)的27.03%、25.98%和32.62%，說明在三個地區(qū)酸面團樣品中細菌組成存在一定的差異。

由圖2b可知，3個地區(qū)14個酸面團樣品可聚為3類，樣品nd1、nx2、nx3聚為一類，相似性較高，樣品nd3單獨聚類，其他樣品聚為一類，表明其細菌群落結構存在一定的相似性和差異性。

2.2 傳統(tǒng)酸面團樣品中細菌群落組成分析

2.2.1 基于門水平酸面團樣品細菌菌群結構分析結果

為了解傳統(tǒng)酸面團中細菌群落的組成，對不同地區(qū)酸面團樣品的OTU進行分類學鑒定，在門分類學水平揭示不同地區(qū)間酸面團樣品細菌群落的結構差異，結果見圖3。

圖3 基于門水平不同地區(qū)酸面團樣品細菌群落組成分析結果Fig.3 Analysis results of bacterial community composition of sourdough samples from different regions based on phylum level

由圖3可知，在門水平上，內蒙古西部地區(qū)酸面團樣品的優(yōu)勢細菌門（平均相對豐度＞1%）為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria），平均相對豐度分別為85.63%、13.78%；內蒙古中部地區(qū)酸面團樣品的優(yōu)勢細菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、藍細菌門（Cyanobacteria）、變形菌門（Proteobacteria），平均相對豐度分別為83.33%、6.57%、6.31%；內蒙古東部地區(qū)酸面團樣品的優(yōu)勢細菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria），平均相對豐度分別為83.33%、16.24%；3個地區(qū)14個酸面團樣品中的細菌菌群主要歸屬于厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和藍細菌門（Cyanobacteria），這與邢小龍等[20-21]的研究結果一致，與意大利成熟酸面團中的細菌門相同[22]。

2.2.2 基于屬水平酸面團樣品細菌菌群結構分析結果

在屬分類學水平上探究不同地區(qū)酸面團樣品細菌群落的組成，結果見圖4。

圖4 基于屬水平酸面團樣品細菌群落組成分析結果Fig.4 Analysis results of bacterial community composition of sourdough samples based on genus level

由圖4可知，從3個地區(qū)14個酸面團樣本中共檢測出11個優(yōu)勢細菌屬（平均相對豐度＞1%），不同地區(qū)酸面團樣品優(yōu)勢細菌屬的種類及相對豐度差異明顯，內蒙古中部地區(qū)酸面團樣品中優(yōu)勢細菌屬分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和魏斯氏菌屬（Weissella），平均相對豐度分別為75.52%、4.26%、2.52%、2.02%；內蒙古西部地區(qū)樣品中優(yōu)勢細菌屬分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、梭菌屬（Clostridium）、魏斯氏菌屬（Weissela）和芽孢桿菌屬（Bacillus），平均相對豐度分別為41.92%、14.40%、13.73%、6.75%、3.20%、2.66%；內蒙古東部地區(qū)酸面團樣品中優(yōu)勢細菌屬分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）和腸桿菌屬（Enterobacter），平均相對豐度分別為27.42%、19.33%、5.19%、4.30%、3.14%、2.24%、2.04%。

乳桿菌屬是乳酸菌中最重要的組成部分，多數(shù)樣品以乳桿菌屬為優(yōu)勢菌群[2，23-25]，這可能是因為乳桿菌屬具有獨特的基因組特征，也可能是細胞內的碳水化合物活性酶存在特異性[26]，能對碳水化合物高度適應并加以代謝，從而增強了其競爭力[27]。片球菌屬能賦予食品柔和的酸味及香氣，改善食品的營養(yǎng)和品質[28]。芽孢桿菌屬能夠分泌α-淀粉酶，有利于樣品的糖化作用[29]。Clostridium由于產生丁酸和乙酸進而轉化成丁醇、丙酮和乙醇，可能會提供酸面團面制品更豐富的風味物質[25]。不同地區(qū)酸面團樣品中細菌組成存在一定差異，這可能是面粉基質和制作工藝不同的原因。也有研究表明，環(huán)境因素對細菌群落多樣性和豐富度也有潛在影響[30]。

2.3 酸面團樣品細菌菌群代謝功能預測分析結果

采用PICRUSt軟件和KEGG數(shù)據庫對樣品中細菌菌群的代謝功能進行預測，結果見圖5。

由圖5a可知，內蒙古東部、中部、西部地區(qū)酸面團樣品中細菌群落的功能（平均相對豐度＞1%）均包括4類，分別為新陳代謝（metabolism）（79.87%、80.90%、79.24%）、遺傳信息處理（genetic information processing）（12.95%、13.85%、14.21%）、環(huán)境信息處理（environmental information processing）（3.40%、2.60%、2.82%）、細胞加工（cellular processes）（3.122%、2.06%、2.83%）。

由圖5b可知，內蒙古東部、中部、西部地區(qū)酸面團樣品中細菌菌群的新陳代謝功能包括碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）（14.64%、13.25%、14.46%）、輔助因子和維生素代謝（metabolism of cofactors and vitamins）（111.56%、12.34%、11.47%）、氨基酸代謝（aminoacidmetabolism）（10.56%、10.33%、10.69%）、脂質代謝（lipid metabolism）（7.91%、10.00%、8.74%）、萜類化合物和聚酮化合物代謝（metabolism of terpenoids and polyketides）（9.02%、8.76%、7.75%）、能量代謝（energy metabolism）（5.39%、5.30%、4.88%）、外源生物降解和代謝（xenobiotics biodegradation and metabolism）（5.07%、5.11%、5.39%）、多聚糖的生物合成和代謝（glycan biosynthesis and metabolism）（3.03%、2.90%、2.83%）、核苷酸代謝（nucleotide metabolism）（2.23%、2.39%、2.44%）、其他次生代謝產物的生物合成（biosynthesis of other secondary metabo lites）（1.64%、1.37%、1.43%）。遺傳信息處理功能包括復制與修復（replication and repair）（5.96%、6.37%、6.72%）、翻譯（translation）（3.32%、3.64%、3.67%）、折疊分選與降解（folding，sorting and degradation）（2.99%、3.22%、3.16%）。細胞加工功能在內蒙古東部地區(qū)酸面團樣品只涉及細胞生長和死亡（cell growth and death）（1.35%）一條功能通路，而中部、西部地區(qū)酸面團樣品包括細胞生長和死亡（cell growth and death）（1.46%、1.48%）、細胞運動（cell growth and death）（1.01%、1.33%）兩條通路。環(huán)境信息處理只涉及膜運輸（membrane transport）（2.91%、2.29%、2.65%）一條功能通路。綜上，3個地區(qū)酸面團樣品中細菌群落的基因功能主要是碳水化合物代謝、輔助因子和維生素代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、萜類化合物和聚酮化合物代謝5條KEGG途徑。

圖5 傳統(tǒng)酸面團中細菌群落所預測到KEGG一級（a）及二級（b）通路的相對豐度Fig.5 Relative abundance of KEGG primary (a) and secondary (b)pathways predicted in bacterial community of traditional sourdough

3 結論

利用Illumina Miseq高通量測序技術對內蒙古地區(qū)傳統(tǒng)酸面團樣品中的細菌菌群多樣性進行解析，并結合PICRUSt軟件預測細菌功能的變化。結果發(fā)現(xiàn)，三個地區(qū)的樣品共產生1 230 198條高質量序列，得到656個OTU，其覆蓋率為99.77%～99.94%。3個地區(qū)酸面團樣品檢出3個優(yōu)勢細菌門和11個優(yōu)勢細菌屬，共有優(yōu)勢細菌門為厚壁菌門和變形菌門，共有優(yōu)勢細菌屬為乳桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬和芽孢桿菌屬，不同地區(qū)樣品間細菌菌群多樣性和豐度存在明顯差異。傳統(tǒng)酸面團樣品中細菌群落的基因功能主要富集在碳水化合物代謝、輔助因子和維生素代謝、氨基酸代謝、脂質代謝及萜類化合物和聚酮化合物代謝5條KEGG途徑。本研究不僅可為乳酸菌發(fā)酵劑的篩選提供參考，還可為進一步研究不同地區(qū)面團發(fā)酵過程中起關鍵作用的菌種提供依據。