羅愛勤， 曹穎男， 鐘春燕

（廣州新華學(xué)院，廣東廣州 510520）

孔令躍等（2022）報(bào)道，藍(lán)刺頭是菊科植物藍(lán)刺頭（Echinops LatifoliusTausch.）的干燥頭狀花序，蒙藥名為扎日阿-烏拉，又稱為或驢欺口，其藥性苦、稀、輕、柔、鈍、涼。趙軍等（2021）研究表明，藍(lán)刺頭具有固骨、接骨、清熱、止痛之功效，可用于骨折、骨熱、刺痛、瘡瘍的臨床治療。李怡筱等（2022）、賴麗金等（2020）和劉巖等（2017）研究表明，藍(lán)刺頭治療骨質(zhì)的主要機(jī)制是含有芹菜素、芹菜苷等總黃酮，具有雌激素樣作用，可通過降低血清BGP水平增強(qiáng)卵巢大鼠ERα和ERβ的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨吸收和骨形成的耦合，促進(jìn)骨形成，降低骨轉(zhuǎn)化率，減少骨吸收。

藍(lán)刺頭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收錄在衛(wèi)生部蒙藥分冊中（國家藥典委員會，1998），僅有性狀鑒別、性味、功能主治、用法用量、貯藏項(xiàng)目，沒有專屬鑒別實(shí)驗(yàn)項(xiàng)和含量測定項(xiàng)目，不能真實(shí)反映藥材質(zhì)量，曹嵐嵐等（2021）、王宇等（2020）、舒合拉·朱馬別克等（2020）、高建萍等（2018）和紅霞等（2010）建立了該藥材的顯微鑒別、理化鑒別、薄層色譜鑒別、藥材中總黃酮的含量測定和芹菜苷的HPLC含量測定等方法，以及藥材的HPLC指紋圖譜。為更詳細(xì)分析不同來源藍(lán)刺頭藥材所含的總黃酮成分差異，本文在上述基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究檢測了10批藍(lán)刺頭藥材中的總黃酮的指紋圖譜，并參照孫麗君等（2021）的研究采用化學(xué)計(jì)量學(xué)分析法分析隱藏信息，尋找并區(qū)分不同來源藍(lán)刺頭的總黃酮成分，為藍(lán)刺頭指紋圖譜色譜研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器Waters 600E泵、Waters2996 PAD檢測器、717自動進(jìn)樣器（美國Waters）；Apollo C18柱（200 mm×4.6 mm×5 μm）；Shi-MADZU UV-2550（島津儀器（蘇州）有限公司）；KQ-250DE數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PTHW調(diào)壓控溫電熱套（鞏義市予華儀器有限公司）；XA205電子分析天平（0.01~220 g，梅特勒-托利多）。

1.2 材料 芹菜苷對照品（批號B200823，≥98.0%，上海銘博生物科技有限公司）；10批藍(lán)刺頭藥材（編號S1~S10）分別采自巴音布拉格嘎查村、烏蘭鄉(xiāng)鎮(zhèn)烏蘭村、武川縣得勝溝鄉(xiāng)大東溝村、涼城縣雙古城村、恩和哈達(dá)鎮(zhèn)伊木河村、武川縣西烏不浪鎮(zhèn)什拉圖村、武川縣東土城鄉(xiāng)南土城村、武川縣納令溝村、巴彥布拉格嘎查村、德勒哈達(dá)村，經(jīng)鑒定為菊科植物藍(lán)刺頭 （Echinops LatifoliusTausch.的干燥頭狀花序）；甲醇（色譜純）；其他試藥均為分析純；蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 取藍(lán)刺頭藥材，粉碎通過60目篩，精密稱取藥材粉末1 g，加60%乙醇50 mL回流提取2次，每次1 h，合并提取液，濃縮至無乙醇味，加水使稀釋至10 mL，離心（4000 r/min，10 min），取上清液通過裝有10 g AB-8大孔樹脂的玻璃柱，分別取水100 mL和80%乙醇50 mL通過樹脂柱，收集80%乙醇流出液，濃縮蒸干，即得藍(lán)刺頭總黃酮，精密稱定藍(lán)刺頭總黃酮重量，用甲醇使溶解，并定容至10 mL，搖勻，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芹菜苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.3 mg的溶液，搖勻，即得。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取芹菜苷對照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加5%三氯化鋁溶液3 mL，再加60%乙醇至刻度，搖勻，放置30 min，按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0401紫外-可見分光光度法（國家藥典委員會，2020），在275 nm波長處進(jìn)行吸光度測定，以吸光度為縱坐標(biāo)，芹菜苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為Y=0.0357X-0.0065，r=0.9999。結(jié)果表明，芹菜苷質(zhì)量濃度在3.28~32.8μg/mL與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 樣品測定 取藍(lán)刺頭藥材 （編號S1~S10），按照2.1項(xiàng)下方法制備藍(lán)刺頭總黃酮和供試品溶液，精密吸取各供試品溶液1.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加5%三氯化鋁溶液3 mL，再加60%乙醇至刻度，搖勻后放置30 min。按照2.3.1項(xiàng)下測定條件進(jìn)行吸光度測定，并計(jì)算各編號藍(lán)刺頭總黃酮的百分含量（%），結(jié)果10批藍(lán)刺頭藥材的總黃酮重量和含量分別為：S1 0.0225 g 62.6%，S2 0.0239 g 65.7%，S3 0.0211 g 66.8%，S4 0.0242 g 58.3%，S5 0.0215 g 63.9%，S6 0.0251 g 65.4%，S7 0.0244 g 64.1%，S8 0.0258 g 60.8%，S9 0.0236 g 66.1%，S10 0.0253 g 60.1%，10批藍(lán)刺頭總黃酮的百分含量均在50%以上。

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)Apollo C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：1%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0~3 min時(shí)100%A→95%A，3~5 min時(shí)95%A→92%A，5~7 min時(shí)92%A→88%A，7~9 min時(shí)88%A→80%A，9~10 min時(shí)80%A→75%A，10~12 min時(shí)75%A→65%A，12~30 min時(shí)65%A→52%A，30~38 min時(shí)52%A→48%A，38~45 min時(shí)48%A→44%A，45~60 min時(shí)44%A→75%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：331 nm；進(jìn)樣量40 μL；理論板數(shù)按芹菜苷峰計(jì)算應(yīng)不低于30000。

2.4.2 指紋圖譜建立及相似度評價(jià) 取10批藍(lán)刺頭藥材（S1~S10），按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012A版）軟件進(jìn)行色譜數(shù)據(jù)分析，分析條件：域值200，最小峰寬30，最小峰面積0，最小峰高1000，以10批藍(lán)刺頭藥材中的總黃酮的共有模式為對照色譜圖，共標(biāo)定10個(gè)共有峰（圖1），通過對照，指認(rèn)出8號峰為芹菜苷峰，且不同批次樣品中穩(wěn)定存在，故選其作為參比峰（圖2）。將10批藍(lán)刺頭藥材的總黃酮圖譜的峰面積平均值和中位數(shù)為共有模式，根據(jù)峰匹配的結(jié)果，對所得的HPLC指紋圖譜全譜進(jìn)行相似度計(jì)算，以相關(guān)系數(shù)表征相似度，結(jié)果10批藍(lán)刺頭藥材中總黃酮的指紋圖譜的10個(gè)共有峰的相似度介于0.900~1.000，表明10批藍(lán)刺頭藥材中總黃酮的指紋圖譜相似度良好，不同批次藍(lán)刺頭藥材的總黃酮成分均較穩(wěn)定。

圖1 藍(lán)刺頭藥材總黃酮的HPLC色譜共有峰模式圖

圖2 藍(lán)刺頭總黃酮與芹菜苷對照品的HPLC色譜對比圖

2.4.3 方法學(xué)考察

2.4.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取藍(lán)刺頭藥材（編號S4）適量，精密稱定，按照2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次。結(jié)果以8號峰為參比峰，各共有色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明檢測系統(tǒng)的精密度良好。

2.4.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取藍(lán)刺頭藥材（編號S4）適量，精密稱定，按照2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下的色譜條件，分別于0、4、8、12、16、20 h時(shí)進(jìn)樣測定。結(jié)果以8號峰為參比峰，各共有色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取藍(lán)刺頭藥材（編號S4）適量，精密稱定，按照2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，分別按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果以8號峰為參比峰，各共有色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.5.1 聚類分析 將10批藍(lán)刺頭藥材的總黃酮指紋圖譜10個(gè)共有峰的相對峰面積導(dǎo)入SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用組間連接法，參照王鑫晶等（2021）的研究以歐式距離平方作為測量度，進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。10批藍(lán)刺頭藥材可分為3類：第1類為S1、S3、S4、S7、S10，第2類為S2、S6、S8，第3類為S5、S9，聚為一類的樣品之間有較好的相似性。

圖3 10批藍(lán)刺頭藥材聚類分析

2.5.2 主成分分析 以10批藍(lán)刺頭藥材的總黃酮指紋圖譜10個(gè)共有峰的峰面積為變量，分別采用SPSS 22.0軟件和SIMCA-P12.0軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）。SPSS軟件分析得特征值>1的主成分有4個(gè)，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為93.713%（表1），從表2可知，第1主成分中1、2、10號峰有較高的載荷值，第2主成分中5號峰有較高的載荷值，第3主成分3、6、7號峰有較高的載荷值，第4主成分中8、9號峰有較高的載荷值，表明多個(gè)總黃酮成分協(xié)同影響藍(lán)刺頭的整體質(zhì)量；以主成分的特征值和貢獻(xiàn)率為選擇主成分的依據(jù)，選擇4個(gè)主成分，利用SIMCA-P軟件自動擬合，模型預(yù)測結(jié)果如圖4所示，10批藍(lán)刺頭藥材被分為3類，與聚類分析結(jié)果一致。

表1 藍(lán)刺頭藥材中總黃酮的指紋圖譜主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率

表2 藍(lán)刺頭藥材中總黃酮的指紋圖譜色譜峰主成分因子載荷矩陣

圖4 10批藍(lán)刺頭藥材的總黃酮的主成分分析得分圖

2.5.3 偏最小二回歸分析 將10批藍(lán)刺頭藥材的總黃酮指紋圖譜共有峰的相對峰面積導(dǎo)入SIMCA-P12.0軟件，進(jìn)行偏最小二回歸分析（PLSDA），得分圖如圖5所示。10批樣品可聚類為3類，與聚類分析和PCA結(jié)果一致。提取PLS-DA模型中10個(gè)變量投影重要性（VIP）值并從大到小排序，結(jié)果如圖6所示，VIP值>1的色譜峰分別為2號峰（1.2230），4號峰（1.5854），5號峰（1.4534），10號峰（1.2624），是引起藍(lán)刺頭藥材批次間差異的主要黃酮類成分，對其聚類有顯著影響。

圖5 10批藍(lán)刺頭藥材的總黃酮的PLS-DA模型得分圖

圖6 10批藍(lán)刺頭藥材的總黃酮的PLS-DA結(jié)果

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法 本實(shí)驗(yàn)前期分別對提取溶劑（水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和80%乙醇），提取方式（超聲提取和加熱回流提?。?，大孔樹脂型號（D101、AB-8、X-5、HPD-400、NKA-9），以及乙醇洗脫濃度（70%、80%、95%乙醇）進(jìn)行了考察，以色譜峰信息的最大化、提取效率高為指標(biāo)，確定本實(shí)驗(yàn)的藍(lán)刺頭總黃酮的制備方法為以60%乙醇為提取溶劑，加熱回流提取2次，AB-8大孔樹脂純化，80%乙醇洗脫。

3.2 總黃酮含量測定 本實(shí)驗(yàn)前期在芹菜苷對照品溶液中加入亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉試劑，結(jié)果無紅色物質(zhì)產(chǎn)生，在500 nm處也無吸收，說明亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法并不適用藍(lán)刺頭總黃酮的測定。李蓮芳（2019）報(bào)道，結(jié)構(gòu)中具有5-羥基和4-羰基的黃酮類化合物，如芹菜苷，能與三氯化鋁反應(yīng)形成絡(luò)合物，使帶I或帶II向紅位移；帶II紅移后對照品溶液與供試品溶液在（275±2）nm處有共同吸收峰，因而可以用三氯化鋁作為顯色劑測定藍(lán)刺頭總黃酮的含量。孟憲琦等（2021）、黃艷萍等（2021）、李婷等（2020）和張學(xué)英等（2020）報(bào)道，采用三氯化鋁比色法測定植物中的總黃酮含量，主要因?yàn)槿然X顯色法測定總黃酮結(jié)果在誤差范圍內(nèi)準(zhǔn)確度較高，顯色反應(yīng)時(shí)黃酮類物質(zhì)反應(yīng)較強(qiáng)，而對色素、酚酸等非黃酮類物質(zhì)的反應(yīng)極弱，因而對黃酮類化合物的專屬性較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)藍(lán)刺頭總黃酮的含量測定方法利用了三氯化鋁與5-羥基、4-羰基的黃酮或黃酮醇類化合物反應(yīng)生成絡(luò)合物使帶II向紅位移的原理，該方法在本實(shí)驗(yàn)前期經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度較好。

3.3 色譜條件 本實(shí)驗(yàn)前期比較了乙腈-水、甲醇-水、甲醇與不同濃度甲酸溶液的流動相系統(tǒng)對色譜峰的影響，結(jié)果用甲醇-1%甲酸溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)色譜分離效果較好，峰數(shù)目較多；利用二極管陣列檢測器對樣品進(jìn)行分析，觀察全譜的分離與吸收情況，結(jié)果波長為331 nm時(shí)出峰數(shù)量多，基線較平穩(wěn)，信號響應(yīng)值大，因此選擇331 nm作為本實(shí)驗(yàn)的檢測波長。

3.4 方法評價(jià) 本實(shí)驗(yàn)建立了藍(lán)刺頭總黃酮的高效液相色譜指紋圖譜，確定了10個(gè)共有峰，并對10批藍(lán)刺藥材中總黃酮的指紋圖譜的相似度進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果顯示有良好的相似性。通過紅外光譜和核磁共振光譜及文獻(xiàn)檢索，確證8號峰對應(yīng)的化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)為芹菜苷，根據(jù)色譜峰的分離情況，8號峰芹菜苷分離度較好，故選擇該峰作為參照峰。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)通過化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，建立了藍(lán)刺頭聚類分析、PCA和PLS-DA分類模型，3種方法分析結(jié)果基本一致，均將10批樣品歸為3類；PLS-DA以共有峰VIP>1篩選得到4個(gè)主要差異性物質(zhì)，不同批次藍(lán)刺頭藥材的總黃酮間的差異性主要體現(xiàn)在2、4、5、10號峰。本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相色譜指紋圖譜及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果可為藍(lán)刺頭的質(zhì)量控制和評價(jià)提供一定的參考依據(jù)。