郭昊，鮑子谷

（廣州中大環(huán)境治理工程有限公司，廣東 廣州 510320）

自然環(huán)境下，存在于污水中的氮素主要為氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、有機(jī)氮四種形式，過(guò)量氮素會(huì)對(duì)環(huán)境、人類活動(dòng)造成巨大影響[1]。

水中過(guò)量氮處理的方法主要有折點(diǎn)加氯法、膜分離法、吹脫法、離子交換法、催化氧化法等物理化學(xué)法以及生物法。生物法以硝化-反硝化的形式在污水處理工藝中得到廣泛應(yīng)用，主要體現(xiàn)在SBR、A/O、A2/O、氧化溝、生物轉(zhuǎn)盤等工藝。常規(guī)硝化-反硝化分為三種：完全硝化-反硝化、短程硝化-反硝化（Sharon工藝）[2]、同步硝化-反硝化，其中Sharon工藝能耗、碳源需求量較少，且減少反應(yīng)時(shí)間和污泥產(chǎn)生量；同步硝化-反硝化具有反應(yīng)空間小、建設(shè)和運(yùn)行成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)方向之一[3]。

本研究擬篩選出高效的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌，通過(guò)探究菌株在不同條件下的脫氮特性總結(jié)出菌株的最佳反應(yīng)條件；在該條件下探究菌株對(duì)不同氮源的利用情況并做氮平衡分析，結(jié)合過(guò)程中擴(kuò)增出的功能基因分析菌株的氮代謝路徑，為異養(yǎng)硝化-好氧反硝化現(xiàn)象發(fā)生機(jī)理的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

UV-6100紫外-可見分光光度計(jì)；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)；HNY-2102恒溫振蕩培養(yǎng)箱；LRH-250F生化培養(yǎng)箱；JPSJ-605F溶解氧測(cè)定儀；PH350型pH測(cè)定儀；NMM-820TRF精密顯微鏡；AX224ZH/E分析天平；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器；BD/BC-256J變溫冷凍冷藏箱。

七水合磷酸氫二鈉；磷酸二氫鉀；氯化鈉；檸檬酸鈉；硫酸鎂；氯化鈣；硫酸銨；硝酸鈉；亞硝酸鈉；細(xì)菌學(xué)蛋白胨；酵母浸膏；草酸銨結(jié)晶紫；碘液；乙醇；番紅染色液；格里斯試劑；鋅粉；甘油。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

（1）M9培養(yǎng)基

本試驗(yàn)M9培養(yǎng)基配方如表1所示，各個(gè)組分均需要單獨(dú)分裝滅菌，使用時(shí)在超凈工作臺(tái)中將各成分按照比例加入無(wú)菌錐形瓶中，使用HC（l0.1 mol/L）和NaOH（0.1 mol/L）將pH調(diào)整至7.2±0.1。M9礦物鹽1 L溶液中含有Na2HPO4·7H2O 64 g，KH2PO415 g，NaCl 2.5 g。在配制時(shí)用超純水溶解，混合搖勻后用超純水定容至1L。

（2）氨氮培養(yǎng)基

使用NH4SO4作為唯一氮源，配制9.44 g/L的NH4SO4溶液并進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，使用此溶液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中唯一的氮源成分，即為氨氮培養(yǎng)基。

（3）富集培養(yǎng)基

本試驗(yàn)使用LB培養(yǎng)基作為富集培養(yǎng)基，使用超純水溶解各組分并定容至1 L，將pH調(diào)整至7.2±0.1，分裝至錐形瓶中并在高壓蒸汽滅菌鍋壓力為0.1 MPa，溫度為121℃條件下滅菌30 min，冷卻后使用。配制固體LB培養(yǎng)基需要另外加入2%（W/V）瓊脂，滅菌后倒板制成LB平板并在冷卻后使用。

1.2.2 異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離與純化

在超凈工作臺(tái)中稱取5 g的活性污泥或河道底泥樣品分別加入到100 mL氨氮培養(yǎng)基中，將接種后的培養(yǎng)基在溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為100 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)后的菌液在超凈工作臺(tái)中吸取1 mL接種至100 mL氨氮培養(yǎng)基中，重復(fù)以上步驟三次，使樣品中的異養(yǎng)硝化細(xì)菌占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位從而被富集。

在超凈工作臺(tái)中將1 mL上述菌懸液加入至9 mL無(wú)菌生理鹽水中即得到該樣品稀釋10倍后的菌懸液，繼續(xù)梯度稀釋，得到稀釋至10-5、10-7、10-9倍的菌懸液，分別吸取0.1 mL加在LB固體培養(yǎng)基上，后使用玻璃涂布棒涂布，用封口膜將培養(yǎng)皿封口后放入生化培養(yǎng)箱中，在30℃下恒溫培養(yǎng)24 h。將不同形態(tài)的菌落單獨(dú)挑出在LB固體培養(yǎng)基上劃線，并于30℃條件下培養(yǎng)24 h，重復(fù)劃線三次得純菌。

1.2.3 異養(yǎng)硝化效果驗(yàn)證

將分離得到的純菌分別接種至100 mL無(wú)菌氨氮培養(yǎng)基中，在30℃、100 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，在8 h、16 h、24 h、36 h、48 h時(shí)取菌懸液1 mL，滴加兩滴格里斯試劑并靜置片刻，若菌懸液呈現(xiàn)紅色則表明有亞硝態(tài)氮產(chǎn)生；若滴加格里斯試劑5 min后仍未顯色，則在菌懸液中加入少許鋅粉，靜置片刻，若出現(xiàn)紅色則說(shuō)明菌懸液中存在硝態(tài)氮。能夠出現(xiàn)顯色反應(yīng)的菌株可以初步認(rèn)為具有硝化作用。

1.2.4 革蘭氏染色與菌種保藏

在潔凈無(wú)菌載玻片上滴一滴無(wú)菌水并挑取適量脫氮菌涂布并風(fēng)干，將載玻片底部快速通過(guò)酒精燈2次加以固定。將已固定的載玻片放平并滴加適量草酸銨結(jié)晶紫染液染色1 min，然后用無(wú)菌水緩緩沖洗染液并吸去多余水分。平放載玻片，滴加碘液并染色1 min，再次使用無(wú)菌水緩緩沖洗染液并吸去多余水分。將載玻片傾斜并滴加95%酒精沖洗，在流下的染液剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)立即停止。滴加適量番紅染液并染色1 min，使用無(wú)菌水沖洗并吸去多余水分。使用顯微鏡觀察并拍照。

將待保藏菌種接種于無(wú)菌LB培養(yǎng)基中并放置于合適環(huán)境中培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，取適量菌懸液與已滅菌60%甘油按照體積1∶1混合后密封并編號(hào)，迅速置于-80℃冰箱中，保存6個(gè)月以上。

1.2.5 水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)方法

本試驗(yàn)中NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN等水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定均采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，具體測(cè)定方法參照國(guó)家環(huán)?？偩志幱喌摹端蛷U水監(jiān)測(cè)分析方法》。NH4+-N采用納氏試劑分光光度法，NO2--N采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法，NO3--N采用紫外分光光度法，TN采用堿式過(guò)硫酸鉀紫外分光光度法。

1.2.6 影響因素驗(yàn)證

本試驗(yàn)以M9培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以硫酸銨為唯一氮源，并將NH4+-N濃度配置為200 mg/L，以檸檬酸鈉作為唯一碳源，分別測(cè)定最佳C/N、溫度、接種量。

C/N：將C/N分別調(diào)整為0、5、10、15、20。細(xì)菌接種量為1%，接種后于30℃、100 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)并按時(shí)取樣測(cè)定水質(zhì)指標(biāo)。

溫度：細(xì)菌接種量為1%，接種后分別于5℃、15℃、25℃、35℃、40℃的恒溫?fù)u床中以100r/min培養(yǎng)并按時(shí)取樣測(cè)定水質(zhì)指標(biāo)。

接種量：細(xì)菌接種量分別為0.1%、1%、2%、5%、10%，接種后于30℃、100 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)并按時(shí)取樣測(cè)定水質(zhì)指標(biāo)。

1.2.7 氮平衡計(jì)量

取接種后培養(yǎng)至某時(shí)刻（t=0表示反應(yīng)起始時(shí)刻）的水樣，將水樣分為兩份，一份使用超聲細(xì)胞破碎儀破碎后測(cè)定總氮含量（TN水樣）t，另一份水樣使用0.22 μm濾膜過(guò)濾并分別測(cè)定氨氮含量（NH4+濾液）t、亞硝態(tài)氮含量（NO2-濾液）t、硝態(tài)氮含量（NO3-濾液）t、總氮含量（TN濾液）t。計(jì)算方法如下：

則t時(shí)刻全部氮素=TN氣態(tài)t+TN胞內(nèi)t+NH4+濾液t+NO2-

濾液t+NO3-

濾液t+DON濾液t

1.2.8 功能基因擴(kuò)增與分析

（1）選取引物

通過(guò)查閱文獻(xiàn)尋找氮循環(huán)過(guò)程中的功能基因通用引物，針對(duì)標(biāo)記基因amoA、napA、nirK、nosZ的優(yōu)化引物與PCR反應(yīng)程序，引物所用的Oligo DNA在華大基因公司合成。

（2）總DNA提取與轉(zhuǎn)接

首先是SDS法提取總DNA，其次使用TAKARA的pMDTM18-T Vector Cloning Kit試劑盒進(jìn) 行DNA片 段的連接。

（3）PCR擴(kuò)增

反應(yīng)采用50 μL反應(yīng)體系：2×Green Mix 2.5 μL，dNTP 2 μL，正反引物各2 μL，菌株L2總DNA 1 μL，ddH2O 18 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 sec，58℃（溫度低于引物Tm值2℃～3℃）褪火30 sec，72℃延伸2 min（1 min/kb），72℃終延伸7 min，16℃保溫；共35個(gè)循環(huán)，完成后得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

（4）凝膠電泳觀察并切膠測(cè)序

使用制膠工具制作瓊脂糖凝膠，100 mL 1%（W/V）瓊脂糖凝膠配方如下：

1 g瓊脂糖投入100 mL的TAE或TBE緩沖液中，微波爐加熱溶解，待冷卻至室溫后加入5 μL以下的Gold View混勻，避免出現(xiàn)氣泡?；靹虻哪z倒入放有制膠板的制膠槽中，避免出現(xiàn)氣泡；在制膠槽的卡口處插入合適大小的制膠梳。

凝膠凝固后，將凝膠與制膠板一同取出，將點(diǎn)樣孔一側(cè)正對(duì)著負(fù)極放入電泳槽，確保緩沖液（TAE或TBE）的液面沒(méi)過(guò)凝膠，膠孔內(nèi)無(wú)氣泡。將5 μL的PCR產(chǎn)物加入到膠孔中，留下空白點(diǎn)樣孔加入DNA Marker，在120 V電壓下電泳15 min，結(jié)束后關(guān)閉電泳儀，將凝膠同制膠板拿出電泳槽，將凝膠置于凝膠成像儀拍攝區(qū)域在紫外下拍照保存。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（OMEGA）對(duì)特異性較好的基因條帶進(jìn)行回收并委托華大基因進(jìn)行測(cè)序。

（5）功能基因的生物信息學(xué)分析

將測(cè)序得出的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并根據(jù)結(jié)果使用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 異養(yǎng)硝化細(xì)菌的篩選與鑒定

本試驗(yàn)從廣州、珠海市某污水處理廠二沉池活性污泥中篩選出菌株L1、L2、Z1和Z2，廣州某河段底泥中篩選出菌株G1，共5株異養(yǎng)硝化細(xì)菌。分別將L1、L2、Z1、Z2、G1這5株細(xì)菌接種于氨氮培養(yǎng)基中并培養(yǎng)48 h，各細(xì)菌的硝化效果如圖1（a）所示。5株細(xì)菌中L1、L2、Z1三株細(xì)菌均表現(xiàn)出較高的NH4+-N去除率，分別為82.6%、87.6%和88.4%，其中Z1菌株在培養(yǎng)過(guò)程中，累積的NO2--N量遠(yuǎn)高于L1、L2菌株；L1菌株NO3--N累積量為24.3 mg/L，高于L2菌株的13.9 mg/L。陳云增等[4]發(fā)現(xiàn)當(dāng)飲用水中含有過(guò)量的硝酸鹽時(shí)，飲用者患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)大大提高，過(guò)量的硝酸鹽、亞硝酸鹽會(huì)嚴(yán)重危害人類健康。因此，L2菌株為本次研究對(duì)象。

對(duì)L2菌株進(jìn)行對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期測(cè)定，其結(jié)果如圖1（b）所示；對(duì)其進(jìn)行分離純化，便于后期保藏，其過(guò)程如圖1（c）所示；分離提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期L2菌株的DNA，使用16S rDNA測(cè)序，通過(guò)BLAST比對(duì)，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1（d）所示，可以看出，菌株L2與門多薩假單胞菌P.mendocinaATCC 25411相似度最高，因此將L2菌株命名為P.mendocinaL2。目前，門多薩假單胞菌的研究多見于生物降解芳香烴[5]、細(xì)菌感染[6]、生物柴油[7]、發(fā)酵褐藻寡糖[8]等領(lǐng)域，較少見于生物脫氮，研究L2菌株的生物脫氮特性有助于拓展異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌的研究深度，更深入地挖掘門多薩假單胞菌的特性。

圖1 硝化細(xì)菌的篩選、分離、鑒定圖Fig.1 Screening，isolation and identification of nitrifying bacteria

2.2 異養(yǎng)硝化細(xì)菌脫氮的影響因素探究

本實(shí)驗(yàn)將分別探究在不同C/N、溫度、接種量條件下菌株L2的生長(zhǎng)和脫氮情況，并通過(guò)分析得到菌株L2的最適反應(yīng)條件。

2.2.1 C/N

首先，將C/N梯度分別設(shè)置為0、5、10、15、20以探究不同C/N對(duì)菌株L2生長(zhǎng)繁殖和脫氮的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌株L2在不同C/N條件下的生長(zhǎng)和脫氮情況Fig.2 Growth and denitrification of strain L2 under different C/N ratio

不同C/N對(duì)菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著的影響：當(dāng)C/N較低時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制；而當(dāng)C/N高于5以后，其生長(zhǎng)狀況基本不受C/N影響；當(dāng)C/N=0時(shí)菌株L2在48 h內(nèi)幾乎不生長(zhǎng)，這再次證明了菌株L2為一株異養(yǎng)細(xì)菌；當(dāng)C/N＞5以后菌株L2生長(zhǎng)基本不受抑制，其OD600值均明顯高于C/N=5時(shí)的菌株生物量，表明當(dāng)C/N＞5以后細(xì)菌就可以保持正常生長(zhǎng)，此時(shí)碳源不再是細(xì)菌生長(zhǎng)的限制性因素。隨著C/N不斷升高，氨氮去除率逐漸增加，當(dāng)C/N=15時(shí)，氨氮去除率達(dá)到最大值98.2%，繼續(xù)增加C/N會(huì)略微提高氨氮去除速率，但最終氨氮去除率不受影響，而在這過(guò)程中亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮幾乎不受影響。

綜合去除效果和經(jīng)濟(jì)效益，選擇最佳C/N=15，這與C.metalliduransS1[9-10]、V.diabolicusSF16[11]的最佳C/N接近，同時(shí)也符合異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株最適C/N通常在5～15的研究結(jié)果[12]。相較于傳統(tǒng)的自養(yǎng)硝化細(xì)菌，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌更適合于處理同時(shí)存在較高有機(jī)物與較高氮素污染的污水，在較高C/N的污水中既能以遠(yuǎn)超自養(yǎng)微生物的速度快速繁殖，又能夠同時(shí)去除有機(jī)物，十分適合用于養(yǎng)殖廢水、食品加工廢水等的處理。

2.2.2 溫度

微生物的硝化、反硝化反應(yīng)會(huì)受到基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控與翻譯、翻譯后修飾、酶活調(diào)控的影響。溫度能夠影響含氮化合物在細(xì)胞內(nèi)外的傳遞速率、基因的表達(dá)、微生物體內(nèi)酶的活性，從而影響硝化和反硝化反應(yīng)。如圖3所示，溫度對(duì)于菌株L2的生長(zhǎng)具有顯著影響：當(dāng)溫度較低時(shí)，菌株L2的生長(zhǎng)存在較長(zhǎng)的適應(yīng)期；隨著溫度的增加，菌株L2的生長(zhǎng)速率也不斷提高；當(dāng)溫度達(dá)到30℃時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)速度較快，且穩(wěn)定期生物量較高；在35℃時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)最快；隨著溫度的升高，微生物對(duì)于氨氮的降解速率和最終去除率均在不斷升高，當(dāng)溫度升高至30℃和35℃時(shí)，氨氮降解速率達(dá)到最大，在8～24 h內(nèi)幾乎將氨氮全部轉(zhuǎn)化；但在35℃環(huán)境中的菌株L2在48 h時(shí)氨氮濃度略有升高，結(jié)合其OD600在后期的下降，可以認(rèn)為在較高溫度下部分老化細(xì)菌自溶并將體內(nèi)的含氮化合物釋放到環(huán)境中，有機(jī)氮被礦化為氨氮。

圖3 菌株L2在不同溫度條件下的生長(zhǎng)和脫氮情況Fig.3 Growth and denitrification of strain L2 under different temperature

菌株L2在不同溫度下均未出現(xiàn)較高程度的亞硝態(tài)氮累積，脫氮過(guò)程中酶的活性受環(huán)境溫度的影響極大：當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)，酶的活性會(huì)大大降低，甚至發(fā)生可逆失活；當(dāng)溫度高于酶的最適溫度時(shí)，酶的結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞甚至失活，此時(shí)正常的生理活動(dòng)難以維持。因而一個(gè)合適的溫度對(duì)于微生物的生長(zhǎng)和脫氮尤其重要。目前發(fā)現(xiàn)的大部分異養(yǎng)硝化細(xì)菌的最適溫度保持在30℃～35℃之間[13]。綜合考慮菌株L2的生長(zhǎng)和脫氮情況，選擇30℃為后續(xù)研究時(shí)的環(huán)境溫度。

2.2.3 接種量

微生物在培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)通常會(huì)經(jīng)過(guò)適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)階段。接種時(shí)的細(xì)菌生物量是微生物后續(xù)繁殖的基礎(chǔ)，會(huì)極大影響到細(xì)菌的后續(xù)生長(zhǎng)和脫氮過(guò)程。結(jié)果如圖4所示，L2的生長(zhǎng)情況受接種量的影響很大，主要體現(xiàn)在菌株L2的生長(zhǎng)速率上，但是基本不會(huì)影響48 h后的生物量。

圖4 菌株L2在不同接種量條件下的生長(zhǎng)和脫氮情況Fig.4 Growth and denitrification of strain L2 under different inoculum conditions

接種量會(huì)顯著影響硝化和反硝化反應(yīng)速率，但對(duì)于氨氮和總氮的去除率幾乎沒(méi)有影響。這是因?yàn)橄趸头聪趸磻?yīng)主要發(fā)生在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種量提高時(shí)微生物能更早地進(jìn)入對(duì)數(shù)期，硝化和反硝化反應(yīng)會(huì)更早更快進(jìn)行[14]。但由于固定環(huán)境的生物承載量是確定的，所以不同接種量并不會(huì)影響最終的生物量，也不會(huì)影響到氨氮和總氮的最終去除率。綜上，選擇接種量1%作為后續(xù)研究條件。

2.3 氮代謝途徑的探究

在氮代謝和氮平衡實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)基在C/N為15，培養(yǎng)溫度為30℃的條件下以1%的接種量接種菌株L2，48 h內(nèi)菌株L2的生長(zhǎng)和氮元素轉(zhuǎn)化情況如圖5（a）所示。前8 h為生長(zhǎng)適應(yīng)期，8 h后細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并在24 h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期，氨氮和總氮隨著菌株的生長(zhǎng)不斷降解，并在24 h時(shí)基本去除完畢，此時(shí)氨氮去除率為97.5%，平均去除速率為7.90 mg/L·h，總氮去除率為36.0%，平均去除速率為3.05 mg/L·h。

圖5（b）為以氨氮為唯一氮源時(shí)的氮素物料平衡分析圖，16 h時(shí)氨氮被大部分去除，剩余氨氮占總氮素的21.34%，氨氮去除率為77.73%，同時(shí)產(chǎn)生較多氣態(tài)氮，總氮去除率達(dá)到29.5%。在進(jìn)行脫氮的同時(shí)產(chǎn)生了6.0%的亞硝態(tài)氮累積和7.9%的溶解性有機(jī)氮。8～16 h細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌株L2的生物量快速增加，因此大量的氨氮被微生物吸收用以合成氨基酸、核酸等含氮有機(jī)物，所以細(xì)胞內(nèi)源氮占比提高。研究表明，所有氮素只有在轉(zhuǎn)化為谷氨酸的形式后才能被細(xì)胞利用[15]，所以此時(shí)的培養(yǎng)基中相較8 h存在更多的溶解性有機(jī)氮，這些有機(jī)氮可能是氨氮在轉(zhuǎn)化為谷氨酸過(guò)程中的中間產(chǎn)物。

圖5 菌株L2的脫氮（a）及氮平衡（b）情況Fig.5 Nitrogen removal and nitrogen balance of strain L2

綜合來(lái)看，不難發(fā)現(xiàn)菌株L2對(duì)氨氮和總氮均具有較好的去除效果，在24 h內(nèi)去除率分別達(dá)到97.5%和36.0%。通過(guò)氮平衡可以看出，菌株L2對(duì)水體中氨氮去除的途徑主要有兩個(gè)：一是通過(guò)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖將氨氮吸收并轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)源氮；二是通過(guò)異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用將氮素轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物并最終轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮[16]。

為了更加深入地理解菌株L2的氮代謝過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)使用特定引物分別擴(kuò)增出菌株L2的氨單加氧酶基因（amoA）、硝酸鹽還原酶基因（napA）、亞硝酸鹽還原酶基因（nirK）、氧化亞氮還原酶基因（nosZ），并使用生物信息學(xué)對(duì)基因序列進(jìn)行分析，回收產(chǎn)物連接T載體pMD18T進(jìn)行大腸桿菌（DH5α）轉(zhuǎn)化。擴(kuò)繁后提取重組質(zhì)粒，使用通用測(cè)序引物對(duì)M13F/M13R測(cè)序后，從L2菌株中擴(kuò)增出氮轉(zhuǎn)化途徑相關(guān)基因。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，參考已報(bào)道的與L2菌株同種屬細(xì)菌中的相關(guān)酶系的基因序列[17]，設(shè)計(jì)并選擇引物如表1和圖6。

表1 各基因擴(kuò)增引物Tab.1 Amplification primer of gene

圖6 氮代謝基因凝膠電泳圖Fig.6 Gel electrophoresis of nitrogen metabolism genes

為了確認(rèn)菌株L2中脫氮關(guān)鍵酶系的存在，本實(shí)驗(yàn)以特定引物對(duì)菌株L2的DNA進(jìn)行擴(kuò)增并鑒定，分別從菌株L2中擴(kuò)增出amoA、napA、nirK、nosZ四種脫氮相關(guān)的功能基因。通過(guò)分析菌株L2在不同氮源條件下的氮平衡，結(jié)合功能基因擴(kuò)增的結(jié)果，可以判斷菌株L2是一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌，能夠分解利用氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮進(jìn)行生長(zhǎng)和脫氮，三種氮源的去除主要通過(guò)菌株L2的同化作用和異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用，其中一部分氮素被菌株L2同化為細(xì)胞內(nèi)源氮，一部分被菌株通過(guò)異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用轉(zhuǎn)化為氮?dú)?，菌株在氨氮中的生長(zhǎng)和脫氮情況最好，硝態(tài)氮次之，亞硝態(tài)氮最差。推測(cè)菌株L2完整的脫氮路徑為通路1：NH4+→NH2OH→NO2-→NO3-→NO2-→NO→N2O→N2，見圖7。

圖7 菌株L2推測(cè)脫氮路徑Fig.7 Strain L2 speculated denitrification pathway

3 結(jié)論

本研究從環(huán)境中篩選出一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌P.mendocinaL2，探究了C/N、溫度、接種量對(duì)其生長(zhǎng)和脫氮情況的影響，并在最適條件下探究了菌株L2對(duì)于氨氮的分解利用情況，作出48 h氮循環(huán)分析，通過(guò)分子生物學(xué)手段擴(kuò)增出菌株L2內(nèi)氮轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵基因并進(jìn)行簡(jiǎn)單的酶學(xué)分析，結(jié)合氮循環(huán)分析菌株L2的氮轉(zhuǎn)化途徑。通過(guò)研究得出如下結(jié)論：

（1）菌株L2為革蘭氏陰性細(xì)菌，為門多薩假單胞菌，將其命名為P.mendocinaL2。已報(bào)道的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株中假單胞菌屬（Pseudomonas）、副球菌屬（Paracoccus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）菌占多數(shù)，故菌株L2的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化潛能較高。

（2）通過(guò)探究不同因素對(duì)菌株L2的生長(zhǎng)和氮轉(zhuǎn)化情況的影響，發(fā)現(xiàn)在C/N為15，培養(yǎng)溫度為30℃，接種量為1%時(shí)菌株L2的生長(zhǎng)和脫氮狀況達(dá)到最佳，表明菌株L2不需要嚴(yán)苛的環(huán)境條件即可表現(xiàn)出高效的脫氮能力。

（3）從菌株L2代謝的氮平衡分析來(lái)看，含氮污染物的降解主要有兩條途徑：一大部分通過(guò)同化作用轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)源氮；另一部分經(jīng)異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮，這與目前研究發(fā)現(xiàn)的其他異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株的氮代謝途徑一致[12]。

（4）使用各個(gè)基因的特定引物對(duì)菌株L2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收產(chǎn)物連接T載體pMD18T進(jìn)行大腸桿菌（DH5α）轉(zhuǎn)化。擴(kuò)繁后提取重組質(zhì)粒，使用通用測(cè)序引物對(duì)M13F/M13R測(cè)序后，從L2菌株中擴(kuò)增出氮轉(zhuǎn)化途徑相關(guān)基因，結(jié)合不同氮源條件下菌株L2的氮轉(zhuǎn)化情況，推測(cè)菌株L2的完整硝化及反硝化路徑為：NH4+→NH2OH→NO2-→NO3-→NO2-→NO→N2O→N2，這 與A.sp.LAD9[18]以及R.sp.CPZ24[19]所表現(xiàn)出的完全硝化-反硝化路徑相同。

由實(shí)驗(yàn)可知，菌株L2作為異養(yǎng)硝化細(xì)菌，其生長(zhǎng)繁殖速度遠(yuǎn)高于自養(yǎng)硝化細(xì)菌，在快速的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中會(huì)同化大量的氮素用以合成蛋白質(zhì)、核酸等大分子。雖然大部分氨氮被同化為細(xì)胞內(nèi)源氮，但在污水處理中能夠通過(guò)污泥的形式將這一部分氮素去除，所以異養(yǎng)硝化細(xì)菌對(duì)于含氮污水的處理仍具有一定的實(shí)用價(jià)值。