侯娟娟，王 艷，高亞東，李春秀，李山峰，孫景昱，張 越，尹建華

(青島匯豐動(dòng)物保健品有限公司，山東青島 266109)

禽流感(avian influenza，AI)俗稱“雞瘟”，從1878年意大利暴發(fā)高致病性禽流感以來[1]，人類對(duì)禽流感的認(rèn)識(shí)不斷增加，1955年，sch?fer[2]證實(shí)“雞瘟”是由A型流感引起的。低致病性禽流感H9N2亞型毒株自1966年被分離發(fā)現(xiàn)至今已有50余年，1994年在我國廣東首次分離到，臨床表現(xiàn)為產(chǎn)蛋下降，并造成一定的死亡，實(shí)驗(yàn)室復(fù)制出典型的臨床癥狀，但不致雞死亡[3]。近年來，禽流感在我國部分地區(qū)時(shí)有發(fā)生，對(duì)我國養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失,根據(jù)流感病毒囊膜表面有許多糖蛋白凸起，一類為由血凝素(HA)分子的三聚體構(gòu)成；另一類為由神經(jīng)氨酸酶(NA)分子的四聚體構(gòu)成。根據(jù)HA和NA的不同，可以分為HA(H1～H16)16種，NA(N1～N10)10種。HA是禽流感病毒表面的糖蛋白,是重要的保護(hù)性抗原，其裂解位點(diǎn)的序列可影響AIV致病性的強(qiáng)弱[4]。禽流感病毒會(huì)隨著流行和發(fā)病時(shí)間的延長，同一病毒可能會(huì)從低致病性向高致病性改變，也可能出現(xiàn)因宿主同時(shí)感染多種亞型病毒而發(fā)生不同亞型禽流感病毒間的遺傳重組，形成新的禽流感亞型病毒[5]。筆者將山東部分地區(qū)分離的5份疑似H9亞型禽流感的病死雞解剖采集病料，并進(jìn)行病原分離和鑒定，通過RT-PCR進(jìn)行HA基因擴(kuò)增、測序，結(jié)合查閱文獻(xiàn)資料[6-7]，從美國國家生物信息中心(NCBI)下載參考株等序列進(jìn)行基因序列分析，進(jìn)一步了解所分離的毒株變異情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1樣品與毒株。青島匯豐動(dòng)物保健品有限公司于2020—2021年在山東部分地區(qū)養(yǎng)殖場采集疑似H9亞型禽流感發(fā)病雞群病料5份，分別為HFA9-1WF、HFA9-2CY、HFA9-3XT、HFA9-4LW、HFA9-5LC。

1.1.2試劑及引物。 H9亞型禽流感病毒特異性血清、禽流感(H5、H7亞型)陽性血清、雞新城疫陽性血清、減蛋綜合征陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品檢查所；病毒核酸提取試劑盒購自北京索萊寶公司；RandomPrimer[nonadeoxyribonucleotide mixture;pd(N)9]、Recombinant RNase Inhibitor、dNTP Mixture、M-MLV、5×Buffer、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye) 購自Takara公司；引物由青島匯豐動(dòng)物保健品有限公司提供。

1.1.3SPF蛋、SPF雞。購自濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司。

1.2 儀器超凈工作臺(tái)，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，購自德國 Sigma公司；渦旋器，購自其林貝爾儀器制造有限公司；梯度 PCR 儀，購自美國 ABI公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，購自法國 Vilber Lourmat公司；瓊脂糖水平電泳槽，購自北京六一儀器廠；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，購自天津市萊玻特瑞設(shè)備有限公司；金屬浴，購自杭州博日科技股份有限公司；各種量程移液槍，購自 Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1病料采集與處理。從發(fā)病雞群中挑出有典型臨床癥狀的雞,解剖采集病雞氣管、肝臟、肺臟等病變嚴(yán)重的部位，用滅菌生理鹽水沖洗，再剪碎，以1∶5(W/V)加入滅菌生理鹽水,用研磨器研磨勻漿后，反復(fù)凍融3次,6 000 r/min離心10 min,取上清過濾除菌后加雙抗,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2病毒分離-雞胚接種。將“1.3.1”中制備的組織液分別經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，每份組織液接種5枚雞胚，接后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵化，將24 h內(nèi)死亡的雞胚棄去，收獲24～96 h死亡的雞胚，測定其HA效價(jià)，并通過PCR方法進(jìn)行鑒定。

1.4 血凝試驗(yàn)

1.4.1紅細(xì)胞懸液制備。選2～4只2～6月齡公雞，將血液采集到含有抗凝劑的溶液中混合均勻，以1 500 r/min離心5 min，吸棄上清，再加入原體積生理鹽水懸浮紅細(xì)胞并離心洗滌，共離心洗滌3～4次，直至上清液無色清亮。最后一次離心以2 000 r/min離心5 min。吸棄上清液，將沉淀的紅細(xì)胞搖勻后吸取1 mL加入99 mL生理鹽水搖勻配制成1%紅細(xì)胞懸液。

1.4.2紅細(xì)胞凝集價(jià)(HA)。將“1.3.1”中收取的尿囊液分別進(jìn)行血凝試驗(yàn)，在96孔微量板上每孔加入25 μL生理鹽水，再用加樣器吸取25 μL待檢樣品加入第1孔中，吹打混勻后吸取25 μL加入第2孔中依次作倍比稀釋直至所需倍數(shù)孔，并吸棄25 μL，最后孔留作陰性對(duì)照。稀釋完成后，每孔加入25 μL 1%紅細(xì)胞懸液，并振蕩混勻，于37 ℃ 15 min觀察結(jié)果。

1.5 血凝抑制試驗(yàn)將分離株分別與抗H9亞型禽流感病毒特異性血清、禽流感(H5、H7亞型)陽性血清、雞新城疫陽性血清、減蛋綜合征陽性血清反應(yīng)。

1.5.1四單位配制。4個(gè)100%血凝單位(即4HAU)血凝素的配制根據(jù)現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄方法。

1.5.2血凝抑制試驗(yàn)(HI)。用生理鹽水將被檢血清2倍比稀釋，吹吸7±2次混勻，加入含4HAU的血凝素液，并設(shè)立生理鹽水(即紅細(xì)胞)和血凝素對(duì)照，充分振蕩后在37 ℃作用15 min；再加入1%紅細(xì)胞懸液，靜置室溫40 min或37 ℃ 15 min，判定結(jié)果,以100%紅細(xì)胞凝集抑制的血清最高稀釋度作為判定終點(diǎn)(即血清凝集抑制價(jià))。

1.6 樣品病毒RNA提取用索萊寶總RNA提取試劑盒(Total RNA Extraction Kit)提取樣品RNA。

1.7 病毒RNA反轉(zhuǎn)錄(RT)和PCR擴(kuò)增

1.7.1反轉(zhuǎn)錄體系?？傮w積 20 μL:2.0 μL dNTP Mixture、4.0 μL 5×Buffer、0.5 μL M-MLV、1.0 μL RandomPrimer(nonadeoxyribonucleotide mixture;pd(N)9)、0.5 μL Recombinant RNase Inhibitor、12.0 μL RNA。反轉(zhuǎn)錄程序:30 ℃ 10 min 、42 ℃ 1 h。

1.7.2PCR擴(kuò)增體系?？傮w積 25 μL:9.5 μL ddH2O、12.5 μL PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye)、0.5 μL 上游引物、0.5 μL 下游引物、2.0 μL DNA。PCR程序:95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.8 電泳鑒定配制濃度為1%的瓊脂糖凝膠，在電泳槽中加入TAE溶液，分別在凝膠孔中加入PCR擴(kuò)增樣品、DNA Marker 2 000 bp、對(duì)照，電泳30 min后，通過紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.9 基因序列測定與Blast分析將擴(kuò)增并經(jīng)電泳鑒定后的PCR產(chǎn)物送往擎科生物科技有限公司測序，將測序結(jié)果拼接后在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)在線Blast系統(tǒng)比對(duì)序列。

1.10 序列分析在美國國家生物信息中心(NCBI)網(wǎng)站下載H9亞型毒株參考株和疫苗株的HA基因序列，同分離株樣品測序結(jié)果用MegAlign進(jìn)行HA基因序列分析，繪制進(jìn)化樹，并進(jìn)行核苷酸同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料在雞胚上的分離結(jié)果將采集于各地的5份病料組織液經(jīng)尿囊腔接種于10日齡SPF雞胚，連續(xù)觀察72 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5份樣品在60～72 h出現(xiàn)不同數(shù)量的死亡，分別收取各組雞胚尿囊液進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表1 。

表1 5份病料在雞胚上的分離結(jié)果

2.2 血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果5份尿囊液樣品HA效價(jià)均在1∶128～1∶256，各組樣品對(duì)H9亞型禽流感病毒特異性血清的HI效價(jià)在1∶102 4～1∶512 0，對(duì)禽流感(H5、H7亞型)陽性血清、雞新城疫陽性血清、減蛋綜合征陽性血清HI效價(jià)均為0(表2)。

表2 血凝抑制(HI)試驗(yàn)結(jié)果

2.3 PCR擴(kuò)增與電泳結(jié)果將5份尿囊液樣品提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增后，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，5份樣品均在1 600 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期片段大小相符，并無其他雜帶，說明擴(kuò)增的目的基因產(chǎn)物特異性較高。

2.4 測序與Blast結(jié)果將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送至青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，5份樣品均測序成功。分別將基因序列經(jīng)Seqman軟件拼接后，在美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI上進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示，與5份樣品同源性最高的均為H9N2 亞型禽流感病毒。

2.5HA基因核苷酸序列分析根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道[8],H9亞型禽流感分為歐亞系、北美系兩大分支，北美系的代表株是A/turkey/Wisconsin/66(H9N2)，歐亞系分支分為 Ⅰ 群、Ⅱ 群和Ⅲ群3個(gè)亞系，分別以A/Duck/HongKong/Y280/97(H9N2)、A/Quail/HongKong/G1/97 (H9N2)、A/Duck/HongKong/Y439/97(H9N2)為代表株。將分離的6個(gè)毒株的HA基因序列與從GenBank 中選出并下載的H9亞型毒株參考株和疫苗株的HA基因序列進(jìn)行比對(duì)(表3)，并繪制進(jìn)化樹。經(jīng)過序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示，分離的6個(gè)毒株之間的H9 亞型禽流感病毒HA基因核苷酸同源性為 93.3%～97.2%，并且它們處于同一分支，與參考株A/chicken/Beijing/1/1994(H9N2)的核苷酸同源性在85.9%～87.1%，與A/chicken/Henan/G19/2011(H9N2)的同源性較高，在89.2%～89.8%，與北美系代表株A/turkey/Wisconsin/66(H9N2)的同源性較低，在74.7%～76.2%；與疫苗株A/chicken/Jiangsu/WJ57/2012(H9N2)的核苷酸同源性最高，在92.1%～93.5%，與A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)的同源性在90.3%～91.7%。由圖2可知，A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)、A/chicken/Jiangsu/WJ57/2012(H9N2)與歐亞系 Ⅰ 群的A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)在同一分支，A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)是歐亞系Ⅰ群h9.4.2.5的代表株，而6個(gè)分離株與A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)在同一支，且同源性較高，因此該試驗(yàn)所分離的5個(gè)毒株均屬于歐亞系Ⅰ 群h9.4.2.5分支。

注：M.DL 2000D Marker;1.HFA9-1WF;2.HFA9-2CY;3.HFA9-3XT;4.HFA9-4LW;5.HFA9-5LC;A.陽性對(duì)照；B.陰性對(duì)照；C.空白對(duì)照Note:M.DL 2000D Marker; 1.HFA9-1WF; 2.HFA9-2CY; 3.HFA9-3XT; 4.HFA9-4LW; 5.HFA9-5LC; A.Positive control; B.Negative control; C.Blank control圖1 5份分離株P(guān)CR電泳結(jié)果Fig.1 PCR electrophoresis results of 5 isolates

表3 選取的H9亞型AIV參考株和疫苗株的情況

圖2 5株H9N2亞型AIV分離株HA基因進(jìn)化樹分析Fig.2 Analysis of HA gene evolution tree of 5 H9N2 subtype AIV isolates

3 討論與小結(jié)

(1)該研究對(duì)5份疑似H9亞型禽流感病料進(jìn)行分離、鑒定，確定所分離的5份毒株均為H9N2亞型禽流感，并對(duì)5個(gè)毒株進(jìn)行測序，與從美國國家生物信息中心(NCBI)下載的序列進(jìn)行比對(duì)分析，并繪制進(jìn)化樹，通過分析顯示，所分離的5個(gè)毒株均屬于歐亞系 Ⅰ 群h9.4.2.5分支，5個(gè)毒株的H9 亞型禽流感病毒HA基因核苷酸同源性為 93.3%～97.2%，分離株與參考株A/chicken/Henan/G19/2011(H9N2)的同源性在89.2%～89.8%，與其親緣關(guān)系最近的疫苗株A/chicken/Jiangsu/WJ57/2012(H9N2)的同源性在92.1%～93.5%，說明分離株與參考株和傳統(tǒng)的疫苗株產(chǎn)生了一定的遺傳距離，出現(xiàn)了抗原差異。

(2)對(duì)于H9亞型禽流感病毒的防控，免疫接種仍是有效的防控措施，然而隨著疫苗的長期使用，免疫壓力的出現(xiàn)，使H9N2亞型禽流感毒株發(fā)生變異和重組[9-10]，如果疫苗株與流行株匹配度不高，就會(huì)導(dǎo)致疫苗株的保護(hù)率下降。因此，對(duì)于H9N2亞型禽流感的流行、變異情況的持續(xù)跟蹤和監(jiān)測，對(duì)篩選疫苗候選株有重要意義，今后可繼續(xù)推進(jìn)疫苗的研發(fā)，使H9N2亞型禽流感得到更有效的防控，這對(duì)了解該地區(qū)的H9亞型禽流感流行的變異情況及疫情防控對(duì)策具有重要意義。