陳麗君 李冰心 曹 楠 付新亮 楊保和 袁明鳳許丹寧 田允波 黃運茂 李婉雁*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院動物科技學院，廣州510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣州510225；3.云南快大多畜牧科技有限公司，玉溪653100)

鵝是一種半旱養(yǎng)動物，養(yǎng)殖過程中需要不定期下水，高溫、高濕的環(huán)境使得水中的細菌增加，導致鵝體內(nèi)積聚的脂多糖(LPS)增加。在鵝的育雛期，免疫器官的發(fā)育尚未完全，因此極易因LPS的積聚影響雛鵝免疫器官的生長發(fā)育，抑制雛鵝的免疫功能。胸腺是雛鵝的中樞免疫器官，是T淋巴細胞分化和發(fā)育的場所，因此胸腺對雛鵝的免疫功能有著重要作用[1]。胸腺中含有胸腺細胞、胸腺上皮細胞、T細胞等多種細胞，可以通過發(fā)生細胞凋亡來維持機體平衡，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。但當器官受到不良刺激時，細胞凋亡會增加，過多的細胞凋亡會打破免疫功能平衡，這種平衡一旦被破壞，將導致雛鵝的免疫器官發(fā)育不全、免疫功能損傷等嚴重后果[2-3]。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，具有細菌毒素作用。目前研究指出，LPS引起機體損傷的作用機制有以下2種，一是作用于免疫細胞、上皮細胞等靶細胞，使表面分子異常并增加細胞通透性，導致功能性損傷；二是通過激活免疫細胞，使其分泌大量炎性介質(zhì)并引起炎癥[4-6]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)LPS會導致機體的氧化應激及細胞凋亡的水平增加，如LPS處理小鼠的胸腺細胞凋亡等水平增加，從而抑制機體的免疫功能。前期的研究表明，LPS作為Toll樣受體4(TLR4)的配體，通過核因子-κB(NF-κB)信號通路激活炎性細胞因子的表達，引起機體發(fā)生炎癥，同時機體發(fā)生氧化應激進一步加劇炎癥反應，使得組織中的炎性因子失調(diào)。LPS會導致氧化應激和炎癥細胞因子的增加，氧化應激和炎癥細胞因子的增加也是導致細胞凋亡的關鍵因素，因此LPS會進一步促進細胞凋亡的發(fā)生[7-9]。

細胞凋亡是機體中常發(fā)生的細胞死亡現(xiàn)象之一，主要通過線粒體和死亡受體信號通路進行調(diào)控。線粒體途徑起源于細胞內(nèi)部應激，如DNA損傷或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，受B細胞白血病/淋巴瘤-2(Bcl-2)、B細胞白血病/淋巴瘤-2相關X蛋白(Bax)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3(Caspase-3)等基因的調(diào)控[10-12]。死亡受體途徑始于對細胞的外部刺激，由細胞外特定因子的濃度達到特定閾值等原因觸發(fā)，導致致死信號或依賴性受體的轉(zhuǎn)導，刺激半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-8(Caspase-8)激活，進而激活Caspase-3，誘導細胞凋亡[13-14]。線粒體和死亡受體信號通路共同作用，參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)。

近年來，關于中藥提取物對畜禽的炎癥、氧化應激、細胞凋亡等方面的預防作用得到越來越多的關注。白術多糖(polysaccharide ofAtractylodesmacrocephalaKoidz，PAMK)是中藥白術的有效生物活性成分，具有綠色、天然、無殘留、無毒副作用等特點，被研究證實具有抗炎、抗氧化等作用，可通過調(diào)節(jié)免疫細胞的增殖和活化、炎性細胞因子分泌等來調(diào)節(jié)機體的免疫功能，以此維持免疫系統(tǒng)的平衡[15-17]。據(jù)報道，PAMK可以下調(diào)雛鵝脾臟和腸道中白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎細胞因子的水平[18-19]。PAMK也可降低氧化應激來緩解熱應激引起的雞脾臟免疫功能障礙，增強線粒體功能，從而抑制細胞凋亡[20]。盡管已經(jīng)證明PAMK對雛鵝的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用，但是PAMK對LPS誘導的雛鵝胸腺細胞凋亡是否具有保護作用及其可能的調(diào)控機制仍需要進一步研究。因此，本研究通過在飼糧中添加PAMK，同時注射LPS以引起雛鵝胸腺細胞凋亡，觀察胸腺超微結(jié)構(gòu)變化，檢測炎性細胞因子、氧化應激、凋亡相關基因等指標的變化，探索PAMK是否通過線粒體途徑和死亡受體途徑對LPS誘導的胸腺細胞凋亡具有保護作用，為進一步研究和開發(fā)PAMK作為一種新型的、綠色的飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選擇80只1日齡馬崗鵝，預飼3 d后隨機分為4組，分別為對照組(CON組)、白術多糖組(PAMK組)、脂多糖組(LPS組)、脂多糖+白術多糖組(LPS+PAMK組)，每組4個重復，每個重復5只，組間體重差異不顯著(P>0.05)。CON組和LPS組飼喂基礎飼糧，PAMK組和LPS+PAMK組在基礎飼糧中添加400 mg/kg PAMK。CON組和PAMK組分別在雛鵝第24、26、28日齡腹腔注射1 mL生理鹽水；LPS組和LPS+PAMK組分別在雛鵝第24、26、28日齡腹腔注射2 mg/kg LPS溶液。

1.2 飼養(yǎng)管理及樣品采集

試驗鵝購自清遠金羽豐鵝業(yè)有限公司，飼養(yǎng)試驗在仲愷農(nóng)業(yè)工程學院教育基地鵝舍中開展，試驗開始前1周對鵝舍進行嚴格清洗和消毒，試驗全期采用平地散養(yǎng)，試驗鵝自由采食、飲水。預試期3 d，正試期28 d。全程飼養(yǎng)、免疫程序及環(huán)境標準均按《馬崗鵝肉鵝飼養(yǎng)管理技術規(guī)范》(DB 44/T 1595—2015)執(zhí)行。

28日齡注射LPS 1 h后，雛鵝頸靜脈放血處死，迅速采集雛鵝胸腺組織，分別儲存在2.5%戊二醛溶液、多聚甲醛液管中，-80 ℃保存，用于后續(xù)試驗。

1.3 主要試劑

LPS(L2880-100MG)，購自美國Sigma Chemical公司；PAMK(CY201216)，純度為95%，購自楊凌慈緣生物技術有限公司；Trizol(1559602)，購自美國Ambion公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Rr036A)，購自日本TaKaRa公司；實時定量PCR染料2×PowerUpTMSYBRTMGreen PCR Master Mix(A25742)，購自美國Thermo Fisher公司；RIPA細胞裂解液(P0013B)、蛋白酶抑制劑(ST506)和BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010)，均購自上海碧云天生物技術研究所；化學發(fā)光試劑盒(GK10008)，購自于美國GlpBio公司；活性氧(ROS)活性檢測試劑盒(XY-ELA08632)，購于上海心語生物科技有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)(A005-1)、過氧化氫酶(CAT)(A007-1-1)、超氧化物歧化酶(SOD)(A001-3-2)活性檢測試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)快速制備試劑盒(PG112)、快速轉(zhuǎn)膜緩沖液、Tris-甘氨酸-十二烷基硫酸鈉(SDS)電泳緩沖液，均購自上海雅酶生物科技公司；蛋白marker(26616)，購自美國Thermo Fisher公司；β-肌動蛋白(β-actin)一抗(T0022)，購于美國Affinity Biosciences公司；Bcl-2(BA0412)、Bax(BA0315-2)一抗，購于美國Boster公司；Caspase-8一抗(WL03426)，購于萬類生物科技有限公司；山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(E1WP318)，購于美國EnoGene公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 胸腺組織石蠟包埋及蘇木精-伊紅(HE)染色

使用光學顯微鏡觀察胸腺組織形態(tài)。將4組的胸腺組織樣品固定在4%緩沖多聚甲醛中并包埋在石蠟中保存。將組織切片成厚度為5 μm并進行HE染色(哈里斯蘇木精2 min，1%伊紅30 s)，在正置顯微鏡(Nikon Eclipseci，日本)下觀察分析。

1.4.2 胸腺組織超微結(jié)構(gòu)觀察

使用透射電子顯微鏡觀察胸腺組織的超纖維結(jié)構(gòu)。取約2 mm的新鮮胸腺組織，立即用2.5%戊二醛溶液固定，置于4 ℃保存，送廣州金域醫(yī)學檢驗中心制備電鏡標本，在透射電子顯微鏡(JEM-1400，日本)下觀察分析。

1.4.3 實時熒光定量PCR

采用Trizol法提取雛鵝胸腺組織中總RNA，用于反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)操作說明，SYBR mix 10 μL，焦碳酸二乙酯(DEPC)水7 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，構(gòu)建20 μL反應體系，反應條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，在實時熒光定量PCR儀(ABI PRISM 7500，新加坡)中檢測，以β-actin為內(nèi)參對照，使用2-ΔΔCt法計算目的基因的mRNA相對表達水平。用于熒光定量PCR的引物序列見表1，由華大基因公司合成。

表1 引物序列信息

續(xù)表1基因Genes上游引物Forward primer (5′—3′)下游引物Reverse primer (5′—3′)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-8 Caspase-8GGTGTCGCAGTTCAGGTACATTGTAGTTTCAGGGCTT過氧化氫酶 CATATACAGTTCGTGACCCTCGCCAGAAGTCCCATACCAT超氧化物歧化酶 SODAAATGGGTGTACCAGCGCAGTCTTCTATTTCTACTTCTGCCACTCC谷胱甘肽過氧化物酶 GPXGCAAGGGGTACAAGCCCAACTGATGATGTACTGCGGGTTGGTC白細胞介素-1β IL-1βAAGTGAGGCTCAACATTGCGCGGTAGAAGATGAAGCGGGT白細胞介素-6 IL-6ACGATAAGGCAGATGGTGATTCCAGGTCTTATCCGACTTC白細胞介素-10 IL-10ATCATGACATGGACCCGGTAATTGCTCCATGACAGTTGCT腫瘤壞死因子-α TNF-αATGAACCCTCCTCCGTACACAGAGGCCACCACATGATAGC

1.4.4 抗氧化指標測定

剪取0.1 g的胸腺組織，按照胸腺重量(g)和磷酸鹽緩沖液體積(mL)比例為1∶9置于勻漿機勻漿，3 000 r/min離心15 min，離心后取上清即為10%的組織勻漿，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。按照ROS、CAT、SOD、GPX試劑盒操作說明檢測各樣品中抗氧化指標的活性。

1.4.5 蛋白免疫印跡分析(Western blot)

按照胸腺重量(g)和RIPA細胞裂解液體積(mL)比例為1∶9提取胸腺組織總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。樣品在95 ℃變性后，用10% SDS-PAGE分離等量蛋白，恒流200 mA轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，然后在4 ℃下分別用β-actin、Bax、Bcl-2、Caspase-8一抗(1∶1 000)孵育過夜。膜在磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)中清洗0.5 h后與二抗(1∶10 000)在室溫下孵育1 h，清洗0.5 h后用化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5200，上海天能科技有限公司)檢測蛋白表達。使用Image J軟件分析蛋白質(zhì)條帶灰度值，使用β-actin為內(nèi)參對照，蛋白相對表達量用目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件進行分析單因素方差分析，采用Turkey法進行組間多重比較檢驗。用Graph Prim 7.0軟件進行作圖。所有結(jié)果均以平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺組織病理損傷的影響

為了評估PAMK對LPS引起的胸腺組織病理損傷的潛在保護作用，進行了胸腺組織的石蠟包埋及HE染色，并進行了胸腺組織病理學觀察。結(jié)果如圖1所示，LPS組與CON組和PAMK組相比，紅髓中出現(xiàn)較多的空泡和細胞碎片；但LPS+PAMK組紅髓中空泡和細胞碎片較少，細胞排列較緊密。這些結(jié)果表明，PAMK可以緩解LPS引起的雛鵝胸腺組織病理損傷。

A：CON組 CON group；B：PAMK組 PAMK group；C：LPS組 LPS group；D：LPS+PAMK組 LPS+PAMK group。圖片白色箭頭指示為組織空泡化且有碎片。The white arrow represents for vacuoles and debris tissue.

2.2 PAMK對LPS處理雛鵝胸腺組織超顯微結(jié)構(gòu)的影響

雛鵝胸腺組織的透射電鏡結(jié)果如圖2所示，CON組胸腺細胞維持圓形或微橢圓形的細胞形態(tài)(圖2-a、圖2-e，白色箭頭)，胞質(zhì)均勻，核較大，線粒體呈棒狀或者球狀(圖2-e，藍色箭頭)，并無發(fā)生染色質(zhì)聚集現(xiàn)象；PAMK組細胞未觀察到異常(圖2-b、圖2-f)；LPS組的雛鵝胸腺組織發(fā)生明顯的病理變化(圖2-c、圖2-g)，可見大部分細胞體積變小，形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)濃縮，出現(xiàn)邊緣化(圖2-c，黑色箭頭)，部分細胞的線粒體發(fā)生腫脹、嵴斷裂、空泡化等現(xiàn)象(圖2-g，綠色箭頭)，可見典型的凋亡小體(圖2-g，紅色箭頭)。LPS+PAMK組的大部分的細胞形態(tài)接近正常(圖2-d、圖2-h)，胞質(zhì)均勻，核呈現(xiàn)圓形，出現(xiàn)少量的凋亡小體，具有比LPS組更緊密的排列。這些結(jié)果表明，PAMK可以減輕LPS誘導的雛鵝胸腺細胞凋亡。

圖2 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺組織超顯微結(jié)構(gòu)的影響

2.3 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺中炎性細胞因子mRNA相對表達水平的影響

IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α作為關鍵的促炎因子，與氧化應激、凋亡等細胞活動有著密切的相關性[21]。為了闡明PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺中炎性細胞因子的影響，采用熒光定量PCR方法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10的mRNA相對表達水平。結(jié)果如圖3所示，與CON組相比，PAMK組的IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相對表達水平無顯著差異(P>0.05)，IL-10的mRNA相對表達水平顯著下降(P<0.05)；而LPS組的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10的mRNA相對表達水平顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比，LPS+PAMK組的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10的mRNA相對表達水平顯著降低(P<0.05)。這些結(jié)果表明，PAMK可緩解LPS引起的雛鵝胸腺中炎性細胞因子水平升高。

2.4 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺中ROS含量及CAT、GPX、SOD的mRNA相對表達水平和活性的影響

為研究PAMK對氧化應激的影響，在本研究首先檢測了胸腺組織中ROS含量。結(jié)果如圖4所示，與CON組相比，LPS組ROS含量增加了1.11倍(P>0.05)；與LPS組相比，LPS+PAMK組ROS含量減少了0.73倍(P>0.05)。此外，PAMK組的ROS含量與CON組相比顯著下降(P<0.05)，說明PAMK具有下調(diào)ROS含量的作用。

此外，檢測了胸腺組織中CAT、GPX、SOD的mRNA相對表達水平和活性，結(jié)果如圖5所示，與CON組相比，LPS組CAT的mRNA相對表達水平顯著降低(P<0.05)，GPX的mRNA相對表達水平顯著升高(P<0.05)，SOD的mRNA相對表達水平無顯著差異(P>0.05)。與LPS組相比，PAMK+LPS組CAT、SOD的mRNA相對表達水平顯著升高(P<0.05)，GPX的mRNA相對表達水平顯著降低(P>0.05)。酶活性結(jié)果顯示，LPS組的CAT(P>0.05)、GPX(P>0.05)和SOD(P<0.05)活性不同程度低于CON組和LPS+PAMK組。這些結(jié)果表明，PAMK能緩解LPS引起的雛鵝胸腺組織的氧化應激。

數(shù)據(jù)柱標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

圖4 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺中

2.5 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺中凋亡相關基因mRNA相對表達水平的影響

使用熒光定量PCR技術檢測Bax、Caspase-3、Bcl-2、腫瘤蛋白63(TP63)、Caspase-8等凋亡相關基因的mRNA相對表達水平來闡明PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺組織細胞凋亡的影響。結(jié)果如圖4所示，與CON組相比，PAMK組Bax、TP63的mRNA相對表達水平無顯著差異(P>0.05)，Caspase-3的mRNA相對表達水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2、Caspase-8的mRNA相對表達水平顯著升高(P<0.05)；LPS組Bax、Caspase-3的mRNA相對表達水平顯著升高(P<0.05)，TP63、Bcl-2的mRNA相對表達水平顯著降低(P<0.05)，Caspase-8的mRNA相對表達水平無顯著差異(P>0.05)。與LPS組相比，LPS+PAMK組Bax、Caspase-3的mRNA相對表達水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2、Caspase-8、TP63的mRNA相對表達水平表達顯著升高(P<0.05)。這些結(jié)果表明，PAMK可以緩解LPS處理的雛鵝胸腺細胞凋亡。

2.6 PAMK對LPS處理的鵝胸腺中凋亡相關蛋白相對表達水平的影響

采用了Western blot方法檢測蛋白相對表達水平進一步證實PAMK對LPS引起的胸腺細胞凋亡的緩解作用。由圖7可知，與CON組相比，PAMK組Bax、Caspase-8的蛋白相對表達水平無顯著差異(P>0.05)，Bcl-2的蛋白相對表達水平顯著下降(P<0.05)；LPS組Bax、Caspase-8的蛋白相對表達水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2的蛋白相對表達水平顯著下降(P<0.05)。與LPS組相比，LPS+PAMK組Bax、Caspase-8的蛋白相對表達水平顯著下降(P<0.05)，Bcl-2的蛋白相對表達水平顯著升高(P<0.05)。這些結(jié)果表明，PAMK對健康雛鵝的中的凋亡相關蛋白無顯著影響，但可以緩解LPS刺激下胸腺組織中凋亡相關蛋白表達水平的上升。

圖5 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺中CAT、GPX、SOD的mRNA相對表達水平和活性的影響

圖6 PAMK對LPS處理雛鵝胸腺中凋亡相關基因mRNA相對表達水平的影響

圖7 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺細胞凋亡相關蛋白相對表達水平的影響

3 討 論

胸腺是雛鵝的中樞免疫器官，也是T淋巴細胞發(fā)育和分化的地方，其中胸腺組織中的胸腺細胞也對T淋巴細胞孵育具有重要作用，因此胸腺的生長發(fā)育水平及組織形態(tài)的情況，均對雛鵝的免疫功能有著重要作用[1]。細胞凋亡本質(zhì)上是一種程序性細胞死亡，能有效地清除機體內(nèi)衰老、畸變、損傷等細胞，在一定程度上對機體具有自我保護的作用。然而，在某些不良刺激或病理條件下，細胞凋亡的水平會增加，從而引起組織損傷。已有研究表明，細胞凋亡對不同刺激有不同的形態(tài)學特征，如細胞收縮、質(zhì)膜起泡、染色質(zhì)凝聚，最終細胞都碎裂成凋亡小體，這些小體被吞噬后引發(fā)炎癥反應[22-23]。本試驗結(jié)果顯示，LPS組的胸腺組織結(jié)構(gòu)完整性被破壞，凋亡小體增多，可見細胞凋亡的典型特征，與之前的研究相似，這些結(jié)果為LPS誘導雛鵝胸腺細胞凋亡模型制備成功提供了證據(jù)。有研究表明，PAMK對熱應激、環(huán)磷酰胺等不同刺激導致的凋亡有明顯的緩解作用[24]。本試驗同樣發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加400 mg/kg PAMK能減少LPS引起的凋亡小體、線粒體損傷等凋亡現(xiàn)象，這些結(jié)果表明PAMK可以緩解由LPS引起的凋亡，然而PAMK的抗凋亡機制尚不清楚。

氧化應激和炎癥因子水平的增加是導致細胞凋亡的關鍵因素，因此PAMK緩解LPS誘導細胞凋亡作用可能與二者的水平相關。細胞凋亡是通過促炎介質(zhì)誘導的，如發(fā)揮多功能作用的TNF-α，可以與死亡受體(TNF receptor，TNFR)結(jié)合，并可能通過激活Caspase-3和Caspase-8直接誘導細胞凋亡[25-26]。研究表明，LPS可通過增加TNF-α、IL-6和IL-10等細胞因子水平從而誘導細胞凋亡[27-29]。因此，具有抗炎作用的植物提取物也可通過下調(diào)炎性因子的水平參與緩解細胞凋亡水平，如原花青素、黃芩苷[30-31]。研究表明，PAMK可降低LPS誘導的小腸等器官中的炎性細胞因子水平。本試驗結(jié)果也在前人的研究基礎上得到進一步的驗證，PAMK顯著降低LPS處理下胸腺組織中細胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10)的表達，這可能是其緩解細胞凋亡的作用方式之一。

在氧化應激水平增加且不能及時緩解的情況下，也可引發(fā)細胞凋亡。本試驗檢測了ROS含量及CAT、GPX、SOD等基因表達和酶活性，結(jié)果表明LPS有提高胸腺組織中ROS含量和抑制CAT、GPX和SOD活性的趨勢，提示LPS誘導雛鵝胸腺發(fā)生氧化應激。透射電鏡結(jié)果顯示LPS組線粒體嵴斷裂、染色質(zhì)凝集等特征，這有理由認為是線粒體發(fā)生氧化損傷并導致促凋亡蛋白釋放到細胞質(zhì)中，從而導致細胞凋亡。本結(jié)果也表明，PAMK可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達和提高機體內(nèi)酶活性而提高抗氧化功能。我們試圖證明PAMK通過氧化應激和細胞因子緩解免疫器官中凋亡，然而其中的串擾關系極其復雜，需要更多的研究來闡明PAMK與LPS處理的雛鵝胸腺中的細胞凋亡、炎癥和氧化應激相關的機制。因此，需進一步試驗分析PAMK是否通過線粒體或死亡受體凋亡途徑參與緩解胸腺細胞凋亡的過程。

已知LPS可通過激活死亡受體途徑與線粒體凋亡途徑引起凋亡[30]。Bcl-2和Bax是細胞凋亡調(diào)控中最重要的基因，Bcl-2/Bax信號通路在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本研究中，LPS處理顯著上調(diào)了Bax、Caspase-3的表達和下調(diào)了Bcl-2的表達，與之前的研究一致。有趣的是，PAMK顯著調(diào)節(jié)了LPS誘導組織中這些基因和蛋白表達水平。這表明PAMK對LPS誘導的細胞凋亡的抑制作用可能與胸腺組織中Bax/Bcl-2信號通路的調(diào)節(jié)有關。死亡受體途徑可以通過激活死亡受體來誘導，如Fas，這需要與Fas配體(FasL)結(jié)合，然后通過Fas相關死亡域(FADD)激活Caspase-8[32]。在本研究中檢測了死亡受體關鍵蛋白Caspase-8的表達，結(jié)果顯示LPS處理顯著上調(diào)了其mRNA表達，而PAMK顯著下調(diào)了其蛋白表達，PAMK對LPS誘導的細胞凋亡的抑制作用可能與胸腺組織中死亡受體途徑信號通路的調(diào)節(jié)有關。此外，本試驗結(jié)果顯示，LPS處理顯著下調(diào)了TP63的mRNA表達，有研究表明TP63的同型異構(gòu)體TAP63α既可以激活死亡受體途徑又可以激活線粒體途徑[33]，目前較少有研究證明TP63是否是LPS激活死亡受體途徑與線粒體凋亡途徑發(fā)生串擾的關鍵，有趣的是PAMK顯著上調(diào)了TP63的mRNA表達。

本研究還發(fā)現(xiàn)單獨加PAMK對凋亡信號通路的表達不會有明顯變化，能夠維持信號通路的穩(wěn)定性，因此可以認為PAMK作用與雛鵝胸腺組織不會引起凋亡，本試驗的組織結(jié)構(gòu)觀察也證實了這點。本研究在分子層面初步解釋了PAMK可能通過線粒體及死亡受體途徑關鍵基因的抑制，緩解LPS誘導細胞凋亡。

4 結(jié) 論

PAMK可抑制LPS引起的氧化應激、炎性細胞因子水平上升，通過線粒體及死亡受體途徑緩解雛鵝胸腺細胞凋亡，并維持胸腺組織的結(jié)構(gòu)完整性。