陳麗君 李冰心 曹 楠 付新亮 楊保和 袁明鳳許丹寧 田允波 黃運(yùn)茂 李婉雁*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣州510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510225；3.云南快大多畜牧科技有限公司，玉溪653100)

鵝是一種半旱養(yǎng)動物，養(yǎng)殖過程中需要不定期下水，高溫、高濕的環(huán)境使得水中的細(xì)菌增加，導(dǎo)致鵝體內(nèi)積聚的脂多糖(LPS)增加。在鵝的育雛期，免疫器官的發(fā)育尚未完全，因此極易因LPS的積聚影響雛鵝免疫器官的生長發(fā)育，抑制雛鵝的免疫功能。胸腺是雛鵝的中樞免疫器官，是T淋巴細(xì)胞分化和發(fā)育的場所，因此胸腺對雛鵝的免疫功能有著重要作用[1]。胸腺中含有胸腺細(xì)胞、胸腺上皮細(xì)胞、T細(xì)胞等多種細(xì)胞，可以通過發(fā)生細(xì)胞凋亡來維持機(jī)體平衡，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。但當(dāng)器官受到不良刺激時(shí)，細(xì)胞凋亡會增加，過多的細(xì)胞凋亡會打破免疫功能平衡，這種平衡一旦被破壞，將導(dǎo)致雛鵝的免疫器官發(fā)育不全、免疫功能損傷等嚴(yán)重后果[2-3]。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，具有細(xì)菌毒素作用。目前研究指出，LPS引起機(jī)體損傷的作用機(jī)制有以下2種，一是作用于免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞等靶細(xì)胞，使表面分子異常并增加細(xì)胞通透性，導(dǎo)致功能性損傷；二是通過激活免疫細(xì)胞，使其分泌大量炎性介質(zhì)并引起炎癥[4-6]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)LPS會導(dǎo)致機(jī)體的氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的水平增加，如LPS處理小鼠的胸腺細(xì)胞凋亡等水平增加，從而抑制機(jī)體的免疫功能。前期的研究表明，LPS作為Toll樣受體4(TLR4)的配體，通過核因子-κB(NF-κB)信號通路激活炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，引起機(jī)體發(fā)生炎癥，同時(shí)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，使得組織中的炎性因子失調(diào)。LPS會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥細(xì)胞因子的增加，氧化應(yīng)激和炎癥細(xì)胞因子的增加也是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，因此LPS會進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[7-9]。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體中常發(fā)生的細(xì)胞死亡現(xiàn)象之一，主要通過線粒體和死亡受體信號通路進(jìn)行調(diào)控。線粒體途徑起源于細(xì)胞內(nèi)部應(yīng)激，如DNA損傷或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，受B細(xì)胞白血病/淋巴瘤-2(Bcl-2)、B細(xì)胞白血病/淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3(Caspase-3)等基因的調(diào)控[10-12]。死亡受體途徑始于對細(xì)胞的外部刺激，由細(xì)胞外特定因子的濃度達(dá)到特定閾值等原因觸發(fā)，導(dǎo)致致死信號或依賴性受體的轉(zhuǎn)導(dǎo)，刺激半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-8(Caspase-8)激活，進(jìn)而激活Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13-14]。線粒體和死亡受體信號通路共同作用，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。

近年來，關(guān)于中藥提取物對畜禽的炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等方面的預(yù)防作用得到越來越多的關(guān)注。白術(shù)多糖(polysaccharide ofAtractylodesmacrocephalaKoidz，PAMK)是中藥白術(shù)的有效生物活性成分，具有綠色、天然、無殘留、無毒副作用等特點(diǎn)，被研究證實(shí)具有抗炎、抗氧化等作用，可通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖和活化、炎性細(xì)胞因子分泌等來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，以此維持免疫系統(tǒng)的平衡[15-17]。據(jù)報(bào)道，PAMK可以下調(diào)雛鵝脾臟和腸道中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎細(xì)胞因子的水平[18-19]。PAMK也可降低氧化應(yīng)激來緩解熱應(yīng)激引起的雞脾臟免疫功能障礙，增強(qiáng)線粒體功能，從而抑制細(xì)胞凋亡[20]。盡管已經(jīng)證明PAMK對雛鵝的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用，但是PAMK對LPS誘導(dǎo)的雛鵝胸腺細(xì)胞凋亡是否具有保護(hù)作用及其可能的調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。因此，本研究通過在飼糧中添加PAMK，同時(shí)注射LPS以引起雛鵝胸腺細(xì)胞凋亡，觀察胸腺超微結(jié)構(gòu)變化，檢測炎性細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、凋亡相關(guān)基因等指標(biāo)的變化，探索PAMK是否通過線粒體途徑和死亡受體途徑對LPS誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究和開發(fā)PAMK作為一種新型的、綠色的飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇80只1日齡馬崗鵝，預(yù)飼3 d后隨機(jī)分為4組，分別為對照組(CON組)、白術(shù)多糖組(PAMK組)、脂多糖組(LPS組)、脂多糖+白術(shù)多糖組(LPS+PAMK組)，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只，組間體重差異不顯著(P>0.05)。CON組和LPS組飼喂基礎(chǔ)飼糧，PAMK組和LPS+PAMK組在基礎(chǔ)飼糧中添加400 mg/kg PAMK。CON組和PAMK組分別在雛鵝第24、26、28日齡腹腔注射1 mL生理鹽水；LPS組和LPS+PAMK組分別在雛鵝第24、26、28日齡腹腔注射2 mg/kg LPS溶液。

1.2 飼養(yǎng)管理及樣品采集

試驗(yàn)鵝購自清遠(yuǎn)金羽豐鵝業(yè)有限公司，飼養(yǎng)試驗(yàn)在仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院教育基地鵝舍中開展，試驗(yàn)開始前1周對鵝舍進(jìn)行嚴(yán)格清洗和消毒，試驗(yàn)全期采用平地散養(yǎng)，試驗(yàn)鵝自由采食、飲水。預(yù)試期3 d，正試期28 d。全程飼養(yǎng)、免疫程序及環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)均按《馬崗鵝肉鵝飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)范》(DB 44/T 1595—2015)執(zhí)行。

28日齡注射LPS 1 h后，雛鵝頸靜脈放血處死，迅速采集雛鵝胸腺組織，分別儲存在2.5%戊二醛溶液、多聚甲醛液管中，-80 ℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 主要試劑

LPS(L2880-100MG)，購自美國Sigma Chemical公司；PAMK(CY201216)，純度為95%，購自楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司；Trizol(1559602)，購自美國Ambion公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Rr036A)，購自日本TaKaRa公司；實(shí)時(shí)定量PCR染料2×PowerUpTMSYBRTMGreen PCR Master Mix(A25742)，購自美國Thermo Fisher公司；RIPA細(xì)胞裂解液(P0013B)、蛋白酶抑制劑(ST506)和BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010)，均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；化學(xué)發(fā)光試劑盒(GK10008)，購自于美國GlpBio公司；活性氧(ROS)活性檢測試劑盒(XY-ELA08632)，購于上海心語生物科技有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)(A005-1)、過氧化氫酶(CAT)(A007-1-1)、超氧化物歧化酶(SOD)(A001-3-2)活性檢測試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)快速制備試劑盒(PG112)、快速轉(zhuǎn)膜緩沖液、Tris-甘氨酸-十二烷基硫酸鈉(SDS)電泳緩沖液，均購自上海雅酶生物科技公司；蛋白marker(26616)，購自美國Thermo Fisher公司；β-肌動蛋白(β-actin)一抗(T0022)，購于美國Affinity Biosciences公司；Bcl-2(BA0412)、Bax(BA0315-2)一抗，購于美國Boster公司；Caspase-8一抗(WL03426)，購于萬類生物科技有限公司；山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(E1WP318)，購于美國EnoGene公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 胸腺組織石蠟包埋及蘇木精-伊紅(HE)染色

使用光學(xué)顯微鏡觀察胸腺組織形態(tài)。將4組的胸腺組織樣品固定在4%緩沖多聚甲醛中并包埋在石蠟中保存。將組織切片成厚度為5 μm并進(jìn)行HE染色(哈里斯蘇木精2 min，1%伊紅30 s)，在正置顯微鏡(Nikon Eclipseci，日本)下觀察分析。

1.4.2 胸腺組織超微結(jié)構(gòu)觀察

使用透射電子顯微鏡觀察胸腺組織的超纖維結(jié)構(gòu)。取約2 mm的新鮮胸腺組織，立即用2.5%戊二醛溶液固定，置于4 ℃保存，送廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心制備電鏡標(biāo)本，在透射電子顯微鏡(JEM-1400，日本)下觀察分析。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用Trizol法提取雛鵝胸腺組織中總RNA，用于反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)操作說明，SYBR mix 10 μL，焦碳酸二乙酯(DEPC)水7 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI PRISM 7500，新加坡)中檢測，以β-actin為內(nèi)參對照，使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的mRNA相對表達(dá)水平。用于熒光定量PCR的引物序列見表1，由華大基因公司合成。

表1 引物序列信息

續(xù)表1基因Genes上游引物Forward primer (5′—3′)下游引物Reverse primer (5′—3′)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-8 Caspase-8GGTGTCGCAGTTCAGGTACATTGTAGTTTCAGGGCTT過氧化氫酶 CATATACAGTTCGTGACCCTCGCCAGAAGTCCCATACCAT超氧化物歧化酶 SODAAATGGGTGTACCAGCGCAGTCTTCTATTTCTACTTCTGCCACTCC谷胱甘肽過氧化物酶 GPXGCAAGGGGTACAAGCCCAACTGATGATGTACTGCGGGTTGGTC白細(xì)胞介素-1β IL-1βAAGTGAGGCTCAACATTGCGCGGTAGAAGATGAAGCGGGT白細(xì)胞介素-6 IL-6ACGATAAGGCAGATGGTGATTCCAGGTCTTATCCGACTTC白細(xì)胞介素-10 IL-10ATCATGACATGGACCCGGTAATTGCTCCATGACAGTTGCT腫瘤壞死因子-α TNF-αATGAACCCTCCTCCGTACACAGAGGCCACCACATGATAGC

1.4.4 抗氧化指標(biāo)測定

剪取0.1 g的胸腺組織，按照胸腺重量(g)和磷酸鹽緩沖液體積(mL)比例為1∶9置于勻漿機(jī)勻漿，3 000 r/min離心15 min，離心后取上清即為10%的組織勻漿，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。按照ROS、CAT、SOD、GPX試劑盒操作說明檢測各樣品中抗氧化指標(biāo)的活性。

1.4.5 蛋白免疫印跡分析(Western blot)

按照胸腺重量(g)和RIPA細(xì)胞裂解液體積(mL)比例為1∶9提取胸腺組織總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。樣品在95 ℃變性后，用10% SDS-PAGE分離等量蛋白，恒流200 mA轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，然后在4 ℃下分別用β-actin、Bax、Bcl-2、Caspase-8一抗(1∶1 000)孵育過夜。膜在磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)中清洗0.5 h后與二抗(1∶10 000)在室溫下孵育1 h，清洗0.5 h后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5200，上海天能科技有限公司)檢測蛋白表達(dá)。使用Image J軟件分析蛋白質(zhì)條帶灰度值，使用β-actin為內(nèi)參對照，蛋白相對表達(dá)量用目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析單因素方差分析，采用Turkey法進(jìn)行組間多重比較檢驗(yàn)。用Graph Prim 7.0軟件進(jìn)行作圖。所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺組織病理損傷的影響

為了評估PAMK對LPS引起的胸腺組織病理損傷的潛在保護(hù)作用，進(jìn)行了胸腺組織的石蠟包埋及HE染色，并進(jìn)行了胸腺組織病理學(xué)觀察。結(jié)果如圖1所示，LPS組與CON組和PAMK組相比，紅髓中出現(xiàn)較多的空泡和細(xì)胞碎片；但LPS+PAMK組紅髓中空泡和細(xì)胞碎片較少，細(xì)胞排列較緊密。這些結(jié)果表明，PAMK可以緩解LPS引起的雛鵝胸腺組織病理損傷。

A：CON組 CON group；B：PAMK組 PAMK group；C：LPS組 LPS group；D：LPS+PAMK組 LPS+PAMK group。圖片白色箭頭指示為組織空泡化且有碎片。The white arrow represents for vacuoles and debris tissue.

2.2 PAMK對LPS處理雛鵝胸腺組織超顯微結(jié)構(gòu)的影響

雛鵝胸腺組織的透射電鏡結(jié)果如圖2所示，CON組胸腺細(xì)胞維持圓形或微橢圓形的細(xì)胞形態(tài)(圖2-a、圖2-e，白色箭頭)，胞質(zhì)均勻，核較大，線粒體呈棒狀或者球狀(圖2-e，藍(lán)色箭頭)，并無發(fā)生染色質(zhì)聚集現(xiàn)象；PAMK組細(xì)胞未觀察到異常(圖2-b、圖2-f)；LPS組的雛鵝胸腺組織發(fā)生明顯的病理變化(圖2-c、圖2-g)，可見大部分細(xì)胞體積變小，形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)濃縮，出現(xiàn)邊緣化(圖2-c，黑色箭頭)，部分細(xì)胞的線粒體發(fā)生腫脹、嵴斷裂、空泡化等現(xiàn)象(圖2-g，綠色箭頭)，可見典型的凋亡小體(圖2-g，紅色箭頭)。LPS+PAMK組的大部分的細(xì)胞形態(tài)接近正常(圖2-d、圖2-h)，胞質(zhì)均勻，核呈現(xiàn)圓形，出現(xiàn)少量的凋亡小體，具有比LPS組更緊密的排列。這些結(jié)果表明，PAMK可以減輕LPS誘導(dǎo)的雛鵝胸腺細(xì)胞凋亡。

圖2 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺組織超顯微結(jié)構(gòu)的影響

2.3 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺中炎性細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)水平的影響

IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α作為關(guān)鍵的促炎因子，與氧化應(yīng)激、凋亡等細(xì)胞活動有著密切的相關(guān)性[21]。為了闡明PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺中炎性細(xì)胞因子的影響，采用熒光定量PCR方法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10的mRNA相對表達(dá)水平。結(jié)果如圖3所示，與CON組相比，PAMK組的IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相對表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)，IL-10的mRNA相對表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；而LPS組的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10的mRNA相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比，LPS+PAMK組的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10的mRNA相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。這些結(jié)果表明，PAMK可緩解LPS引起的雛鵝胸腺中炎性細(xì)胞因子水平升高。

2.4 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺中ROS含量及CAT、GPX、SOD的mRNA相對表達(dá)水平和活性的影響

為研究PAMK對氧化應(yīng)激的影響，在本研究首先檢測了胸腺組織中ROS含量。結(jié)果如圖4所示，與CON組相比，LPS組ROS含量增加了1.11倍(P>0.05)；與LPS組相比，LPS+PAMK組ROS含量減少了0.73倍(P>0.05)。此外，PAMK組的ROS含量與CON組相比顯著下降(P<0.05)，說明PAMK具有下調(diào)ROS含量的作用。

此外，檢測了胸腺組織中CAT、GPX、SOD的mRNA相對表達(dá)水平和活性，結(jié)果如圖5所示，與CON組相比，LPS組CAT的mRNA相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，GPX的mRNA相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，SOD的mRNA相對表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。與LPS組相比，PAMK+LPS組CAT、SOD的mRNA相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，GPX的mRNA相對表達(dá)水平顯著降低(P>0.05)。酶活性結(jié)果顯示，LPS組的CAT(P>0.05)、GPX(P>0.05)和SOD(P<0.05)活性不同程度低于CON組和LPS+PAMK組。這些結(jié)果表明，PAMK能緩解LPS引起的雛鵝胸腺組織的氧化應(yīng)激。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

圖4 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺中

2.5 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺中凋亡相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)水平的影響

使用熒光定量PCR技術(shù)檢測Bax、Caspase-3、Bcl-2、腫瘤蛋白63(TP63)、Caspase-8等凋亡相關(guān)基因的mRNA相對表達(dá)水平來闡明PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺組織細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果如圖4所示，與CON組相比，PAMK組Bax、TP63的mRNA相對表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)，Caspase-3的mRNA相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2、Caspase-8的mRNA相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；LPS組Bax、Caspase-3的mRNA相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，TP63、Bcl-2的mRNA相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Caspase-8的mRNA相對表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。與LPS組相比，LPS+PAMK組Bax、Caspase-3的mRNA相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2、Caspase-8、TP63的mRNA相對表達(dá)水平表達(dá)顯著升高(P<0.05)。這些結(jié)果表明，PAMK可以緩解LPS處理的雛鵝胸腺細(xì)胞凋亡。

2.6 PAMK對LPS處理的鵝胸腺中凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平的影響

采用了Western blot方法檢測蛋白相對表達(dá)水平進(jìn)一步證實(shí)PAMK對LPS引起的胸腺細(xì)胞凋亡的緩解作用。由圖7可知，與CON組相比，PAMK組Bax、Caspase-8的蛋白相對表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)，Bcl-2的蛋白相對表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；LPS組Bax、Caspase-8的蛋白相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2的蛋白相對表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。與LPS組相比，LPS+PAMK組Bax、Caspase-8的蛋白相對表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，Bcl-2的蛋白相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。這些結(jié)果表明，PAMK對健康雛鵝的中的凋亡相關(guān)蛋白無顯著影響，但可以緩解LPS刺激下胸腺組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的上升。

圖5 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺中CAT、GPX、SOD的mRNA相對表達(dá)水平和活性的影響

圖6 PAMK對LPS處理雛鵝胸腺中凋亡相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)水平的影響

圖7 PAMK對LPS處理的雛鵝胸腺細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平的影響

3 討 論

胸腺是雛鵝的中樞免疫器官，也是T淋巴細(xì)胞發(fā)育和分化的地方，其中胸腺組織中的胸腺細(xì)胞也對T淋巴細(xì)胞孵育具有重要作用，因此胸腺的生長發(fā)育水平及組織形態(tài)的情況，均對雛鵝的免疫功能有著重要作用[1]。細(xì)胞凋亡本質(zhì)上是一種程序性細(xì)胞死亡，能有效地清除機(jī)體內(nèi)衰老、畸變、損傷等細(xì)胞，在一定程度上對機(jī)體具有自我保護(hù)的作用。然而，在某些不良刺激或病理?xiàng)l件下，細(xì)胞凋亡的水平會增加，從而引起組織損傷。已有研究表明，細(xì)胞凋亡對不同刺激有不同的形態(tài)學(xué)特征，如細(xì)胞收縮、質(zhì)膜起泡、染色質(zhì)凝聚，最終細(xì)胞都碎裂成凋亡小體，這些小體被吞噬后引發(fā)炎癥反應(yīng)[22-23]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS組的胸腺組織結(jié)構(gòu)完整性被破壞，凋亡小體增多，可見細(xì)胞凋亡的典型特征，與之前的研究相似，這些結(jié)果為LPS誘導(dǎo)雛鵝胸腺細(xì)胞凋亡模型制備成功提供了證據(jù)。有研究表明，PAMK對熱應(yīng)激、環(huán)磷酰胺等不同刺激導(dǎo)致的凋亡有明顯的緩解作用[24]。本試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加400 mg/kg PAMK能減少LPS引起的凋亡小體、線粒體損傷等凋亡現(xiàn)象，這些結(jié)果表明PAMK可以緩解由LPS引起的凋亡，然而PAMK的抗凋亡機(jī)制尚不清楚。

氧化應(yīng)激和炎癥因子水平的增加是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，因此PAMK緩解LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用可能與二者的水平相關(guān)。細(xì)胞凋亡是通過促炎介質(zhì)誘導(dǎo)的，如發(fā)揮多功能作用的TNF-α，可以與死亡受體(TNF receptor，TNFR)結(jié)合，并可能通過激活Caspase-3和Caspase-8直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25-26]。研究表明，LPS可通過增加TNF-α、IL-6和IL-10等細(xì)胞因子水平從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27-29]。因此，具有抗炎作用的植物提取物也可通過下調(diào)炎性因子的水平參與緩解細(xì)胞凋亡水平，如原花青素、黃芩苷[30-31]。研究表明，PAMK可降低LPS誘導(dǎo)的小腸等器官中的炎性細(xì)胞因子水平。本試驗(yàn)結(jié)果也在前人的研究基礎(chǔ)上得到進(jìn)一步的驗(yàn)證，PAMK顯著降低LPS處理下胸腺組織中細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10)的表達(dá)，這可能是其緩解細(xì)胞凋亡的作用方式之一。

在氧化應(yīng)激水平增加且不能及時(shí)緩解的情況下，也可引發(fā)細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)檢測了ROS含量及CAT、GPX、SOD等基因表達(dá)和酶活性，結(jié)果表明LPS有提高胸腺組織中ROS含量和抑制CAT、GPX和SOD活性的趨勢，提示LPS誘導(dǎo)雛鵝胸腺發(fā)生氧化應(yīng)激。透射電鏡結(jié)果顯示LPS組線粒體嵴斷裂、染色質(zhì)凝集等特征，這有理由認(rèn)為是線粒體發(fā)生氧化損傷并導(dǎo)致促凋亡蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本結(jié)果也表明，PAMK可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)和提高機(jī)體內(nèi)酶活性而提高抗氧化功能。我們試圖證明PAMK通過氧化應(yīng)激和細(xì)胞因子緩解免疫器官中凋亡，然而其中的串?dāng)_關(guān)系極其復(fù)雜，需要更多的研究來闡明PAMK與LPS處理的雛鵝胸腺中的細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的機(jī)制。因此，需進(jìn)一步試驗(yàn)分析PAMK是否通過線粒體或死亡受體凋亡途徑參與緩解胸腺細(xì)胞凋亡的過程。

已知LPS可通過激活死亡受體途徑與線粒體凋亡途徑引起凋亡[30]。Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡調(diào)控中最重要的基因，Bcl-2/Bax信號通路在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本研究中，LPS處理顯著上調(diào)了Bax、Caspase-3的表達(dá)和下調(diào)了Bcl-2的表達(dá)，與之前的研究一致。有趣的是，PAMK顯著調(diào)節(jié)了LPS誘導(dǎo)組織中這些基因和蛋白表達(dá)水平。這表明PAMK對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用可能與胸腺組織中Bax/Bcl-2信號通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。死亡受體途徑可以通過激活死亡受體來誘導(dǎo)，如Fas，這需要與Fas配體(FasL)結(jié)合，然后通過Fas相關(guān)死亡域(FADD)激活Caspase-8[32]。在本研究中檢測了死亡受體關(guān)鍵蛋白Caspase-8的表達(dá)，結(jié)果顯示LPS處理顯著上調(diào)了其mRNA表達(dá)，而PAMK顯著下調(diào)了其蛋白表達(dá)，PAMK對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用可能與胸腺組織中死亡受體途徑信號通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。此外，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS處理顯著下調(diào)了TP63的mRNA表達(dá)，有研究表明TP63的同型異構(gòu)體TAP63α既可以激活死亡受體途徑又可以激活線粒體途徑[33]，目前較少有研究證明TP63是否是LPS激活死亡受體途徑與線粒體凋亡途徑發(fā)生串?dāng)_的關(guān)鍵，有趣的是PAMK顯著上調(diào)了TP63的mRNA表達(dá)。

本研究還發(fā)現(xiàn)單獨(dú)加PAMK對凋亡信號通路的表達(dá)不會有明顯變化，能夠維持信號通路的穩(wěn)定性，因此可以認(rèn)為PAMK作用與雛鵝胸腺組織不會引起凋亡，本試驗(yàn)的組織結(jié)構(gòu)觀察也證實(shí)了這點(diǎn)。本研究在分子層面初步解釋了PAMK可能通過線粒體及死亡受體途徑關(guān)鍵基因的抑制，緩解LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

4 結(jié) 論

PAMK可抑制LPS引起的氧化應(yīng)激、炎性細(xì)胞因子水平上升，通過線粒體及死亡受體途徑緩解雛鵝胸腺細(xì)胞凋亡，并維持胸腺組織的結(jié)構(gòu)完整性。