楊國(guó)峰 狄 斌 賀佳儀 王長(zhǎng)康 甘乾福 高玉云

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州350002)

幼兔斷奶應(yīng)激是目前養(yǎng)兔業(yè)面臨的嚴(yán)重問題，斷奶前幼兔所需的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和免疫蛋白來(lái)自于母乳，斷奶后幼兔失去母乳的被動(dòng)免疫且幼兔處于生長(zhǎng)階段，自身的消化機(jī)能和免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，體內(nèi)消化酶和胃酸分泌不足，極易引起斷奶幼兔腹瀉甚至死亡[1]。因此，改善幼兔斷奶應(yīng)激是當(dāng)前養(yǎng)兔生產(chǎn)中迫在眉睫的問題。酸化劑具有調(diào)節(jié)胃腸道菌群、提高消化道酶活、改善免疫功能、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和調(diào)節(jié)胃腸道pH等功能[2-6]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.1%復(fù)合酸化劑(二甲酸鉀和磷酸復(fù)合)可顯著增加商品肉兔平均日增重，降低料重比，并顯著提高養(yǎng)分表觀消化率，改善肉兔生長(zhǎng)性能[7]。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2%檸檬酸可顯著提高肉兔的末重和平均日采食量，降低料重比，提高飼料轉(zhuǎn)化率，增加體內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)肉兔免疫能力[8]。不過，復(fù)合酸化劑在兔生產(chǎn)中的應(yīng)用較少，且其對(duì)肝臟抗氧化能力及作用機(jī)制鮮有報(bào)道。同時(shí)，復(fù)合酸化劑的有效成分不同，其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響也有差異。因此，本試驗(yàn)使用小分子有機(jī)酸(甲酸和丙酸)組成的復(fù)合酸化劑來(lái)探究其對(duì)伊拉兔生長(zhǎng)性能、免疫和抗氧化功能以及空腸形態(tài)的影響，以篩選出較為合適的添加劑量，為酸化劑在伊拉兔中的生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取192只(35±2)日齡健康、體重接近的斷奶商品伊拉兔公兔，隨機(jī)分為4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，參照山東省地方標(biāo)準(zhǔn)《肉兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(DB 37/T 1835—2011)營(yíng)養(yǎng)需要配制，為顆粒料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1；抗生素組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加60 mg/kg鹽霉素的飼糧；試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.1%(試驗(yàn)Ⅰ組)和0.2%復(fù)合酸化劑(試驗(yàn)Ⅱ組)的飼糧。復(fù)合酸化劑由漳州某生物科技有限公司提供，其中含29%甲酸、6%丙酸、30%木質(zhì)磺酸鹽以及35%二氧化硅載體。試驗(yàn)期28 d，期間試驗(yàn)兔自由采食，充足飲水，按正常免疫程序進(jìn)行免疫接種。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content粗纖維 CF17.35中性洗滌纖維 NDF33.56酸性洗滌纖維 ADF20.51鈣 Ca0.90總磷 TP0.51賴氨酸 Lys0.74蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.54

1.2 樣品采集

試驗(yàn)第27天21：00禁食不禁水，試驗(yàn)第28天09：00開始對(duì)試驗(yàn)兔進(jìn)行空腹稱重，記錄宰前活重。從各組的每個(gè)重復(fù)中分別選擇1只接近平均體重的試驗(yàn)兔，耳緣靜脈采血，頸部放血處死，打開腹腔，將肝臟、空腸取出，取適當(dāng)大小肝臟組織，-80 ℃保存，取3 cm左右的空腸中段，用生理鹽水沖洗干凈，于4%多聚甲醛中固定。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)期間，每天17：00記錄各組試驗(yàn)兔采食量和余料量，計(jì)算平均日采食量、平均日增重和料重比；觀察每天每只試驗(yàn)兔的腹瀉情況，統(tǒng)計(jì)腹瀉率。計(jì)算公式如下：

平均日增重=(平均終末體重-平均
初始體重)/試驗(yàn)天數(shù)；平均日采食量=平均采食量/試驗(yàn)天數(shù)；料重比=平均日采食量/平均日增重；腹瀉率(%)=100×[試驗(yàn)期內(nèi)腹瀉兔只數(shù)/

(試驗(yàn)兔只數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))]。

1.3.2 免疫器官指數(shù)

試驗(yàn)兔屠宰后，切開頸部和腹腔，分離并摘取胸腺、脾臟、圓小囊和蚓突，剔除脂肪組織，用濾紙吸干血水后準(zhǔn)確稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。計(jì)算公式如下：

免疫器官指數(shù)(g/kg)=器官重量/宰前活重。

1.3.3 血清免疫指標(biāo)

試驗(yàn)兔耳緣靜脈采血約5 mL，注入不含抗凝劑的真空采血管中，室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min；將上清液收集于EP管中，-20 ℃保存。血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測(cè)定，嚴(yán)格按照試驗(yàn)盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 肝臟抗氧化指標(biāo)

試驗(yàn)兔屠宰后，取肝臟組織，于-80 ℃保存。肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-Px)活性、總抗氧能力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量和GSH/GSSG值，采用ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測(cè)定，嚴(yán)格按照試驗(yàn)盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.5 空腸形態(tài)

空腸組織經(jīng)過固定、脫水、包埋、切片、染色和封片等處理，在光學(xué)顯微鏡觀察并測(cè)量其絨毛高度、隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2021整理后，采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.05為差異顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組伊拉兔平均日采食量顯著提高(P<0.05)，平均日增重有提高趨勢(shì)(P=0.076)；抗生素組和試驗(yàn)Ⅰ組腹瀉率顯著降低(P<0.05)。各組料重比之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔生長(zhǎng)性能的影響

2.2 復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔免疫器官指數(shù)的影響

由表3可知，各組伊拉兔免疫器官指數(shù)之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3 復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔血清免疫指標(biāo)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，抗生素組和試驗(yàn)Ⅰ組伊拉兔血清IL-6含量顯著降低(P<0.05)，抗生素組、試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組血清TNF-α含量顯著降低(P<0.05)。各組血清IL-1β和IL-10含量之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.4 復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組伊拉兔肝臟MDA含量有降低趨勢(shì)(P=0.084)。各組其他肝臟抗氧化指標(biāo)之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.5 復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔空腸形態(tài)的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，抗生素組、試驗(yàn)組Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組伊拉兔空腸絨毛高度和V/C值顯著提高(P<0.05)。各組空腸隱窩深度之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。由圖1可以看出，如紅色箭頭所指，在100×放大下，對(duì)照組空腸腸絨毛頂端微絨毛較多出現(xiàn)脫落和斷裂，腸絨毛排列相對(duì)不整齊、疏松，腸絨毛相對(duì)較短；抗生素組和試驗(yàn)Ⅰ組空腸腸絨毛整體結(jié)構(gòu)完整，腸微絨毛未見明顯脫落，腸絨毛排列相對(duì)整齊、緊密，腸絨毛相對(duì)較長(zhǎng)；試驗(yàn)Ⅱ組空腸腸絨毛頂端也出現(xiàn)了部分脫落、斷裂，但明顯較對(duì)照組少，腸絨毛排列相對(duì)整齊、緊密，腸絨毛明顯比對(duì)照組長(zhǎng)。

表3 復(fù)合酸化對(duì)伊拉兔免疫器官指數(shù)的影響

表4 復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔血清免疫指標(biāo)的影響

表5 復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

表6 復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔空腸形態(tài)的影響

圖1 伊拉兔空腸組織切片

3 討 論

3.1 復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔生長(zhǎng)性能的影響

斷奶幼兔易發(fā)生腹瀉，從而影響其生長(zhǎng)發(fā)育。酸化劑可以調(diào)節(jié)腸道菌群，增強(qiáng)消化酶活性，提高機(jī)體免疫力，并促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而改善斷奶幼兔的生長(zhǎng)性能[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼糧添加0.1%復(fù)合酸化劑可以顯著提高伊拉兔平均日采食量，且有提高平均日增重的趨勢(shì)。Luise等[10]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加甲酸可顯著提高斷奶仔豬平均日增重，有降低平均日采食量和料重比的趨勢(shì)。費(fèi)洪標(biāo)等[11]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加0.1%復(fù)合酸化劑可顯著提高斷奶獺兔平均日增重。這些研究與本試驗(yàn)研究結(jié)果基本一致。其主要原因可能是：1)甲酸具有良好的酸化作用，能夠調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，促進(jìn)動(dòng)物腸道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[12]；2)丙酸經(jīng)畜禽吸收后，可通過糖異生途徑轉(zhuǎn)化為葡萄糖，從而促進(jìn)機(jī)體發(fā)育[13]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，飼糧添加復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔料重比無(wú)顯著影響，這與Debi等[8]的研究結(jié)果基本一致；但Long等[14]和Bosi等[15]研究表明，飼糧添加酸化劑可以顯著降低料重比，改善飼料報(bào)酬。造成這種差異的原因可能與復(fù)合酸化劑的組成成分、添加劑量、飼養(yǎng)動(dòng)物以及飼養(yǎng)環(huán)境等不同有關(guān)。吳秋玉等[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加1%有機(jī)酸可顯著降低斷奶仔豬腹瀉率，有效預(yù)防仔豬腹瀉。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧添加復(fù)合酸化劑可顯著降低幼兔腹瀉率，其原理可能是酸化劑通過降低腸道pH，改變菌群最適pH，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，從而降低腹瀉率。

3.2 復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔免疫功能的影響

免疫器官是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分，其生長(zhǎng)發(fā)育狀況會(huì)影響機(jī)體的免疫能力。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧添加復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔免疫器官指數(shù)無(wú)不良影響，這與馮國(guó)亮等[17]的研究結(jié)果基本一致；但李萬(wàn)軍[18]研究顯示，飼糧添加復(fù)合酸化劑可顯著提高肉雞免疫器官指數(shù)。結(jié)果的差異性可能是不同畜禽對(duì)酸化劑的利用能力不同，以及復(fù)合酸化劑的組成成分對(duì)畜禽的影響也不同。

免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)是機(jī)體的保護(hù)性防御反應(yīng)，正常情況下機(jī)體免疫系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)免疫失衡時(shí)，免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生大量炎癥反應(yīng)，并可能誘導(dǎo)疾病產(chǎn)生[19]。炎癥因子含量的變化可以間接說明機(jī)體炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱，并反映機(jī)體的健康狀態(tài)。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加復(fù)合酸化劑可以顯著降低斷奶仔豬血清TNF-α含量，顯著提高血清免疫球蛋白G(IgG)含量，增強(qiáng)斷奶仔豬免疫能力。程遠(yuǎn)之等[21]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加0.2%乳酸型酸化劑可顯著提高斷奶仔豬血清IgG和免疫球蛋白M(IgM)含量，并顯著提高十二指腸和空腸免疫因子的表達(dá)，增強(qiáng)斷奶仔豬免疫能力。Kuang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加復(fù)合有機(jī)酸可抑制斷奶仔豬空腸促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼糧添加復(fù)合酸化劑可以顯著降低伊拉兔血清促炎因子IL-6和TNF-α含量，增強(qiáng)斷奶幼兔免疫能力。這與Han等[23]和汪晶晶[24]的研究結(jié)果基本一致。酸化劑增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的原因可能是：1)部分酸化劑如延胡索酸等參與了機(jī)體三羧酸循環(huán)，能夠產(chǎn)生ATP維持機(jī)體供能，從而提高免疫力[25]；2)部分酸化劑如丙酸等可以通過糖異生等途徑合成葡萄糖，保證機(jī)體正常營(yíng)養(yǎng)需求和物質(zhì)代謝[13]；3)有機(jī)酸具有殺菌和調(diào)節(jié)pH的功能，能夠促進(jìn)機(jī)體消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，提高抗病力[26]。

3.3 復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔肝臟抗氧化功能的影響

抗氧化是機(jī)體健康狀況的重要指標(biāo)之一。機(jī)體產(chǎn)生過多氧自由基會(huì)引起氧化損傷，正常情況下，機(jī)體通過維持抗氧化系統(tǒng)的平衡狀態(tài)來(lái)保持氧自由基的平衡。劉新澤等[27]研究表明，飼糧添加0.1%復(fù)合酸化劑可以顯著提高肉雞血清T-AOC，顯著降低血清MDA含量，增強(qiáng)肉雞抗氧化能力，改善肉雞健康狀況。秦楓等[28]研究表明，飼糧添加延胡索酸能夠提高幼兔血清T-AOC和SOD活性，降低血清MDA含量，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，維持機(jī)體健康。王銘洋等[29]研究表明，飲水型酸化劑可顯著降低蛋雞肝臟MDA含量，顯著提高肝臟T-AOC。酸化劑增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力的原因可能是：1)部分有機(jī)酸參與機(jī)體三羧酸循環(huán)，為機(jī)體供能，從而提高機(jī)體清除自由基的能力[25]；2)部分有機(jī)酸可作為GSH-Px合成的原料，提高機(jī)體抗氧化能力[30]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧添加復(fù)合酸化劑有降低伊拉兔肝臟MDA含量的趨勢(shì)，這與前人結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)中，各組其他抗氧化指標(biāo)之間均無(wú)顯著差異，其原因可能是復(fù)合酸化劑的組成成分不同、飼養(yǎng)動(dòng)物不同以及飼養(yǎng)環(huán)境差異等因素導(dǎo)致。

3.4 復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔空腸形態(tài)的影響

腸道是機(jī)體最大的免疫器官，腸道形態(tài)尤其是絨毛高度和隱窩深度是機(jī)體腸道健康的重要指標(biāo)。腸道絨毛邊緣可分泌多種消化酶，所以絨毛高度越高，機(jī)體消化吸收能力越強(qiáng)；隱窩深度代表腸細(xì)胞生產(chǎn)率，隱窩越淺，細(xì)胞成熟度越高，分泌功能越強(qiáng)[31]。周嘉鑫等[32]研究表明，飼糧中添加0.09%甲酸+0.06%木質(zhì)磺酸混合制品可顯著提高黃羽肉雞空腸絨毛高度和V/C值，改善肉雞腸道形態(tài)。Chen等[33]研究表明，飼糧添加苯甲酸可顯著降低斷奶仔豬空腸隱窩深度，提高空腸V/C值，促進(jìn)腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收。何博等[34]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加甲酸和二甲酸鉀可顯著提高肉雞回腸絨毛高度和V/C值，促進(jìn)腸細(xì)胞增殖，改善腸道形態(tài)。以上研究表明，飼糧添加酸化劑可以改善腸道形態(tài)，促進(jìn)腸道發(fā)育。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，飼糧添加復(fù)合酸化劑可以顯著提高伊拉兔空腸絨毛高度和V/C值，這與前人研究結(jié)果基本一致。其原因可能是：1)酸化劑可以降低腸道pH，調(diào)節(jié)腸道微生物平衡，促進(jìn)腸道發(fā)育[35]；2)甲酸對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌具有很強(qiáng)的抑制作用，能降低病原菌的生長(zhǎng)與增殖，緩解腸道黏膜炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)絨毛高度和分泌功能[34]。

4 結(jié) 論

① 在本試驗(yàn)條件下，飼糧添加復(fù)合酸化劑可以增強(qiáng)伊拉兔免疫功能，改善空腸形態(tài)，提高平均日采食量，降低腹瀉率。

② 綜合本試驗(yàn)結(jié)果，以添加0.1%復(fù)合酸化劑效果較好。