李玉娟 張原銘 張北育 王 斌 劉傳華 李福昌 劉 磊*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安271018；2.蒙陰縣畜牧發(fā)展促進中心，蒙陰276200)

安哥拉兔是一種毛用經(jīng)濟動物，其產(chǎn)毛量的高低決定其經(jīng)濟價值。兔毛的主要成分是氨基酸，飼糧中各類氨基酸含量對毛囊的發(fā)育至關(guān)重要。通過調(diào)節(jié)飼糧中關(guān)鍵氨基酸含量來促進家兔毛囊發(fā)育，對提高產(chǎn)毛量具有重要意義。毛囊的發(fā)育經(jīng)歷生長期、退行期和靜止期3個階段，是一個復雜又精密的過程，受到多種因素的制約。遺傳因素、營養(yǎng)因素、年齡因素和季節(jié)因素等都會影響到毛囊的發(fā)育[1]。而毛囊生長發(fā)育過程中，會受到眾多信號因子的調(diào)控，如Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、成纖維生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、角蛋白相關(guān)蛋白(Kap)等。Wnt/β-catenin和IGF-Ⅰ信號通路正調(diào)節(jié)毛囊細胞的增殖分化，而BMP信號通路和FGF5信號通路是控制毛囊從生長期向休止期轉(zhuǎn)化的因子[2-3]。Kap作為兔毛的基本組成成分，已被證實與羊毛的直徑有關(guān)[4]。谷氨酰胺作為一種條件性必需氨基酸，具有促進機體生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進免疫系統(tǒng)提高等作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，在谷氨酰胺代謝轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒膺^程中，增加了外根鞘祖細胞向毛囊干細胞轉(zhuǎn)化[6]。谷氨酰胺可直接給毛囊細胞供給能量[7]，這為通過調(diào)節(jié)飼糧中谷氨酰胺水平來促進毛囊發(fā)育提供了方向。因此，本試驗擬通過在飼糧中添加不同水平谷氨酰胺，研究其對安哥拉兔毛囊發(fā)育、生產(chǎn)性能和毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達的影響，探究谷氨酰胺調(diào)節(jié)毛囊發(fā)育有關(guān)的信號通路。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼養(yǎng)管理

選取初始體重、初始產(chǎn)毛量差異不顯著(P>0.05)的安哥拉兔200只，隨機分為5組，每組40個重復，每個重復1只。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組在基礎飼糧中分別添加0.3%、0.6%、0.9%、1.2%的谷氨酰胺?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

試驗自2021年4月開始至2021年7月結(jié)束，預試期3 d，正試期65 d。飼養(yǎng)期間，所有兔單籠飼養(yǎng)，自由飲水，常規(guī)免疫程序免疫接種，兔舍自然采光和通風，定期對兔舍進行消毒。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.2 樣品采集與制備

飼養(yǎng)試驗開始前對所有試驗兔剪毛處理，試驗結(jié)束后，再次將所有試驗兔剪毛，用于統(tǒng)計產(chǎn)毛量。每組隨機選取8只試驗兔，采集肩部、背部、臀部兔毛樣品，置于密封袋中常溫密封保存，用于兔毛品質(zhì)的檢測；然后再采集2 cm×2 cm皮膚樣品2份，1份保存于多聚甲醛中用于皮膚毛囊切片的制作，1份保存于凍存管中-80 ℃保存，用于毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達的檢測。

1.3 生產(chǎn)性能的測定

飼養(yǎng)試驗開始前對所有試驗兔剪毛，飼養(yǎng)試驗結(jié)束后再次對所有試驗兔剪毛，測定剪毛前后體重，根據(jù)差值計算產(chǎn)毛量(結(jié)合生產(chǎn)實踐，本試驗中產(chǎn)毛量測定選取的兔毛為污毛)。根據(jù)整個試驗期間的采食量計算平均日采食(ADFI)和料毛比，計算公式如下：

ADFI(g/d)=飼養(yǎng)試驗期間每只
試驗兔的總采食量/試驗天數(shù)；料毛比=飼養(yǎng)試驗期間每只試驗兔的總采食量/
飼養(yǎng)試驗期間每只試驗兔的產(chǎn)毛量。

1.4 毛品質(zhì)的測定

將采集到的被毛樣品進行兔毛品質(zhì)的測定，每個樣品隨機選取300根兔毛進行測定。斷裂強力、伸長、斷裂強度、伸長率和斷裂功使用南通宏大YG005N+型電子單纖維強力儀測定。設置隔距10 mm，拉伸速度20 mm/min，每個樣品隨機測定20次。纖維細度和粗毛率(根數(shù)比)使用BEIONF6纖維細度儀測定，每個兔毛樣品隨機測定300根。毛叢長度使用軟尺測量(精確到0.1 cm)測定，結(jié)束后打印結(jié)果。

1.5 毛囊密度的測定

試驗兔皮膚樣品在多聚甲醛中固定24 h后，經(jīng)過沖水、梯度酒精脫水、二甲苯透明和石蠟包埋處理后，以5 μm的厚度切片，使用常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，具體方法參照王童童[8]。使用顯微鏡觀察，每張切片隨機選取3個視野，統(tǒng)計面積和初級毛囊個數(shù)及次級毛囊個數(shù)，并拍照記錄。

1.6 基因表達的測定

使用Trizol法提取皮膚組織樣品中的總RNA，然后在紫外分光光度計下測定其濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進行實時熒光定量PCR的測定，具體方法參照Roche反轉(zhuǎn)錄和諾唯贊熒光定量試劑盒說明書進行，相關(guān)的引物序列參照Liu等[9]。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法進行計算，得出目的基因相對表達量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗數(shù)據(jù)使用SAS 9.4統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，以Duncan氏法進行多重比較，P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為有變化趨勢，P>0.05為無顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加谷氨酰胺對安哥拉兔生產(chǎn)性能的影響

由表2可以看出，在初始體重及產(chǎn)毛量無顯著差異(P>0.05)的情況下，與對照組相比，飼糧中添加0.9%的谷氨酰胺能顯著提高產(chǎn)毛量和產(chǎn)毛率(P<0.05)，顯著降低料毛比(P<0.05)；飼糧中添加不同水平谷氨酰胺對ADFI無顯著影響(P>0.05)。

表2 飼糧中添加谷氨酰胺對安哥拉兔生產(chǎn)性能的影響

2.2 飼糧中添加谷氨酰胺對安哥拉兔毛品質(zhì)的影響

由表3可以看出，飼糧中添加谷氨酰胺對兔毛的伸長長度、伸長率、纖維細度和粗毛率都有顯著影響(P<0.05)，與對照組相比，其中飼糧中添加0.6%和1.2%谷氨酰胺可顯著降低兔毛伸長長度(P<0.05)；飼糧中添加0.6%和1.2%谷氨酰胺可顯著降低兔毛伸長率(P<0.05)；與對照組相比，飼糧中添加谷氨酰胺對兔毛纖維細度無顯著影響(P>0.05)；飼糧中添加0.6%和0.9%谷氨酰胺可顯著提高粗毛率(P<0.05)。與對照組相比，飼糧中添加谷氨酰胺可顯著降低兔毛叢長度(P<0.05)；但飼糧中添加谷氨酰胺對兔毛斷裂強力、斷裂強度以及斷裂功均無顯著影響(P>0.05)。

2.3 飼糧中添加谷氨酰胺對安哥拉兔毛囊密度的影響

由表4可以看出，與對照組相比，飼糧中添加谷氨酰胺具有提高初級毛囊密度的趨勢(0.05≤P<0.10)；飼糧中添加谷氨酰胺對次級毛囊密度和總毛囊密度沒有顯著影響(P>0.05)。

表3 飼糧中添加谷氨酰胺對安哥拉兔毛品質(zhì)的影響

表4 飼糧中添加谷氨酰胺對安哥拉兔毛囊密度的影響

2.4 飼糧中添加谷氨酰胺對安哥拉兔毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達的影響

由表5可以看出，與對照組相比，飼糧中添加谷氨酰胺能夠顯著提高皮膚IGF-ⅠR基因相對表達量(P<0.05)，而對皮膚IGF-Ⅰ基因相對表達量具有降低的趨勢(0.05≤P<0.10)；飼糧中添加谷氨酰胺可顯著降低皮膚BMP2和BMP4基因相對表達量(P<0.05)。

表5 飼糧中添加谷氨酰胺對安哥拉兔毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達的影響

續(xù)表5項目Items谷氨酰胺添加水平 Gln supplemental levels/%0(對照 Control)0.30.60.91.2P值P-value轉(zhuǎn)化生長因子-β2 TGF-β21.00±0.260.86±0.191.56±1.080.33±0.061.73±0.910.592 5表皮生長因子 EGF1.00±0.210.71±0.181.55±1.350.46±0.200.27±0.110.577 9角蛋白相關(guān)蛋白3.1 Kap 3.11.00±0.300.29±0.110.50±0.330.34±0.170.54±0.380.409 0角蛋白相關(guān)蛋白6.1 Kap 6.11.00±0.220.11±0.032.35±1.201.16±0.410.83±0.540.141 6哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 mTOR1.00±0.271.65±0.861.25±0.850.30±0.081.22±0.450.604 8p70核糖體蛋白S6激酶 p70s6k1.00±0.440.48±0.290.29±0.200.44±0.190.40±0.220.466 2Noggin1.00±0.201.40±0.500.90±0.720.33±0.152.15±0.780.201 2

3 討 論

3.1 飼糧添加谷氨酰胺對安哥拉兔生產(chǎn)性能的影響

研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加谷氨酰胺可顯著提高仔豬和肉仔雞的平均日增重，降低其料重比[10]。0.4%～2.0%谷氨酰胺可顯著提高斷奶獺兔的平均日增重，顯著降低料重比，0.9%時達到效果最佳[11]。本試驗中，飼糧中添加0.9%的谷氨酰胺能顯著提高安哥拉兔的產(chǎn)毛量、產(chǎn)毛率，并降低料毛比，提示谷氨酰胺能調(diào)節(jié)腸道功能，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收效率。谷氨酰胺作為一種條件性必需氨基酸，在斷奶、免疫等應激條件下機體需要量增加，需從外界攝取。谷氨酰胺不僅能為免疫細胞提供能量，還在機體抗氧化方面發(fā)揮重要作用。本試驗中發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.6%～0.9%谷氨酰胺提高安哥拉兔的成活率，表明谷氨酰胺在調(diào)節(jié)家兔機體健康上同樣發(fā)揮重要作用。

3.2 飼糧添加谷氨酰胺對安哥拉兔毛囊發(fā)育的影響

兔毛產(chǎn)量和兔毛品質(zhì)決定了安哥拉兔的經(jīng)濟效益。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1.2%谷氨酰胺可顯著降低安哥拉兔兔毛的伸長長度和伸長率，提示高劑量添加谷氨酰胺能抑制毛囊細胞的增殖和分化。此外，本試驗研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺有增加皮下毛囊細胞中初級毛囊密度的趨勢，這與飼糧中添加含硫氨基酸的效果一樣，飼糧中添加0.4%蛋氨酸和0.45%半胱氨酸均能提高家兔的被毛密度[12]。這表明谷氨酰胺對毛囊的影響與含硫氨基酸有相似之處，都能夠提高毛囊密度。初級毛囊主要發(fā)育成粗毛，谷氨酰胺添加誘導初級毛囊發(fā)育導致粗毛含量的增加，進而提高了兔毛產(chǎn)量。

在毛囊發(fā)育的生長期，IGF-Ⅰ可刺激毛基質(zhì)角化細胞的增殖分化，進一步加快毛囊的發(fā)育。IGF-Ⅰ與胰島素的作用具有同源性，能夠促進有絲分裂和蛋白質(zhì)的合成[13]。對上皮細胞和毛乳頭細胞的增殖分化同樣也具有促進作用。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加谷氨酰胺雖然對安哥拉兔皮膚中IGF-Ⅰ基因相對表達量無顯著影響，但卻顯著提高了皮膚中IGF-ⅠR的基因相對表達量，提示谷氨酰胺可通過調(diào)節(jié)IGF-ⅠR基因表達來激活IGF-Ⅰ信號通路，進而調(diào)節(jié)毛囊發(fā)育過程。

BMP信號通路能夠通過調(diào)控毛發(fā)基質(zhì)細胞角質(zhì)細胞中與細胞周期相關(guān)的基因表達來調(diào)控生長期毛囊毛乳頭的大小[2]，能抑制毛囊發(fā)育，是毛囊發(fā)育的抑制劑。有研究表明，BMP2在毛囊密度低的獺兔中的表達量顯著高于毛囊密度高的獺兔[14]。本試驗中，皮膚BMP2和BMP4基因相對表達量都有顯著降低，提示谷氨酰胺能通過抑制BMP2/4信號通路來促進毛囊的發(fā)育。

毛囊發(fā)育過程還受到其他信號通路的調(diào)節(jié)，如成纖維生長因子5(FGF5)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和表皮生長因子(EGF)等信號通路在調(diào)控毛囊細胞增殖和周期性循環(huán)中都發(fā)揮作用，這些信號通路都能促使毛囊細胞提前結(jié)束生長期，向其他時期進行[15-16]。mTOR信號通路可以整合各種營養(yǎng)和能量信號，從而促進毛發(fā)的生長[17]。在本試驗中，谷氨酰胺對安哥拉兔皮膚中FGF5、TGF、Kap和mTOR基因相對表達量都無顯著影響，提示這些基因可能在谷氨酰胺調(diào)節(jié)安哥拉兔毛囊發(fā)育過程中不是關(guān)鍵的靶基因。

4 結(jié) 論

飼糧中添加谷氨酰胺提高了安哥拉兔產(chǎn)毛量，IGF-Ⅰ和BMP信號通路參與谷氨酰胺調(diào)節(jié)毛囊發(fā)育過程；本試驗建議安哥拉兔飼糧中谷氨酰胺的適宜添加水平為0.9%。