張 雁，劉長(zhǎng)榮，梅 慧，鄧映明（通信作者）

（梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所化學(xué)室 廣東 梅州 514071）

合成魚(yú)腥草素是魚(yú)腥草素的亞硫酸氫鈉加成物，具有抗菌[1-3]、抗炎及免疫調(diào)節(jié)[4-9]等藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛，常與抗生素聯(lián)用治療上呼吸道感染，慢性支氣管炎，肺炎等。市場(chǎng)上存在魚(yú)腥草素鈉與合成魚(yú)腥草素兩種制劑，但兩者均為化學(xué)合成產(chǎn)物，合成工藝相同，李雪等[10]研究證實(shí)，合成魚(yú)腥草素與魚(yú)腥草素鈉實(shí)為同一物質(zhì)，應(yīng)統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)行的合成魚(yú)腥草素片的標(biāo)準(zhǔn)為部頒標(biāo)準(zhǔn)WS1-34（B）-89，多年來(lái)未進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)提高，較為滯后，其中含量測(cè)定采用碘量法進(jìn)行滴定，在實(shí)際操作過(guò)程中發(fā)現(xiàn)碘量法易受輔料和不同廠家來(lái)源淀粉指示劑等多種因素干擾[11-12]，滴定終點(diǎn)藍(lán)紫色的顏色判斷，不同操作人員存在較大差異，數(shù)值判定因人而異，方法專屬性較差；現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，合成魚(yú)腥草素含量測(cè)定方法除碘量法外還有電位滴定法、高效液相色譜法及毛細(xì)管帶電泳法等[13-15]。本文旨在比較高效液相色譜法、電位滴定法及碘量法在合成魚(yú)腥草素片含量測(cè)定上的差異，以期為建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1.儀器與試藥

高效液相色譜儀LC-20ADXR（日本島津公司），全自動(dòng)電位滴定儀梅特勒G20 s（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），梅特勒電子分析天平（XSR205DU/A，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。魚(yú)腥草素鈉對(duì)照品（批號(hào)：100247-202102，含量99.4%，中國(guó)食品藥品檢定研究院），合成魚(yú)腥草素片（廠家A：批號(hào)為202104501、202104502、202106501、202106502、202106503； 廠 家B： 批 號(hào) 為20210815、20211001、20211005）。碘滴定液（0.1 moL/L）（深圳市博林達(dá)科技有限公司，批號(hào)：20220701A1），甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2.方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜法

（1）溶液的制備。①對(duì)照品溶液：精密稱取魚(yú)腥草素鈉對(duì)照品25 mg，置50 mL 量瓶中，流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，取上述溶液依次稀釋成含合成魚(yú)腥草素約0.5、2.0、5.0、10.0、25、50 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。②供試品溶液：取合成魚(yú)腥草素片10 片，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于魚(yú)腥草素鈉25 mg），置50 mL 量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置50 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。（2）高效液相色譜法色譜條件。色譜柱：phenomenex Luna C8（150×4.60 mm 5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-10%四丁基氫氧化銨溶液（55 ∶45 ∶0.3）；流速：1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm；柱溫45 ℃；進(jìn)樣體積20 μL。

2.2 碘量法

取合成魚(yú)腥草素片10片，置碘瓶中，加氫氧化鈉液（0.2 moL/L）100 mL，振搖使合成魚(yú)腥草素溶解完全后，移入冰浴中冷卻，加4 ℃以下的硫酸液（0.5 moL/L）40 mL，與淀粉指示液2 mL，立即用碘液（0.1 moL/L）快速滴定至顯藍(lán)色，每1 mL 碘液（0.1 moL/L）相當(dāng)于15.12 m g的C12H23NaO5S。

2.3 電位滴定法

照“2.2”同法制備供試品溶液，浸入鉑-飽和甘汞電極，按電位滴定法，立即用碘滴定液（0.1 moL/L）迅速滴定。記錄消耗滴定液的體積與電位值，以電位e 為縱坐標(biāo)，以滴定液體積v 為橫坐標(biāo)，繪制e-v 曲線，曲線拐點(diǎn)處即為滴定終點(diǎn)。

2.4 方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，照“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。合成魚(yú)腥草素在其線性范圍（0.50 ～50 μg/mL）內(nèi)的回歸方程為y = 110.16x-6.6494（r= 1.000），表明其線性關(guān)系良好，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜法色譜圖

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次20 μL，記錄結(jié)果。測(cè)得魚(yú)腥草素鈉峰面積RSD 為0.37%，表明儀器精密度良好。

2 . 4 . 3穩(wěn)定性試驗(yàn)： 稱取樣品6 份（批號(hào)為202104501），室溫下分別于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得合成魚(yú)腥草素峰面積的RSD 為0.58%，表明該供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4回收率試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為202104502）適量（約相當(dāng)于合成魚(yú)腥草素0.15 g，相當(dāng)于5 片）加入原料藥0.12、0.15、0.18 g（相當(dāng)于80%、100%和120%，因用量較大，用已知含量原料藥代替對(duì)照品），加入輔料，置具塞錐形瓶中，照3 種測(cè)定項(xiàng)下方法制備回收率樣品，依法測(cè)定，高、中、低3 種質(zhì)量濃度的回收樣品（n= 3），求得加樣回收率，見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 3 種方法結(jié)果比較

分別采用高效液相色譜法、電位滴定法以及碘量法對(duì)合成魚(yú)腥草素片的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，對(duì)于同一批樣品，高效液相色譜法與電位滴定法相當(dāng)，而碘量法的測(cè)定結(jié)果較上述兩種方法測(cè)定結(jié)果高，見(jiàn)表2。

表2 3 種方法含量測(cè)定結(jié)果（%）

3.討論

原料藥測(cè)定結(jié)果。3 種方法測(cè)定原料藥結(jié)果一致，測(cè)定結(jié)果與廠家提供的原料藥含量一致。說(shuō)明3 種方法在沒(méi)有其他因素的干擾下均能對(duì)合成魚(yú)腥草素進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

輔料對(duì)結(jié)果的干擾。3 種方法測(cè)定結(jié)果表明，碘量法測(cè)定時(shí)含量最高，電位滴定法最低，高效液相色譜法的回收率較其他兩種方法高，更為準(zhǔn)確。碘量法與電位滴定法原理一樣，為碘分子與合成魚(yú)腥草素中的亞硫酸根進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，終點(diǎn)顏色由淺黃色至藍(lán)褐色的漸變過(guò)程；單獨(dú)對(duì)輔料進(jìn)行空白滴定，需消耗2 ～3 滴的碘滴定液，這可能是碘量法測(cè)定結(jié)果較高的原因之一，電位滴定法溶液的顏色為黃棕色時(shí)曲線出現(xiàn)拐點(diǎn)，并未到達(dá)藍(lán)褐色，是造成結(jié)果數(shù)值較低的主要因素。輔料中的糊精也是對(duì)結(jié)果的判定不一致的重要因素，原料藥溶液澄清，終點(diǎn)為明顯的藍(lán)色，容易判斷，而輔料的加入使得溶液顏色變渾濁，由原來(lái)的澄清變成乳白狀懸浮液，滴定至接近終點(diǎn)時(shí)溶液顏色從黃色變成紅棕色，難以觀察到藍(lán)色變化，很容易造成干擾，導(dǎo)致終點(diǎn)的誤判；高效液相色譜法經(jīng)過(guò)色譜柱的分離，可以很好地避免輔料的影響，測(cè)定結(jié)果可信度更高。

可溶性淀粉的選擇。淀粉可分為支鏈淀粉和直鏈淀粉，支鏈淀粉遇碘呈紅紫色，直鏈淀粉遇碘呈藍(lán)色，生成藍(lán)色配合物，此反應(yīng)是特征反應(yīng)，靈敏度高。故而不同廠家的可溶性淀粉他的指示效果各不相同，對(duì)終點(diǎn)顏色的判斷也不同，需要注意選擇。

綜上所述，通過(guò)高效液相色譜法、碘量法與電位滴定法三種測(cè)定方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明高效液相色譜法在有輔料干擾的情況下，更適合對(duì)合成魚(yú)腥素片含量進(jìn)行測(cè)定，但碘量法與電位滴定法無(wú)需對(duì)照品，其對(duì)樣品的處理操作也比較簡(jiǎn)單。現(xiàn)行的合成魚(yú)腥草素片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該進(jìn)一步完善。