丁大連，李鵬，亓衛(wèi)東，張建輝

(1.紐約州立大學布法羅大學，紐約 布法羅 14214； 2.中山大學附屬第三醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州 510230； 3.成都市第三人民醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，四川 成都 610014； 4.復旦大學附屬華山醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200040)

內(nèi)耳功能主要分為聽覺功能和平衡功能，其中耳蝸是內(nèi)耳的聽覺器官，而前庭則是內(nèi)耳的平衡器官。在每個內(nèi)耳中的前庭感覺區(qū)包含2個感知線性加速度改變的耳石器(球囊斑和橢圓囊斑)和3個感知角加速度改變的壺腹嵴[1-3]。位于這些前庭感覺區(qū)的毛細胞是前庭系統(tǒng)中感受自身運動狀態(tài)和頭位空間位置的平衡感受器，前庭毛細胞因運動或體位改變釋放出的神經(jīng)遞質(zhì)信號通過毛細胞底部的傳入神經(jīng)末梢經(jīng)前庭神經(jīng)節(jié)傳送到腦干中的前庭核，然后再與其他參與平衡感知和調(diào)控的中樞神經(jīng)核團建立間接的神經(jīng)聯(lián)系[4-5]。由此可見，前庭毛細胞是內(nèi)耳中接受平衡感覺刺激的唯一感受器，前庭毛細胞的破壞將直接造成內(nèi)耳的平衡功能障礙甚至導致內(nèi)耳的平衡功能喪失，這意味著前庭毛細胞的定量病理學評估對研究前庭性平衡障礙至關重要。

在內(nèi)耳前庭感覺毛細胞的定量組織病理學研究中，對前庭感覺區(qū)連續(xù)切片進行毛細胞計數(shù)的方法因工作量過大和準確性欠佳而早已不再被采用[6]。自前庭膜迷路鋪片技術問世以來，由于該技術為實現(xiàn)各個前庭感覺區(qū)的毛細胞定量分析提供了非常理想的觀察角度而日益得到更多的應用[7-16]。

了解受試動物前庭感覺區(qū)的測量參數(shù)和確定各個前庭感覺區(qū)的前庭毛細胞數(shù)量或毛細胞密度，是定量觀察前庭毛細胞病理學改變的基本要素。本實驗旨在通過測量多種常用實驗動物前庭各個感覺區(qū)及其毛細胞數(shù)量的重要數(shù)據(jù)，為進一步開展前庭組織病理學的定量觀察和分析提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試動物種類

本實驗測量了正常CBA/CaJ小鼠、裸鼠、SD大鼠、豚鼠、南美栗鼠、新西蘭白兔和非洲黑長尾猴等七種常用的成年實驗動物(每種動物6只)的前庭感覺區(qū)的面積和毛細胞的數(shù)據(jù)。受試動物的一側耳被用于本實驗的球囊斑和橢圓囊斑面積測量及前庭各個感覺區(qū)毛細胞的定量觀察，另一側耳被用于其他實驗。實驗動物中除南美栗鼠和新西蘭白兔的實驗程序得到復旦大學動物護理和使用委員會的批準之外，其余所有動物的樣本制備程序均根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)布指南并得到布法羅大學實驗動物管理委員會的批準。

1.2 各個前庭感覺區(qū)的取材鋪片技術

將取出的受試動物的顳骨浸入到10%福爾馬林固定液浸泡數(shù)小時，然后在解剖顯微鏡下摘除鐙骨并打開前庭池外側骨壁，充分暴露位于前庭池內(nèi)的每一個前庭感覺區(qū)(圖1)。用分離針緊貼前庭池內(nèi)側骨壁截斷球囊斑背側穿入到中篩斑的神經(jīng)纖維和血管，分離取下球囊斑，然后摘除覆蓋在球囊斑表面的耳石膜。用分離針在上篩斑緊貼骨壁截斷橢圓囊斑背側的神經(jīng)纖維和血管，分離取下橢圓囊斑，然后摘除覆蓋在橢圓囊斑表面的耳石膜。用分離針分別在上篩斑和下篩斑處的前庭池骨壁截斷外半規(guī)管壺腹嵴和上半規(guī)管壺腹嵴及后半規(guī)管壺腹嵴的神經(jīng)纖維和血管，再分別截斷3個膜半規(guī)管取下3個膜壺腹，最后打開膜壺腹暴露壺腹腔內(nèi)的壺腹嵴。將取下并完成暴露的各個前庭感覺區(qū)常規(guī)染色后鋪放在載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片[7,9,17-19]。

1.3 球囊斑和橢圓囊斑的面積測量

首先對每種受試動物的球囊斑鋪片和橢圓囊斑鋪片在放大100倍的光學顯微鏡下拍攝兩個囊斑鋪片的整體照片，應用Image J軟件的圖像測量程序，分別測量CBA/CaJ小鼠、裸鼠、SD大鼠、豚鼠、南美栗鼠、新西蘭白兔和非洲黑長尾猴的球囊斑和橢圓囊斑的實際面積。見圖2。

1.4 球囊斑和橢圓囊斑毛細胞總數(shù)的計數(shù)方法

在光學顯微鏡下，將平整鋪片的球囊斑和橢圓囊斑照片上的囊斑區(qū)域劃分為面積相同的若干網(wǎng)格區(qū)域(圖3)。 在放大圖像下準確計數(shù)每個方格中的毛細胞數(shù)量，然后將每個方格的毛細胞計數(shù)結果相加，從而獲得每種受試動物的球囊斑和橢圓囊斑上的毛細胞總數(shù)。

1.5 前庭各個感覺區(qū)局部毛細胞密度的測量

由于球囊斑和橢圓囊斑比較平整，因而容易制作成球囊斑鋪片和橢圓囊斑鋪片。從球囊斑和橢圓囊斑鋪片進行毛細胞全計數(shù)的方法雖然可行，但是耗時過長而且需要確保制作出完整無損的整個囊斑鋪片，加上文獻中報道的有關前庭各個感覺區(qū)毛細胞總數(shù)的參考數(shù)據(jù)由于各自存在的技術原因而具有相當大的差異，這些都給定量評估前庭兩個囊斑上的毛細胞總數(shù)帶來一定的困難。在光學顯微鏡高倍鏡的放大條件下，對前庭感覺區(qū)鋪片上的小視野范圍內(nèi)進行毛細胞計數(shù)，從而獲取局部的毛細胞密度，不失為一種簡便有效的前庭毛細胞定量觀察方法(圖4)。壺腹嵴具有一個立體的隆起的外形，在制作鋪片時很難鋪放平整而難免總有被遮擋的部位使之難以實現(xiàn)對整個壺腹嵴上所有毛細胞進行計數(shù)。但是，應用前庭小視野定量觀察技術計算出前庭各個感覺區(qū)小視野范圍內(nèi)毛細胞密度的方法卻既簡單又可靠，還可以在同一個樣品上對幾個不同的區(qū)域進行毛細胞計數(shù)，再以平均值來代表該前庭感覺區(qū)的毛細胞密度[8,20-21]。我們在預先設定的放大倍數(shù)下，首先拍攝取景框視野內(nèi)顯微測微尺的照片，從而計算出該放大倍數(shù)下攝影取景框的實際面積，然后對該放大倍數(shù)下攝影取景框內(nèi)的毛細胞進行計數(shù)，這樣就可獲得該受試動物前庭各個感覺區(qū)的毛細胞密度(圖4)。

1.6 前庭感覺區(qū)毛細胞損害模型的定量觀察

為了驗證上述前庭感覺區(qū)毛細胞定量觀察技術的實際應用價值，我們將測量前庭毛細胞密度的定量觀察方法應用于以下幾種前庭毛細胞損害的不同實驗模型。①從對準大鼠外耳道口的沖擊波發(fā)生器釋放出的加壓空氣沖擊波的峰值壓力達到20帕斯卡(Pascals)，爆震聲強達到196.8 dB SPL。受試大鼠在爆震暴露2周后終止實驗，常規(guī)制備前庭感覺區(qū)鋪片后用蘇木素染色并在光學顯微鏡下對毛細胞進行病理學觀察；②將裝載進微滲透泵(Osmotic pump)的每mL Hank’s溶液含有400 μL慶大霉素的溶液通過插入到南美栗鼠上半規(guī)管開出的小孔以每小時0.5 μL的速率向前庭池內(nèi)持續(xù)緩慢灌注7 d。在停止灌流后的第14天終止實驗，常規(guī)在光學顯微鏡下對琥珀酸脫氫酶染色后制備的前庭感覺區(qū)鋪片進行毛細胞的定量觀察;③按照每公斤體重100毫克的劑量向南美栗鼠腹腔內(nèi)一次性注射卡鉑，在注射卡鉑30 d后終止實驗，常規(guī)制備前庭感覺區(qū)鋪片后用蘇木素染色，然后在光學顯微鏡下對毛細胞進行定量觀察。

2 結果

2.1 實驗動物球囊斑和橢圓囊斑的實際面積和毛細胞總數(shù)

按照材料與方法中對“球囊斑和橢圓囊斑的面積測量”方法的描述和“球囊斑和橢圓囊斑毛細胞總數(shù)的計數(shù)方法”，我們對CBA/CaJ小鼠、裸鼠、SD大鼠、豚鼠、南美栗鼠、新西蘭白兔和非洲黑長尾猴的球囊斑鋪片和橢圓囊斑鋪片實施了面積測量。并獲得了每種受試動物球囊斑毛細胞的總數(shù)和橢圓囊斑毛細胞的總數(shù)。具體數(shù)據(jù)見表1、圖5。

表1 7種實驗動物球囊斑和橢圓囊斑的實際面積與球囊斑和橢圓囊斑上的毛細胞總數(shù)

2.2 實驗動物各個前庭感覺區(qū)局部的毛細胞密度

每個前庭感覺區(qū)上不同部位的毛細胞密度見表2。每個前庭感覺區(qū)的毛細胞都包含著兩種類型的毛細胞，它們分別是Ⅰ型毛細胞和Ⅱ型毛細胞。外形呈燒瓶狀的Ⅰ型毛細胞體型較胖，主要集中在球囊斑和橢圓囊斑的微紋區(qū)以及壺腹嵴的頂部；而外形呈柱狀的Ⅱ型毛細胞體型較瘦，主要分布在球囊斑和橢圓囊斑的周邊區(qū)和壺腹嵴的兩側。由于Ⅰ型毛細胞比Ⅱ毛細胞占據(jù)著更大的空間，因此，Ⅰ型毛細胞聚集的球囊斑微紋區(qū)和橢圓囊斑微紋區(qū)的毛細胞密度要顯著低于這兩個囊斑周邊區(qū)的毛細胞密度。人們早就發(fā)現(xiàn)松鼠猴囊斑周邊區(qū)的毛細胞密度平均要比微紋區(qū)的毛細胞密度高 1.62 倍[22]。有鑒于此，球囊斑微紋區(qū)和橢圓囊斑微紋區(qū)的毛細胞密度應該與這兩個囊斑周邊區(qū)的毛細胞密度區(qū)分開來分別進行統(tǒng)計學分析(圖4、6)[12,21,23]。

圖6 毛細胞觀察 6A：大鼠橢圓囊斑微紋區(qū)的正常毛細胞密度； 6B：沖擊波暴露造成了橢圓囊斑微紋區(qū)毛細胞的嚴重破壞，但并未破壞橢圓囊斑周邊區(qū)的毛細胞； 6C：南美栗鼠球囊斑微紋區(qū)和周邊區(qū)的正常毛細胞密度。紅色方框顯示球囊斑微紋區(qū)內(nèi)的小視野，黃色方框顯示球囊斑周邊區(qū)的小視野； 6D：慶大霉素造成南美栗鼠球囊斑微紋區(qū)毛細胞嚴重損害； 6E：毛細胞密度直方圖顯示慶大霉素造成的南美栗鼠球囊斑微紋區(qū)毛細胞的損壞程度顯著高于周邊區(qū) (6A、B：蘇木素 ×400； 6C、D：琥珀酸脫氫酶 ×200) 圖7 南美栗鼠橢圓囊斑鋪片對毛細胞定量觀察 7A：正常對照南美栗鼠的Ⅰ型毛細胞在細胞核平面的周圍就有一個圓環(huán)樣的Ⅰ型傳入神經(jīng)末梢，Ⅱ型毛細胞細胞核平面的周圍則不具備圓環(huán)狀的神經(jīng)末梢結構； 7B：一次性注射卡鉑(100 mg/kg體重)后30 d，橢圓囊斑鋪片上殘存的毛細胞只剩下不具備圓環(huán)狀神經(jīng)末梢的Ⅱ型毛細胞，說明卡鉑選擇性破壞南美栗鼠的Ⅰ型毛細胞，但是并不損害南美栗鼠的Ⅱ型毛細胞； 7C：毛細胞密度直方圖中的星號顯示南美栗鼠的前庭Ⅰ型毛細胞確可被卡鉑選擇性破壞 (7A、B：蘇木素 ×1 000) 圖8 大鼠橢圓囊斑鋪片相同視野下的毛細胞細胞核平面和支持細胞細胞核平面的照片 (ToPro-3 ×630) 8A:當顯微鏡的焦距對準在毛細胞的細胞核平面時，可見毛細胞的細胞核和細胞之間的間隙都比較大; 8B:當顯微鏡的焦距對準在毛細胞下方支持細胞的細胞核平面時，可見支持細胞的細胞核和細胞之間的間隙都很小。說明毛細胞的細胞密度顯著低于支持細胞的細胞密度 圖9 6種實驗動物的壺腹嵴鋪片 (蘇木素 ×100) 9A：小鼠；9B：大鼠；9C：豚鼠；9D：南美栗鼠；9E：羊；9F：猴

測量球囊斑和橢圓囊斑局部小視野中的毛細胞密度，除了應該對微紋區(qū)和周邊區(qū)的毛細胞密度區(qū)分計數(shù)之外，根據(jù)實驗觀察的需要，有時還需要對Ⅰ型毛細胞和Ⅱ型毛細胞進行區(qū)分計數(shù)。例如卡鉑選擇性破壞南美栗鼠的Ⅰ型毛細胞，我們通過對橢圓囊斑鋪片的小視野范圍內(nèi)的Ⅰ型毛細胞和Ⅱ型毛細胞進行區(qū)分計數(shù)，就可以從兩種毛細胞存活密度的改變來證明這個特殊現(xiàn)象。具體數(shù)據(jù)見表2、圖7～9。

表2 6種實驗動物球囊斑和橢圓囊斑及壺腹嵴在光學顯微鏡下前庭小視野毛細胞平均密度的參考數(shù)據(jù) (毛細胞/0.03 mm2，1 000倍，

3 討論

3.1 球囊斑和橢圓囊斑面積測量及毛細胞計數(shù)檢測方法的可靠性問題

Crile于1940年提出了一個計算前庭感覺上皮面積和前庭感覺區(qū)毛細胞數(shù)量與實驗動物體重之間的A=aBWb 的冪函數(shù)計算公式[24]，這個計算公式被沿用至今[25-26]。這個計算公式的意思是每個前庭感覺區(qū)的表面積和毛細胞總數(shù)等于系數(shù)a乘以受試動物的體重再乘以系數(shù)b。對于體重小于4 kg的實驗動物，計算球囊斑和橢圓囊斑的面積及毛細胞總數(shù)的系數(shù)a和系數(shù)b分別是0.045±0.01和0.45±0.03；計算壺腹嵴毛細胞的系數(shù)a和系數(shù)b則分別是0.025±0.013和0.44±0.07。對于體重大于4 kg的實驗動物，體重與球囊斑面積之間冪律關系的斜率為0.45，體重與橢圓囊斑面積之間冪律關系的斜率為 0.44。雖然這個計算公式看上去似乎可以通過簡單測量動物體重得知每個測試動物各個前庭感覺區(qū)的表面積和毛細胞總數(shù)，但是，這種既不測量實際前庭感覺區(qū)面積也不對前庭毛細胞進行實際計數(shù)的體重換算法，其可靠性和合理性及實用性都值得被懷疑。試想一只豚鼠在出生后1個月的體重大約為100 g，到出生后12個月其體重可以增加到800 g左右。那么，在系數(shù)a和b不變但體重增加了8倍的情況下，難道這只豚鼠的前庭感覺區(qū)的表面積和毛細胞總數(shù)也會增加8倍嗎？這顯然是完全不可能的。可以確定的是，成年哺乳類動物內(nèi)耳的感覺毛細胞不會再有增殖，因此，內(nèi)耳毛細胞的數(shù)量絕不可能隨著動物體重的增加而變得更多。假設這個體重換算公式真能換算出前庭各個感覺區(qū)的表面積和毛細胞的總數(shù)，那么如果毛細胞被耳毒性藥物永久破壞之后，難道體重也會發(fā)生改變嗎？我們認為前庭毛細胞的數(shù)量和動物體重之間沒有任何必然的聯(lián)系。僅憑稱量動物體重來推算前庭各個感覺區(qū)表面積和毛細胞總數(shù)的算法，對前庭毛細胞的定量病理學評估毫無價值。

3.2 毛細胞計數(shù)檢測方法的可靠性問題

我們把從每個囊斑上記錄到的實際毛細胞總數(shù)與早先的論文報導做了相互比較，除了那些通過體重換算得到的囊斑毛細胞總數(shù)結果不具備可比性之外，一些發(fā)表文章報道的毛細胞總數(shù)與我們的毛細胞計數(shù)結果有一定的出入。例如，Lindeman在20世紀60年代應用相差顯微鏡對戊二醛四氧化鋨雙重固定的豚鼠球囊斑和橢圓囊斑毛細胞的實際計數(shù)結果與我們所得結果就存在著顯著差異[27]。雖然四氧化鋨可以染色脂肪小滴和髓鞘，但是由于前庭毛細胞既不含有脂肪小滴也不含有髓鞘，因此，Lindeman實際上觀察的是未經(jīng)染色的前庭囊斑鋪片。我們的計數(shù)結果顯示豚鼠球囊斑和橢圓囊斑的毛細胞總數(shù)分別為(4 882.2±208.7)個和(4 925.3±271.1)個，可是Lindeman記錄到的豚鼠球囊斑和橢圓囊斑的毛細胞總數(shù)卻分別為7 500(6 018～7 983)個和9 000(7 118～10 760)個。 為什么同樣是在顯微鏡下對毛細胞進行實際計數(shù)卻會出現(xiàn)如此大的總數(shù)差異？ 我們在共聚焦顯微鏡下對同一區(qū)域的毛細胞層和支持細胞層中的細胞數(shù)量分別進行了計數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)由于毛細胞細胞核的大小顯著大于支持細胞的細胞核，因而同一區(qū)域的毛細胞數(shù)量遠遠少于同一區(qū)域支持細胞的數(shù)量。我們在一個放大630倍的顯微鏡下的毛細胞細胞核的聚焦平面，在視野中可以識別約有130個毛細胞的細胞核，但是在這個相同視野毛細胞層下方的支持細胞的細胞核的聚焦平面，支持細胞的數(shù)量卻幾乎超過毛細胞一倍(圖8)。由此我們推測，Lindeman是否在對未經(jīng)染色的囊斑鋪片進行觀察時，不得不通過辨別細胞間相互連接的折光明暗來勉強識別每一個細胞間的輪廓。在這種情況下，隨著顯微鏡焦距的上下移動，支持細胞或許有可能與毛細胞相互混淆而都被當作毛細胞被計數(shù)。我們得到的熒光染色的毛細胞計數(shù)結果則完全是來自染色清晰的完整的囊斑鋪片樣品，所有的圖像資料都是在共聚焦顯微鏡區(qū)清晰區(qū)分出囊斑鋪片的毛細胞層面，因此我們不可能將支持細胞誤認作是毛細胞。為了確保我們的毛細胞計數(shù)結果不與支持細胞相混淆，我們在實驗中還專門用硝酸銀對豚鼠球囊斑和橢圓囊斑的表面實施了金屬沉淀法的鍍銀染色[8,28]，經(jīng)鍍銀染色后，在光學顯微鏡下可以清晰分辨囊斑表面呈圓形的毛細胞表皮板輪廓，而不可能將支持細胞的不規(guī)則形表皮板誤認為是毛細胞的表皮板(圖4C)。囊斑表面鍍上的這一層金屬膜使細胞不再透明，因而不僅不能看到毛細胞的細胞核而且也不能看到毛細胞層下方的支持細胞層面。由此可見，前庭感覺區(qū)上皮的表面鍍銀染色也為我們提供了一種可靠的鑒別毛細胞的方法。誠然，如果應用Myosin VI等抗體對毛細胞施行特異性染色標記后再對標記的毛細胞進行計數(shù)，相信結果一定會更有說服力。但是，根據(jù)毛細胞與支持細胞大小形態(tài)的顯著差異和毛細胞圓形表皮板的典型特征，無論是對共聚焦顯微鏡下獲得的單層毛細胞圖像實施對毛細胞的計數(shù)，還是在光學顯微鏡下對表面鍍銀的毛細胞表皮板進行計數(shù)，我們都可以做到準確無誤。因此，我們相信我們獲得的前庭毛細胞定量觀察結果是可靠的。

3.3 在壺腹嵴鋪片上展現(xiàn)壺腹嵴上所有毛細胞的可能性問題

由于壺腹嵴在壺腹腔內(nèi)呈一個橫位小峰樣隆起而高低不平[18,29-31]，因而從壺腹嵴鋪片的觀察平面只能看到壺腹嵴面對物鏡的感覺上皮，如果壺腹嵴鋪片呈側位，則不可能看到壺腹嵴背側區(qū)域的毛細胞；如果壺腹嵴鋪片的嵴頂部朝上，則不可能看到壺腹嵴雙側與觀察視線平行區(qū)域的毛細胞(圖9)。由此可見，要想從壺腹嵴鋪片的一個平面上獲取整個壺腹嵴多個不同平米上所有毛細胞的計數(shù)結果，從技術上來說存在著難以克服的困難。盡管有人主張應用酶分離方法嘗試將壺腹嵴的上皮層從壺腹嵴上剝離下來再制作成平整的鋪片[25]，但是由于剝離壺腹嵴上皮細胞層的制作難度較大而并未得到多數(shù)人的認可和贊同。然而，從前庭小視野局部區(qū)域的毛細胞計數(shù)結果得到前庭毛細胞在壺腹嵴上的平均密度，或許比嘗試從凹凸不平相互遮擋的壺腹嵴鋪片上找到每一個毛細胞更能有效解決壺腹嵴毛細胞的定量觀察問題[6,8,12,20,23,28,32]。