胡國霞 李津杞 李津嬰 查占山 屠曉華 錢寶華 楊江存

丙酮酸激酶缺乏癥（pyruvate kinase deficiency，PKD）是糖酵解途徑中最常見的常染色體隱性遺傳酶缺陷引起的先天性溶血性貧血。丙酮酸激酶缺乏的紅細(xì)胞，變形能力降低容易發(fā)生溶血[1-2]。PKD病情嚴(yán)重程度差異很大，從胎兒水腫伴宮內(nèi)死亡到偶然發(fā)生的無癥狀完全代償性溶血，再到出生到老年的嚴(yán)重輸血依賴性貧血甚至危及生命[3]。1961年，VALENTINE首次將PKD描述為遺傳性溶血性貧血的病因[4]。BEUTLER對白種人PKD的患病率估計(jì)1/20 000～1/300 000，變化范圍較大，這可能是因?yàn)镻KD確診困難且真正患病率尚不清楚[2，5]。PKD診斷標(biāo)準(zhǔn)的組成主要是臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷。到目前為止，PKD缺少提示本病的特征性臨床診斷線索。實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠PK活性或基因檢測。然而，很多因素影響PK活性檢測，如標(biāo)本儲存條件、白細(xì)胞和血小板污染、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)增高、近期輸血、患者的年齡、無癥狀雜合子攜帶者、PK特殊變異型等影響及PK活性質(zhì)量控制試劑沒有商業(yè)來源等；另外，基因檢測也不能完全確診PKD[6-7]。因此，為了減少PKD漏診和誤診，本文通過研究40例PKD患者相關(guān)指標(biāo)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以期找出對PKD有診斷價值的參考數(shù)據(jù)。

資料與方法

1 研究對象及診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1 研究對象：收集自2015年1月～2022年1月在本院做紅細(xì)胞相關(guān)酶檢測的812例門診或住院患者，其中PK活性降低的有164例，家系驗(yàn)證確診PKD有23例，基因驗(yàn)證確診PKD有17例，最終確診40例PKD作為患病組，并將32例健康體檢者作為正常對照組。所有被檢者檢測血常規(guī)、網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.2 PKD診斷標(biāo)準(zhǔn)：診斷標(biāo)準(zhǔn)包括臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷。診斷金標(biāo)準(zhǔn)為特異底物條件下的酶催化活力測定。PK活力測值下降并符合臨床診斷2項(xiàng)以上可診斷為PKD；臨床診斷低于2項(xiàng)、實(shí)驗(yàn)室診斷特異性指標(biāo)異常且通過家系驗(yàn)證后可確診PKD；高度懷疑的疑難病例，溶血全套排查試驗(yàn)仍不能確診，基因檢測出有明確致病性的PKLR基因突變可確診PKD[8]。

1.3 儀器及試劑： Wright's-Giemsa染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）、光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，Ch20BIBF200）、離心機(jī)（Thermo,ST-40R）、紫外可見分光光度計(jì)（756-UV，上海三分廠生產(chǎn)）、恒溫循環(huán)水槽（DC-0530，寧波新芝科技公司）。儀器按照說明書操作。酶試劑按照《溶血性疾病》相關(guān)要求配制[9]。

2 研究方法

2.1 病史采集：收集患者及父母既往病史和現(xiàn)病史資料。疑難病例標(biāo)本送基因檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行紅系相關(guān)疾病panel分析并對家系行Sanger驗(yàn)證。病歷系統(tǒng)資料顯示18例PKD患者PKLR基因有突變，系統(tǒng)登記了12例患者PKLR基因突變類型，發(fā)現(xiàn)12例PKD患者的PKLR基因有9個位點(diǎn)突變及3個小片段缺失，部分患者基因檢測資料未知。

家系（指患者父母）PK活性低下的有41例，其中患者父親PK活性低下有23例，比例56%；患者母親PK活性低下有18個，比例44%；患者父母親PK活性都低下有16例，比例39%。所有家系中位年齡30歲（19～50歲），PK活性為：（9.5±3.1）U?g-1?Hb-1，G6PD活性為:（10.7±1.7）U?g-1?Hb-1。

2.2 外周血形態(tài)鏡檢：新鮮靜脈血制作血涂片Wright's-Giemsa染色后，鏡檢形態(tài)異常紅細(xì)胞。2015年ICSH（International Committee for Standardization in Haematology）指南指出，正常紅細(xì)胞平均直徑為7.5 μm，呈圓形或略橢圓形，中央淡染區(qū)約占整個細(xì)胞體積的三分之一，并建議評估至少1 000個紅細(xì)胞，以提供具有特定形態(tài)異常細(xì)胞的精確百分比[10]。紅細(xì)胞鏡檢內(nèi)容主要是檢查細(xì)胞大小、體積、染色及是否有異常細(xì)胞。紅細(xì)胞形態(tài)異常包括：紅細(xì)胞大小異常、體積異常、染色異常及有異常細(xì)胞?？稍赑KD患者外周血鏡檢時發(fā)現(xiàn)棘球紅細(xì)胞，又稱毛刺細(xì)胞，其形態(tài)特征呈非圓盤狀，細(xì)胞表面覆蓋著10～30個短而鈍的突起或針狀物。ICSH建議對外周血的棘球紅細(xì)胞分級，棘球紅細(xì)胞＜5%為1級，5%～20%為2級，＞20%為3級。各個分級分別代表棘球紅細(xì)胞的增多程度：1級代表少見/罕見、2級代表中度多見、3級代表顯著多見[11]。

2.3 酶活性檢測：采集肝素抗凝靜脈血5 mL，根據(jù)《溶血性疾病》中相關(guān)要求和ICSH推薦方法進(jìn)行酶活性檢測并計(jì)算本實(shí)驗(yàn)室酶活性參考范圍[9,12-13]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26統(tǒng)計(jì)軟件分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率表示；計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)估計(jì)PK與PK/G6PD比值之間的相關(guān)性，并使用受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析PK/G6PD比值對PKD的診斷準(zhǔn)確度；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PKD患病組臨床資料和溶血相關(guān)性指標(biāo)及紅細(xì)胞形態(tài)特征 40例PKD患者包括來自不同家族和同一家族,男女比例1.1∶1。年齡≥18歲的成年患者26例，兒童患者5例，3歲以下嬰幼兒患者9例。患者是否黃疸、脾大、膽結(jié)石、貧血、輸血及切脾，見表1。PKD患者的紅細(xì)胞形態(tài)特征通常不顯著，表現(xiàn)出一定程度的異常細(xì)胞。本次報道中38例紅細(xì)胞形態(tài)異常PKD患者中，20例有棘球紅細(xì)胞，1級棘球紅細(xì)胞PKD患者有9例，比例45%，2級棘球紅細(xì)胞PKD患者有9例，比例45%，3級棘球紅細(xì)胞PKD患者有2例，比例10%。其中在3級棘球紅細(xì)胞PKD患者中，有1例PKD患者進(jìn)行了脾切除手術(shù)，脾切除術(shù)前的棘球紅細(xì)胞表現(xiàn)輕微；而脾切除術(shù)后，細(xì)胞深染更為突出、特征性棘球紅細(xì)胞更明顯，見圖1。

表1 PKD患病組臨床資料及紅細(xì)胞形態(tài)

2 PKD患病組與正常對照組PK/G6PD比值和各血象指標(biāo)的比較 與正常對照組相比較，PKD患病組的PK/G6PD比值（P＜0.01）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（P=0.03）、網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（P=0.01）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞分布寬度、血小板計(jì)數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。另外，PK/G6PD比值與PK的Pearson相關(guān)系數(shù)是0.913（P＜0.01）。以PKD患者為因變量，以PK活性、PK/G6PD比值為自變量進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示PK活性的曲線下面積（AUC）是0.978（95%CI：0.950～1.005），PK/G6PD的AUC是0.972（95%CI：0.941～1.002），見圖2。散點(diǎn)圖直觀顯示兩組之間的差異，見圖3。說明PK/G6PD比值診斷PKD的準(zhǔn)確度與PK活性相當(dāng)。

圖2 PK活性、 PK/G6PD比值診斷PKD的ROC曲線

圖3 PKD患病組與正常對照組PK活性、PK/G6PD比值散點(diǎn)圖

表2 正常對照組與PKD患病組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

圖1A 脾切除術(shù)前PKD患者棘球紅細(xì)胞（×1 000倍）

圖1B 脾切除術(shù)后PKD患者棘球紅細(xì)胞（×1 000倍）

3 家系雜合子組與非家系雜合子組PK/G6PD比值、Ret結(jié)果比較 40例PKD患者中有28例進(jìn)行了基因檢測，PKLR基因突變有18例，包括：家系雜合子有9例，非家系雜合子有7例，純合突變1例，突變意義未明1例。9例家系雜合子患者作為家系雜合子組，7例非家系雜合子患者作為非家系雜合子組。與非家系雜合子組相比較，家系雜合子組的PK/G6PD比值、Ret差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而PK活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.12），見表3。

表3 家系雜合子組與非家系雜合子組的PK活性、PK/G6PD、Ret比較

討 論

本次報道的40例PKD患者65%是成年人，比宋琳、李園等報告的近50%要高，可能是由于我們收集到的大部分病例都是外院未確診的疑難患者，輕癥疑難患者一般無癥狀，所以導(dǎo)致就診年齡偏大；另一方面也說明年齡越大的PKD患者耐受程度更高[14]。因?yàn)?,3-二磷酸甘油酯（2,3-DPG）使氧解離曲線右移，PKD患者PK酶反應(yīng)上游積累了2,3-DPG，所以盡管貧血，組織的氧送仍有改善，或者Ret增高導(dǎo)致造血代償，使得患者通常有較好的輸血閾值。因此，PKD患者臨床表現(xiàn)異質(zhì)性較大，但如遇急性感染、藥物和懷孕等會加劇溶血，詳細(xì)詢問病史有助于診斷[15-17]。

對制作、染色良好的血涂片鏡檢，是診斷紅細(xì)胞溶血性疾病的重要組成部分，也是識別紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)異常的基本方法。我們觀察到的20例PKD患者的棘球紅細(xì)胞比正常紅細(xì)胞小，邊界不規(guī)則，缺乏中央淡染區(qū)，僅有50%PKD患者外周血鏡檢中發(fā)現(xiàn)了棘球紅細(xì)胞，說明PKD的紅細(xì)胞形態(tài)通常不顯著。在PKD患者中可以觀察到不同比例（3%～30%）的棘球紅細(xì)胞，尤其是脾切除術(shù)后[2]。棘球紅細(xì)胞代表脫水的、耗盡ATP（三磷酸腺苷）的紅細(xì)胞；ATP水平迅速下降，紅細(xì)胞失去鉀和水變得干燥、粘稠、有毛刺，在脾臟中被破壞[18]。雖然棘球紅細(xì)胞是PKD的非特異性特征，但是在脾切除術(shù)后尤其明顯，所以棘球紅細(xì)胞在診斷PKD時可以起到一定的提示作用[2]。

PKLR基因檢測適合新生兒或胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷、雜合子攜帶者及輸血后的檢測等。然而，這種技術(shù)的缺點(diǎn)是所發(fā)現(xiàn)的突變中約有20%尚未歸類為致病突變；另外，高達(dá)10%的患者有常規(guī)外顯子測序未檢測到的變異體，有一部分PKD患者在PKLR的非編碼區(qū)存在隱性突變，這些突變在基因測試中被遺漏；現(xiàn)有的檢測工具無法解釋內(nèi)含子或基因調(diào)控區(qū)變體的臨床意義而且分子檢測成本高昂、耗時、費(fèi)力[15，19-20]。鑒于目前PKD診斷的局限性和疾病的廣泛表型特征，需要更敏感的生物標(biāo)志物。對于PKLR突變意義未明的患者，必須進(jìn)行PK活性測定。因此，篩選一種方便、快捷、廉價、敏感的PKD的檢出方法顯得尤為重要。通過分光光度法測定紅細(xì)胞裂解物中PK活性，速度相對較快，只需2～3小時的實(shí)驗(yàn)室工作就可以完成測試，而且價格低廉。

已有研究報道PK與己糖激酶（hexokinase, HK）比值可以診斷PKD，有極好的敏感性，比PK活性更敏感，甚至比PKLR外顯子序列更敏感地診斷PKD，可校正PK酶活性假陰性患者的測定結(jié)果,PK與紅細(xì)胞年齡依賴性酶活性比值可被視為PKD診斷評估的標(biāo)準(zhǔn)組成部分，從而減少PK活性假陰性的影響因素[19]。PK、G6PD、HK的活性與紅細(xì)胞年齡有關(guān)，如果PK活性正常或低下，但另一個紅細(xì)胞年齡依賴性酶活性增加，且PK和此酶的活性比值降低，則提示PK缺乏[1，21]。相比較HK，一般常規(guī)實(shí)驗(yàn)室測定G6PD活性更常見，故我們選擇PK和G6PD的活性測定，PK/G6PD活性比值明顯降低應(yīng)高度懷疑是PKD。本研究中40例PKD患者中有38例PK活性低，5例G6PD活性高，37例PK/G6PD比值低，對PKD的診斷敏感性為93%；且家系雜合子PK/G6PD比值更低，與非家系雜合子相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在高網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的情況下，任何缺陷酶都可能表現(xiàn)出正常或增加的酶活性[19]。而家系雜合子患者的網(wǎng)織紅細(xì)胞升高不明顯，PK/G6PD比值更能反映患者的真實(shí)狀態(tài)。

總之，本研究提示PK/G6PD比值與PK活性具有同等的診斷價值，尤其適用于網(wǎng)織紅細(xì)胞增高、依賴輸血的患者。在常規(guī)PK活性篩查中，同時測定PK和G6PD活性可以提高PKD診斷率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突