李楠鑫，陳 洋，陳詩(shī)奇，張繼甫，彭一丁，鐘佳男，張 偉，符華林*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸藥創(chuàng)新制劑工程技術(shù)研究中心，成都 611130；2.成都科宏達(dá)科技有限公司，四川 新津 611400）

近年來(lái)，消毒已成為預(yù)防各種畜禽傳染病的重要措施，也是當(dāng)前維護(hù)公共環(huán)境安全的重要方法。對(duì)畜禽場(chǎng)舍進(jìn)行霧化消毒可以同時(shí)兼顧抗菌消毒及維護(hù)動(dòng)物機(jī)體健康的雙重目標(biāo)，是規(guī)模養(yǎng)殖中常用的消毒方法之一[1]。煙霧機(jī)是利用燃燒產(chǎn)生的高溫氣體的熱能和高速氣體的動(dòng)能，使消毒液受熱而迅速煙化揮發(fā)呈煙霧狀，霧滴粒徑在10μm以內(nèi)[2]，相對(duì)普通霧化消毒，煙霧消毒液霧滴更小，消毒效果更為徹底。煙霧消毒以消毒劑和煙霧助劑為藥液，通過(guò)發(fā)煙機(jī)進(jìn)行發(fā)煙，煙霧在空氣中可長(zhǎng)時(shí)間懸浮，可有效殺滅空氣中浮游的有害病菌，切斷病原菌傳播途徑。煙霧消毒已廣泛應(yīng)用于城市環(huán)衛(wèi)、畜牧養(yǎng)殖業(yè)、垃圾污水處理場(chǎng)、大面積疾控防疫及公共場(chǎng)所消毒滅菌等領(lǐng)域[3]。但是消毒劑使用時(shí)是否會(huì)因煙霧化而對(duì)動(dòng)物或者人體產(chǎn)生毒性影響也值得養(yǎng)殖場(chǎng)關(guān)注。

苯扎氯銨及癸甲溴銨是兩種常見(jiàn)的陽(yáng)離子表面活性劑，可以有效殺滅大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等養(yǎng)殖場(chǎng)常見(jiàn)細(xì)菌[4-6]。苯扎氯銨消毒劑屬于低效消毒劑，被廣泛應(yīng)用于復(fù)方消毒劑、健康護(hù)理液（滴眼液、滴鼻液等）及化妝品中[7]。癸甲溴銨廣泛應(yīng)用于各種養(yǎng)殖場(chǎng)、寵物診所的舍內(nèi)環(huán)境、飲水、各種設(shè)備及器具、車輛及工作人員的消毒。目前暫無(wú)將苯扎氯銨及癸甲溴銨用于煙霧消毒的報(bào)道，為了科學(xué)評(píng)價(jià)煙霧消毒可能帶來(lái)的對(duì)動(dòng)物安全性的影響，本試驗(yàn)通過(guò)考察苯扎氯銨及癸甲溴銨煙霧消毒對(duì)試驗(yàn)大鼠呼吸道及全身安全性的影響，為苯扎氯銨及癸甲溴銨用于煙霧消毒提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

苯扎氯銨溶液、癸甲溴銨溶液、煙霧助劑（成都科宏達(dá)科技有限公司），生理鹽水，水合氯醛及4%多聚甲醛（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

BCA蛋白定量試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、白蛋白（ALB）測(cè)定試劑盒、肌酐（Cr）測(cè)定試劑盒、尿素氮（BUN）測(cè)試盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶/ALT/GPT）測(cè)試盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷草轉(zhuǎn)氨酶/AST/GOT）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

煙霧消毒機(jī)（成都科宏達(dá)科技有限公司），SZM-45B1顯微鏡（舜宇光學(xué)科技有限公司），TGL-16G離心機(jī)（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）、FC酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技），RM2235石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica），DM1000徠卡顯微成像系統(tǒng)（德國(guó)Leica）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～7周齡健康SPF級(jí)SD大鼠40只，雌雄各半，體重180～220 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南》(Council,2010)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（60±10）%，常規(guī)飼料喂養(yǎng)（每天5～8 g/100 g體重）并自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將40只大鼠于試驗(yàn)前分別稱重并記錄，然后隨機(jī)分成4組，每組10只，具體分組設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)分組Table 1 Experimental grouping

1.4.2 動(dòng)物處理

在1 000 L可密閉透明有機(jī)玻璃柜，放入試驗(yàn)大鼠10只。啟動(dòng)煙霧機(jī)按照表1分組對(duì)相應(yīng)藥液進(jìn)行發(fā)煙，待發(fā)煙機(jī)工作穩(wěn)定，向密閉有機(jī)玻璃柜噴煙2 min相應(yīng)藥液，并保持霧化狀態(tài)30 min。隨后打開玻璃柜通風(fēng)并移出大鼠于常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境；各組每天按照前述煙霧化方式處理1次，連續(xù)進(jìn)行14 d。試驗(yàn)期間，試驗(yàn)鼠可以自由采食、飲水。

1.4.3 試驗(yàn)觀察

每天觀察記錄各組試驗(yàn)鼠的死亡情況、采食情況、飲水情況和每次通過(guò)噴煙前后試驗(yàn)鼠的形態(tài)及行為變化。描述并記錄試驗(yàn)鼠的精神情況、毛色情況、二便情況、眼部情況、鼻口分泌物情況和其他行為狀況，測(cè)定記錄試驗(yàn)鼠呼吸頻率。

1.4.4 生理生化指標(biāo)測(cè)定

當(dāng)試驗(yàn)進(jìn)行至第14天時(shí)，稱量各組體重，禁食16 h，分別通過(guò)眼眶后叢靜脈與心臟采1.5 mL抗凝血與5 mL不抗凝血?？鼓糜跍y(cè)定血紅蛋白（Hb）、紅細(xì)胞壓積（HCT），紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）、血小板（PLT）計(jì)數(shù)與白細(xì)胞分類；非抗凝血分離血清用于測(cè)定總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），具體操作按試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行。

1.4.5 肺洗滌液指標(biāo)測(cè)定

采血結(jié)束后，脫頸椎處死大鼠，打開胸腔結(jié)扎左側(cè)肺門。分離出頸部氣管，在氣管下端開小口，將粗針頭插入氣管并用細(xì)線扎緊，緩慢注入2.5 mL 0.9%氯化鈉溶液，可見(jiàn)試驗(yàn)鼠右肺逐漸膨大，變白，停留10 s后，將灌洗液緩慢抽回，記錄抽回體積，再重復(fù)一次以上操作，合并兩次的灌洗液，置于5 mL EP管中。將灌洗液在4℃離心（1 500 r/min）15 min，測(cè)定上清液中蛋白含量及乳酸脫氫酶活性，具體操作按試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行。

1.4.6 病理切片及觀察

試驗(yàn)大鼠解剖并稱量肝、腎、心、肺（包括進(jìn)行肺部灌洗后的右肺）、睪丸（卵巢）濕重，計(jì)算臟/腦比值，采集腦、心、肺（只取未進(jìn)行肺部灌洗的左肺）、肝、腎、睪丸（卵巢）制作病理切片，檢查有無(wú)病理改變。檢測(cè)方法步驟如下：

包埋：4%多聚甲醛固定的組織樣本，經(jīng)流水沖洗30 min，進(jìn)行組織修塊，放入病理包埋塑料筐中進(jìn)行脫水（75%乙醇6 h，85%乙醇10 h，95%乙醇4 h，無(wú)水乙醇Ⅰ2 h，無(wú)水乙醇Ⅱ2 h），透明（二甲苯Ⅰ20 min，二甲苯Ⅱ15 min），浸蠟3 h，最后包埋組織塊于石蠟中。

切片：采用Leica RM2235切片機(jī)將組織切成5μm厚的薄片，在溫水中將組織展平后撈在載玻片上，60℃烘烤切片至少2 h。

染色：切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，流水洗滌20 min，用蘇木素染色8 min，流水洗滌5 min，鹽酸酒精分化，伊紅染色3 min，最后梯度酒精脫水，二甲苯透明后用樹脂膠封片。

顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化，對(duì)正常組織或有明顯病變部位均采用顯微成像系統(tǒng)拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠行為觀察結(jié)果

各組大鼠經(jīng)煙霧消毒后精神狀況良好，行為活躍。試驗(yàn)前后大鼠二便正常，鼠籠墊料基本保持正常干燥。試驗(yàn)前后眼部基本無(wú)變化，無(wú)明顯分泌物。試驗(yàn)第2天，癸甲溴銨組大鼠煙霧消毒后開始出現(xiàn)鼻黏膜輕度出血；第3～4天，除去離子水組外，其余組都開始出現(xiàn)鼻黏膜輕度出血，嚴(yán)重程度由高到低依次為Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ>Ⅳ，各組大鼠鼻黏膜輕度出血后2 h內(nèi)基本恢復(fù)正常。

2.2 大鼠體重增長(zhǎng)、飲水量及臟器指數(shù)變化

各組大鼠經(jīng)煙霧消毒后體重增長(zhǎng)、日均飲水量如圖1、2所示。各臟器指數(shù)變化結(jié)果如圖3所示。各試驗(yàn)組大鼠與空白組相比14 d內(nèi)體重增長(zhǎng)及飲水量變化無(wú)顯著性差異（P>0.05）。各試驗(yàn)組大鼠的臟/腦比與空白組相比均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。表明苯扎氯銨和癸甲溴銨經(jīng)煙霧消毒后對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能沒(méi)有影響。

圖1 大鼠14 d體重增長(zhǎng)變化Figure 1 Ponderal growth of rats for 14 days

圖2 大鼠14 d日均飲水量Figure 2 Daily water intake of rats for 14 days

圖3 各試驗(yàn)組大鼠的臟/腦比Figure 3 Dirty/brain ratio of rats in each experimental group

2.3 血液生化指標(biāo)結(jié)果

各組大鼠經(jīng)煙霧消毒后測(cè)得的血液生化指標(biāo)結(jié)果如圖4所示，各試驗(yàn)組大鼠與空白組相比，血清總蛋白含量、白蛋白含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量、肌酐含量、尿素氮含量均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。表明苯扎氯銨及癸甲溴銨煙霧消毒對(duì)動(dòng)物生化指標(biāo)沒(méi)有顯著影響。

圖4 各組大鼠血液生化結(jié)果Figure 4 Blood biochemical results of rats in each group

2.4 血常規(guī)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

各組大鼠經(jīng)煙霧消毒后測(cè)得的血常規(guī)指標(biāo)具體結(jié)果如圖5所示，各試驗(yàn)組大鼠與空白組相比，血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞數(shù)目、白蛋白數(shù)目、血小板數(shù)目、淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比都不具有顯著性差異（P>0.05）。

圖5 各組大鼠血常規(guī)指標(biāo)結(jié)果Figure 5 Results of blood routine indexes of rats in each group

2.5 肺洗滌液指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

各組大鼠經(jīng)煙霧消毒后測(cè)得肺洗滌液中蛋白質(zhì)、LDH的測(cè)定結(jié)果如圖6所示，與空白組相比，各組大鼠的肺洗滌液中總蛋白濃度和LDH值沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。說(shuō)明苯扎氯銨及癸甲溴銨經(jīng)煙霧化后對(duì)動(dòng)物呼吸道黏膜沒(méi)有明顯影響。

圖6 肺洗滌液指標(biāo)結(jié)果Figure 6 Index results of pulmonary washing fluid

2.6 病理切片結(jié)果

各組大鼠經(jīng)煙霧消毒后各臟器切片見(jiàn)圖7。心：各組心臟組織結(jié)構(gòu)均未見(jiàn)異常，各心室壁及室間隔壁結(jié)構(gòu)無(wú)明顯病變，心肌胞漿紅染，排列規(guī)律，胞核呈泡狀或卵圓形，均無(wú)明顯病理變化。肝：各組肝臟組織結(jié)構(gòu)均未見(jiàn)異常，肝小葉明顯，肝索清晰，肝竇內(nèi)含少量紅細(xì)胞。僅癸甲溴銨組部分肝臟見(jiàn)輕度空泡變性（2/6）（圖8），這可能跟各組大鼠個(gè)體差異有關(guān)，其余組別肝臟細(xì)胞均無(wú)明顯病理變化。脾：各組脾臟組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常，白髓區(qū)可見(jiàn)明顯淋巴小結(jié)和動(dòng)脈周圍淋巴鞘，淋巴細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量未見(jiàn)明顯異常；紅髓區(qū)脾索和脾竇形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，脾竇中紅細(xì)胞豐富，淋巴細(xì)胞無(wú)明顯病理變化。肺：各組肺組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常，各級(jí)支氣管未見(jiàn)明顯異常。肺泡腔因灌注壓力不均輕微擴(kuò)張不均，肺泡壁血管及細(xì)胞成分均無(wú)明顯病理變化。腎：皮質(zhì)區(qū)腎小球數(shù)量及形態(tài)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常，皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)腎小管管腔結(jié)構(gòu)正常，上皮細(xì)胞完整，刷狀緣明顯，未見(jiàn)明顯病理變化。總體表明苯扎氯銨及癸甲溴銨煙霧消毒對(duì)大鼠臟器未有顯著影響。

圖7 大鼠臟器切片圖Figure 7 Section of rat viscera

圖8 癸甲溴銨組肝臟輕度空泡變性Figure 8 Mild hepatic vacuolar degeneration in deciquam solution group

3 討論

3.1 煙霧消毒對(duì)大鼠行為的影響

煙霧消毒后各組大鼠行為基本無(wú)異常，除去離子水組外，其余組大鼠噴煙第3～4天后表現(xiàn)出輕微鼻腔出血癥狀，但2 h內(nèi)基本恢復(fù)，說(shuō)明煙霧消毒劑或煙霧助劑對(duì)大鼠鼻腔黏膜有輕微刺激性。

3.2 煙霧消毒對(duì)大鼠體重增長(zhǎng)、飲水量及臟器指數(shù)的影響

動(dòng)物的體重主要與發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)關(guān)系較大，生長(zhǎng)過(guò)程中主要受營(yíng)養(yǎng)條件及吸收功能所影響。在長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)時(shí)，藥物可能是影響營(yíng)養(yǎng)吸收的重要因素，從而導(dǎo)致其體重增加出現(xiàn)變化。傳統(tǒng)的以臟器重量/體重來(lái)表示的臟器指數(shù)會(huì)有較大的波動(dòng)，而腦重的變化受動(dòng)物整體發(fā)育影響大，藥物影響作用相對(duì)較小個(gè)別藥物除外，所以臟腦比系數(shù)的波動(dòng)主要反映臟器本身的變化，腦的因素其次。這樣計(jì)算的臟腦比系數(shù)就可以直接反映出該臟器的相對(duì)重量變化。其結(jié)果比臟體比系數(shù)更能可靠和準(zhǔn)確地表現(xiàn)出進(jìn)行這項(xiàng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的目的[8]。故本次試驗(yàn)臟器指數(shù)以臟腦比系數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)。各試驗(yàn)組大鼠與空白組大鼠體重增長(zhǎng)及臟器指數(shù)并無(wú)顯著性差異（P>0.05），說(shuō)明苯扎氯銨及癸甲溴銨煙霧消毒并不影響大鼠生長(zhǎng)發(fā)育。

3.3 煙霧消毒對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

血液生化指標(biāo)是指血液中的一些酶和蛋白質(zhì)，這些小分子酶和蛋白質(zhì)在代謝、免疫調(diào)節(jié)、能量傳遞及生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮著十分重要的作用[9]。各試驗(yàn)組大鼠與空白組相比，血清總蛋白含量、白蛋白含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量及谷草轉(zhuǎn)氨酶含量均無(wú)顯著性差異（P>0.05），說(shuō)明苯扎氯銨、癸甲溴銨或煙霧助劑對(duì)大鼠的肝臟無(wú)實(shí)質(zhì)性損傷；各試驗(yàn)組大鼠與空白組相比，肌酐含量無(wú)顯著性差異（P>0.05），說(shuō)明苯扎氯銨、癸甲溴銨或煙霧助劑對(duì)大鼠的腎小球?yàn)V過(guò)功能無(wú)影響；各試驗(yàn)組與空白組相比，血清中尿素氮含量無(wú)顯著性差異（P>0.05），說(shuō)明苯扎氯銨、癸甲溴銨或煙霧助劑對(duì)大鼠的肝、腎臟功能無(wú)影響。

3.4 煙霧消毒對(duì)大鼠血常規(guī)指標(biāo)測(cè)定的影響

血常規(guī)主要對(duì)血液中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板3種細(xì)胞有形成分進(jìn)行測(cè)定和分析[10]。各試驗(yàn)組大鼠與空白組相比，血常規(guī)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果都不具有顯著性差異（P>0.05），說(shuō)明苯扎氯銨、癸甲溴銨或煙霧助劑對(duì)大鼠正常的新陳代謝無(wú)影響，不會(huì)引起炎癥反應(yīng)[11]，對(duì)大鼠的免疫系統(tǒng)及非特異性細(xì)胞免疫功能無(wú)影響。

3.5 煙霧消毒對(duì)大鼠肺洗滌液指標(biāo)測(cè)定的影響

肺洗滌液中蛋白質(zhì)濃度的高低、LDH活性的大小主要與肺部作用機(jī)制和霧滴大小有關(guān)。一定大小的霧滴進(jìn)入肺泡腔后，會(huì)被巨噬細(xì)胞吞噬，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)和趨化因子，使肺泡、毛細(xì)血管屏障的通透性增加，血漿蛋白溢出，導(dǎo)致肺泡灌洗液中蛋白含量增高[12]。乳酸脫氫酶（LDH）是一種糖酵解酶,存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞膜受損或通透性增加時(shí)可漏至細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞外液中LDH的活性增加[13]。LDH活性的高低能反映膜損傷程度[14]。與空白組相比，各組大鼠的肺洗滌液中總蛋白濃度和LDH值沒(méi)有顯著差異（P>0.05），說(shuō)明苯扎氯銨、癸甲溴銨和煙霧助劑在試驗(yàn)周期內(nèi)未造成大鼠肺損傷。

4 結(jié)論

苯扎氯銨及癸甲溴銨煙霧消毒對(duì)大鼠生長(zhǎng)性能、生理生化及呼氣道黏膜分泌并無(wú)影響，僅對(duì)鼻腔黏膜會(huì)產(chǎn)生輕微刺激性，但可很快恢復(fù)。苯扎氯銨及癸甲溴銨用于煙霧消毒對(duì)大鼠呼吸系統(tǒng)的毒力強(qiáng)度及刺激性強(qiáng)度并不強(qiáng)，苯扎氯銨煙霧消毒安全性更佳，但仍需進(jìn)一步研究及改善。